Vorbereitung des Neugeborenen Ratsprofels für die ultrastrukturelle Morphometrische Analyse der Verbreitung synaptischer Bläschen an Nerven-Terminals

Zusammenfassung

Wir beschreiben Verfahren zur Verarbeitung von Neugeborenen-Ratten-Hirngewebe, um hochauflösende Elektronenmikrogramme für die morphometrische Analyse der synaptischen Vesikelverteilung an Nerventerminals zu erhalten. Die mit diesen Methoden gewonnenen Mikrographen können auch verwendet werden, um die Morphologie einer Reihe anderer zellulärer Komponenten und deren dimensionale strukturelle Zusammenhänge zu untersuchen.

Zusammenfassung

Unser Labor und viele andere haben die hohe Auflösungskraft der Transmissionselektronenmikroskopie genutzt, um die Morphologie und räumliche Organisation synaptischer Bläschen zu untersuchen. Um qualitativ hochwertige Elektronenmikrographen zu erhalten, die den für die quantitative Analyse der präsynaptischen Vesikelverteilung notwendigen morphologischen Grad ergeben können, ist eine optimale Probenvorbereitung entscheidend. Die chemische Fixierung ist der erste Schritt im Prozess der Probenvorbereitung und von größter Bedeutung für die Erhaltung der feinen Ultrastruktur. Gefäßfixierung mit einer Glutaraldehyd-Formaldehyd-Lösung, gefolgt von der Behandlung von vibratom-setionierten Proben mit Osmium-Tetroxid, stabilisiert die maximale Anzahl von Molekülen, insbesondere Proteinen und Lipiden, und führt zu einer überlegenen Konservierung Der Ultrastruktur. Die Gewebe werden dann mit Gegenfärbung, sequenzieller Dehydrierung und Harzeinbettung verarbeitet. En bloc Färbung mit Uranyl-Acetat (d.h. Färbung von Vibratom-seztem Gewebe vor der Harzeinbettung) verbessert den endogenen Kontrast und stabilisiert Zellkomponenten gegen die Extraktion während der Probenverarbeitung. Der Kontrast kann durch den Einsatz von Uranyl-Acetat als Post-Fleck auf ultradünnen Abschnitten noch verstärkt werden. Die Doppelfärbung von ultradünnen Abschnitten mit Bleicitrat nach der Urangel-Acetat-Behandlung verbessert auch die Bildauflösung, indem die Elektronenundurchlässigkeit der nukleinsäurehaltigen Strukturen durch selektive Bindung von Blei zu Uranyl-Acetat verstärkt wird. Die Transmissionselektronenmikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Charakterisierung der morphologischen Details synaptischer Bläschen und zur Quantifizierung ihrer Größe und räumlichen Organisation im Terminal Bouton. Da sie jedoch festes Gewebe verwendet, kann die Transmissionselektronenmikroskopie nur indirekte Informationen über lebendige oder sich entwickelnde Prozesse liefern. Daher sollten andere Techniken in Betracht gezogen werden, wenn das Hauptziel darin besteht, dynamische oder funktionale Aspekte des synaptischen Vesikelhandels und der Exozytose zu untersuchen.

Einleitung

Wir beschreiben Methoden zur Herstellung von Neugeborenen-Ratten-Hirngewebe, um hochwertige Elektronenmikrogramme für eine vertiefte morphometrische Analyse der synaptischen Vesikelverteilung an Nerventerminals 1^,2zu erhalten. Die kontrastreichen Mikrographen, die durch die Verarbeitung von Proben nach diesen Methoden gewonnen werden können, können auch verwendet werden, um die detaillierte Morphologie einer Reihe von zellulären Komponenten^undihre dimensionalen Strukturverhältnisse 3, 4 zu untersuchen.

Das Transmissionselektronenmikroskop (TEM) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Morphologie von Organellen und anderen zellulären Strukturen quantitativ zu untersuchen. Ab diesem Jahrzehnt gibt es keine anderen Untersuchungsmethoden mehr, die ohne Immunmarkierung den gleichen Auflösungsgrad von Lipidmembranen und Organellen ohne Immunmarkierung bieten können, mit Ausnahme der Kryofixierung durch Hochdruck-Einfrieren. Gefriersubstitutionstechniken sind jedoch nicht weit verbreitet und erfordern in der Regel teure Geräte und lange Vorbereitungszeiten.

Um die hohe Auflösungskraft von TEM nutzen zu können, ist die optimale Probenvorbereitung von größter Bedeutung. Die Hauptziele der Probenvorbereitung sind die Erhaltung der Gewebestruktur mit minimaler Veränderung vom Lebenszustand, die Verbesserung des Probenkontralats und die Stabilisierung des Gewebes gegen die Extraktion von Zellkomponenten während der Verarbeitung und Exposition gegenüber dem Elektron. Strahl. Zahlreiche Protokolle zur TEM-Gewebeaufbereitung wurden im Laufe der Jahre von mehreren Labors eingeführt und perfektioniert. Viele von ihnen haben sich auf Methoden zur optimalen Visualisierung von synaptischen Bläschen 5^,6,7^{, 8,}9,¹⁰,^{11konzentriert.} Unter einer Reihe von etablierten, goldenen Standardmethoden, die derzeit im Einsatz sind, wählten wir Verfahren für chemische Fixierung, Nachfixierung, en bloc Färbung, sequentielle Dehydrierung, Harzeinbettung und Post-Färbung, die darauf abzielen, optimale Gewebestruktur zu erhalten und Einen hervorragenden Bildkontrast erzielen. Die Erhaltung der feinen Ultrastruktur kann besonders herausfordernd sein, wenn man mit dem neugeborenen Ratten-Hirngewebe arbeitet. Tatsächlich zeichnet sich das zentrale Nervensystem von sehr jungen Tieren durch einen höheren Wassergehalt aus als das erwachsene Gehirn, eine prominentere Vergrößerung der extrazellulären Räume und lockereVerbindungen zwischen den Zellen 12. Dies macht das neugeborene Ratten-Hirngewebe zutiefst empfindlich gegenüber Veränderungen in der Osmolarität und ist äußerst anfällig für handwerkliche Schrumpfung and/oder Schwellungen, wenn sie durch sequenzielle Lösungen unterschiedlicherTonizität 12 verarbeitet werden. Deshalb haben unsere Methoden Lösungen für die Probenverarbeitung eingesetzt, die so nah wie möglich an die Ratte neugeborenen Gehirns heranreichen. Unser Ziel war es, qualitativ hochwertige, hochauflösende Elektronenmikroskopie-Bilder für die quantitative Beurteilung der synaptischen Vesikelräumung an Nerventerminals zu erhalten. Insbesondere haben wir versucht, die Anzahl der Bläschen innerhalb des Nerventerminals, den Abstand von synaptischen Bläschen von der präsynaptischen Plasmamembran, die Anzahl der Vesikel, die an der vorsynaptischen Membran angedockt sind, die Größe der synaptischen Bläschen und die Intervesikelabstände¹.

Eine befriedigende chemische Fixierung ist eine Voraussetzung für die Erlangung hochwertiger Elektronenmikrographen, die die morphologischen Details liefern können, die für die Untersuchung der synaptischen Bläschen Morphologie und räumliche Organisation notwendig sind. Obwohl es mehrere Arten der Fixierung gibt, ist die Fixierung des Hirngewebes durch Gefäßdurchblutung deutlich überlegen gegenüber anderen Methoden. Da die Fixierung durch Gefäßperfusion unmittelbar nach der Verhaftung der systemischen Zirkulation beginnt, verkürzt sie das Intervall zwischen der Entsaugung des Hirngewebes und der Vernetzung von Proteinen mit Fixierungen, was zu minimalen Veränderungen in der Zelle führt. struktur. Darüber hinaus erreicht es eine schnelle und gleichmäßige Durchdringung, da das Fixierungsmittel schnell vom Gefäßbett in die extrazellulären und zellulären Fächer 12^{, 13,14fließen}. Die primäre Fixierung mit Glutaraldehyd, gefolgt von der sekundären Fixierung (Nachfixierung) mit Osmium-Tetroxid,^führtzu einer hervorragenden Erhaltung der feinen Struktur^{15, 16,17.} Eine Mischung aus Glutaraldehyd und Paraformaldehyd^hatden zusätzlichen Vorteil einer schnelleren Eindringung in das Gewebe 12.

Da biologische Gewebe nicht starr genug sind, um ohne die Unterstützung einer Harzmatrix in dünne Abschnitte geschnitten zu werden, müssen sie vor dünner Abtrennung in ein Medium eingebettet werden. Wasservermischte Epoxidharze werden häufig als Einbettungsmedium in TEM verwendet. Wenn diese Art der Matrix verwendet wird, muss das freie Wasser der Probe vor der Infiltration des Harzes durch ein organisches Lösungsmittel ersetzt werden. Das Wasser wird entfernt, indem das Exemplar durch eine Reihe von Lösungen aufsteigender Konzentrationen von Ethanol und/oder Aceton¹²geleitet wird. In diesem Protokoll werden die Proben zunächst flach zwischen flexiblen Aklarplatten eingebettet und dann in eine Kapsel eingebettet. Das Endergebnis ist das Gewebe, das an der Spitze eines zylindrischen Harzblocks liegt, der die ideale Geometrie hat, um am wenigsten von Vibrationen beeinflusst zu werden, die während der Mikrotome Sektionierung entstehen.

Die Färbung mit Schwermetallen zur Verbesserung des endogenen Gewebekontrakts ist ein weiterer wichtiger Aspekt der Probenvorbereitung. Der Bildkontrast in TEM ist auf die Elektronenstreuung durch die Atome im Gewebe zurückzuführen. Biologische Materialien bestehen jedoch zum großen Teil aus Molekülen mit geringem atomarem Gewicht (z.B. Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff). Die Erzeugung eines ausreichenden Streukontrabens erfordert daher die Aufnahme von hochatomaren Akomen in die zellulären Bestandteile des Gewebes. Dies wird durch die Färbung des Exemplars mit Schwermetallen 12^,18,19erreicht. Osmium-Tetroxid, Uran und Blei, die stark an Lipide binden, sind die häufigsten Schwermetalle, die als Elektronenflecken verwendet werden.

Osmium (Atomzahl 76) ist eines der dichtesten Metalle, die es gibt. Es ist sowohl ein Fixativ als auch ein Fleck, obwohl seine primäre Rolle in TEM als zuverlässiges^Fixativ12 ist. Unter den verschiedenen Fixierungsprotokollen, die verwendet werden, ist die Methode der doppelten Fixierung mit Glutaraldehyd, gefolgt von Osmium, die am effektivsten bei der Reduzierung der Extraktion von Zellbestandteilen während der Probenvorbereitung. Diese beiden Fixate werden verwendet, um die maximale Anzahl der verschiedenen Arten von Molekülen, insbesondere Proteine und Lipide, zu stabilisieren und zu einer überlegenen Erhaltung des Gewebes ultrastruktur^12,14,15 , ^{16 , 17}. August

Uran (Atomzahl 92) ist das schwerste Metall, das als Elektronenfleck verwendet wird, in der Regel in Form von Uranyl-Acetat. Ähnlich wie Osmium wirkt es als Fleck und Fixiermittel, obwohl seine Hauptrolle bei TEM als Fleck 20^{, 21.} Nukleische säurehaltige und Membranstrukturen werden stark und vorzugsweise mit Uranyl-Salzen in AldehydfestenGeweben 22^,23befleckt. Die Behandlung von Geweben mit Uranyl-Acetat nach Osmication und vor Austrocknung führt zu einer Stabilisierung von Membran-und Nukleinsäurehaltigen Strukturen sowie einem verbesserten Kontrast und ermöglicht die Identifizierung einiger struktureller Details, die nicht In Exemplaren, die allein^12,24,25mit Osmium befleckt sind, kann man leicht erkennen. Es wird vermutet, dass Uranyl-Acetat die feine Struktur stabilisieren kann, indem man mit reduziertem Osmium kombiniert wird, das während der Osmication^aufFettmembranen abgelagert wurde. Ein maximaler Kontrast wird erreicht, wenn Uranyl-Acetat vor der Einbettung und als Post-Fleck indünnen Abschnitten 12 aufgetragen wird.

Blei (Atomzahl 82) ist der häufigste Fleck, der für TEM verwendet wird und vor allem für die Nachfärbung dünner Abschnitte verwendet wird. Bleisalze haben eine hohe Elektronenundurchlässigkeit und zeigen eine Affinität zu einer Vielzahl von Zellstrukturen, darunter Membranen, nukleare und zytoplasmische Proteine, Nukleinsäuren undGlykogen 26,^27. Bei der Doppelfärbung (d.h. die Färbung mit Uranyl-Acetat folgt eine Behandlung mit Blei), fungiert diese als Entwickler der Urankl-Acetat-Färbung. Zum Beispiel erhöht die Blei-Post-Färbung von Chromatin, die mit Glutaraldehyd fixiert ist,^dieUranyl-Acetat-Aufnahme um den Faktor drei^{28,29,30, 31,32}. Blei verstärkt auch die Färbung, die durch andere Metalle wie Osmium vermittelt wird. Es wird vermutet, dass Bausalze die Membranen von Osmium-Festgeweben beflecken, indem sie sich in Anwesenheit von reduziertem Osmium 33 andie polare Gruppe von Phosphatiden anhängen. Ein potenzieller Nachteil der Färbung sowohl mit Uranyl-Acetat als auch mit Blei, insbesondere bei längeren Längen, ist, dass viele verschiedene Strukturelemente gleich und nicht spezifisch gefärbt werden und daher nicht leicht voneinander zu unterscheiden sind 12 12 .

Die jüngste Einführung alternativer Lichtquellen, wie etwa in der optischen, photoaktivierten fotoaktivierten Lokalisierungsmikroskopie, hat die Lichtmikroskopie³⁴deutlich verbessert. Da die Lichtmikroskopie jedoch auf histochemische und immunzytochemische Methoden zur Visualisierung von individuell gekennzeichneten Proteinen oder Enzymen beruht, bleibt die Kraft von TEM, alle Strukturelemente auf einmal darzustellen, für eine eingehende Untersuchung der Morphologie und Maßverhältnisse von Gewebestrukturen. Insbesondere kann keine andere Technik die morphologischen Details liefern, die notwendig sind, um die morphometrische Analyse der synaptischen Vesikelverteilung an vorsynaptischen Nervenbausstrichen durchzuführen. Dennoch ist es wichtig zu beachten, dass Elektronenmikrogramme die Struktur des Gewebes nach dem Tod des Organismus erfassen und daher keine Informationen über die Dynamik des vorsynaptischen Vesikelhandels und der Exozytose liefern können. Daher sollten andere Werkzeuge, wie FM-Farbstoff-Live-Bildgebung und Patch-Clamp Elektrophysiologie, in Betracht gezogen werden, wenn das Hauptziel ist, dynamische und funktionale Aspekte des synaptischen Bläschellehandels und der Exozytose zu untersuchen.

Protokoll

Alle Studien wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Virginia (Charlottesville, VA) genehmigt und in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Richtlinien durchgeführt.

1. Fixierung durch Gefäßperfusion

NOTE: Eine allgemeine Beschreibung der Methode der Ratten-Hirndurchblutung wurde bereits in dieser Zeitschrift¹³ detailliert beschrieben und ist außerhalb des Rahmens dieses Protokolls. Die folgenden Schritte sind jedoch spezifisch für die Vorbereitung des neugeborenen Rattenhirngewebes, um hochwertige Elektronenmikrogramme für die quantitative Analyse der synaptischen Vesikelverteilung an vorsynaptischen Terminals zu erhalten.

1. 4% Paraformaldehyd vorbereiten
   1. 800 mL 0,1 M Phosphat-Buffer (PB) in einen 2 L-Glasbecher auf eine Rührplatte unter eine Fume-Haube legen. Auf ca. 60 ° C erhitzen, ohne den Puffer zu kochen.
   2. 40 g Paraformaldehyd-Pulver hinzufügen. Durchgehend umrühren
   3. Beim Messen von pH-Wert kleine Tropfen von 10 N NaOH hinzufügen, bis sich die Lösung klärt. Der letzte pH-Wert sollte 7,2-7,4 betragen.
   4. Fügen Sie die restlichen 0,1 M PB auf ein Endvolumen von 1 L. Abkühlen lassen, mit einer 0,45 μm Membran filtern und über Nacht bei 4 ° C aufbewahren.
      NOTE: Bereiten Sie frisches Paraformaldehyd am Tag vor der Durchblutung.
      CAUTION: Die Inhalation von Aldehyddddämpfern kann Nasensymptome und Atemwegirritationen verursachen. Der Kontakt mit der Haut verursacht Dermatitis. Aldehyde sollten in einer Nebelhaube mit Handschuhen, Schutzkleidung und Schutzbrille behandelt werden.
2. Timrode-Lösung vorbereiten
   1. 1 L destilliertes Wasser in einen Glasbecher auf eine Rührplatte legen. NaCl (8 g), KCl (0,15 g), CaCl 2 (0,1 g), MgCl 2 (0,006 g), NaH₂PO₄ (0,55 g), NaHCO₃ (1 g) und Dextrose (1 g) im Becher.
   2. Stun rühren und pH messen. Halten Sie pH zwischen 7,2 und 7,4.
      NOTE: Tyrode-Lösung ist auch kommerziell erhältlich.
3. Mit Glutaraldehyd 4% Parformaldehyd bei einer Endkonzentration von 2% vermischen. 40 ml Elektronenmikroskopie-Grade 50% Glutaraldehyd zu 1 L von 4% Paraformaldehyd hinzufügen. Gut in einer Rührplatte mischen
   NOTE: Etwa 100 mL der Paraformaldehyde-Glutaraldehyd-Fixlösung sind erforderlich, um den Körper einer neugeborenen Ratte zu perfektionieren. Daher können mindestens 10 neugeborene Ratten mit 1 L Fixierung perfektioniert werden. Paraformaldehyd und Glutaraldehyd erst unmittelbar vor dem Gebrauch vermischen. Bringen Sie alle Lösungen auf Raumtemperatur vor der Durchblutung.
4. Sobald der Zugriff auf die linke Herzkammer erreicht ist (siehe ganze Tierperfusionsprotokoll¹³), spült das Gefäßsystem mit Tyrode-Lösung für 30 s bei einem Perfusionsdruck von 120 mmHg.
   NOTE: Der Erfolg der Perfusion hängt zum Teil vom vollständigen Ausschluss von Blut aus dem Gefäßbett ab
5. Mit Paraformaldehyde-Glutaraldehyd-Lösung mit dem gleichen Druck für 10 min.
   NOTE: Die Aufrechterhaltung des konstanten Perfusionsdrucks ist unerlässlich, um die Einführung von Artefakten zu vermeiden. Darüber hinaus sollte die Temperatur des Parfüms nicht unter der Körpertemperatur der Ratte liegen, um Vasokonstriktion zu vermeiden
6. Entfernen Sie das feste Gehirn aus dem Schädel und legen Sie in frischem Paraformaldehyde-Glutarhyd-Fixativ bei 4 ° C über Nacht.
   Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

2. Gehirnschneiden

1. Das feste Gehirn in 4% Acharose einbetten und den hirnagergebrann-Kblocken auf einer Vibratome einbetten
   NOTE: Andere Labore haben qualitativ hochwertige Abschnitte erreicht, indem sie einen stabilen Block auf dem Vibratome ohne Agarunterstützung erreicht haben.
2. Sektionsscheiben mit einer Dicke von 50 μm. Stellen Sie das Mikrotom auf Niederfrequenz und Geschwindigkeit.
   NOTE: Abschnitte können über mehrere Jahre in 0,1 M PB mit 0,05% Natriumazid bei 4 ° C gelagert werden.
3. Legen Sie die Abschnitte in 0,1 M PB in eine Petrischale, untersuchen Sie die Abschnitte unter einem Trennmikroskop und wählen Sie Exemplare für die Einbettung
   NOTE: Das Protokoll kann hier pausiert werden.

3. Rülen

NOTE: Es ist wichtig, das Exemplar nach der Fixierung mit Aldehyden und vor der Nachfixierung mit Osmium zu spülen, da Restfixate Osmiumausfällen produzieren können.

1. Pipette 0.1 M PB in eine kurze, Mund-Mund-Glas-Vial mit Kappe. Legen Sie pro Vial ein Exemplar ab. Das Exemplar vollständig bedecken, damit es nicht trocknet.
   NOTE: Halten Sie die Proben in der gleichen Ampullen aus diesem Schritt durch alle Lösungsänderungen der Fixierung, Austrocknung und Infiltration, bis sie für eine flache Einbettung bereit sind.
2. Spülen Sie das Exemplar in 0.1 M PB für 3 min x 2, dann entfernen Sie PB mit einer Mikropipette.
   NOTE: Da das Gehirn der neugeborenen Ratte zutiefst empfindlich auf Veränderungen in der Osmolarität^{12,35, 36,}37^ist,^führendie Scheiben im gleichen Fahrzeug wie in der Fixierung Gemisch verwendet

4. Post-Fixierung mit Osmium

1. Zubereitung von Osmi-Tetroxid (OsO₄)
   NOTE: In diesem Autorenlabor werden OsO₄ 4 4% verwendet, die in einer wässrigen Lösung in Glasampullen geliefert wird (5 mL von OsO₄ 4% in H_{2 O)}. Andere Labore haben OsO₄ Kristalle erfolgreich verwendet. Allerdings sind mehrere Stunden nötig, um OsO_4-Kristalle in einem Fahrzeug aufzulösen.
   1. Nehmen Sie 5 ml (eine Ampulle) von 4% OsO₄/H_{2 O,}öffnen Sie es und legen Sie es in eine braune Glasflasche
      NOTE: OsO₄ ist ein starkes Oxidationsmittel und wird durch Lichteinwirkung leicht reduziert. Eine Reduktion kann während der Vorbereitung vermieden werden, indem OsO₄ in eine braune Glasflasche gelegt wird.
   2. 5 mL von 0,2 M PB hinzufügen. Dies ergibt 10 mL von 2% OsO₄/0,1 M PB.
      NOTE: Da das Gehirn der neugeborenen Ratte zutiefst empfindlich auf Veränderungen in der Osmolarität reagiert, verwenden Sie den gleichen Puffer, um Aldehydfixate und OsO₄ Lösung^{12,35, 36,}37^{vorzubereiten}.
   3. Fügen Sie weitere 10 ml von 0,1 M PB hinzu. Dies ergibt eine endgültige Lösung von 20 mL von 1% OsO₄ in 0,1 m PB.
   4. Verwenden Sie eine 20 ml Spritze mit einer langen Nadel, um 1% OsO₄ zu zeichnen und in eine braune Glasflasche oder eine mit Alufolie bedeckte Sproben-Vial zu legen.
      CAUTION: OsO₄ ist extrem flüchtig und seine Dämpfe sind giftig für Nase, Augen und Hals. Alle Arbeiten sollten in einer Fume-Kapuze mit Handschuhen und Schutzkleidung durchgeführt werden, und kein Körperteil sollte OsO₄ausgesetzt werden. Die Handhabung und Entsorgung sollte nach den Richtlinien Ihrer Institution erfolgen. Den ungenutzten OsO₄ in einer fest gestopften braunen Glasflasche mit Teflon-Liner auf dem Glasstopper aufbewahren, die Flasche in doppelter Aluminiumfolie wickeln und in einem Dessicator aufbewahren. In Anwesenheit von undichten Dämpfen, OsO₄ kann die inneren Oberflächen und den Inhalt des Kühlschranks zu verfärben. Unter den oben genannten Lagerbedingungen ist die OsO_4-Lösung für mehrere Monate stabil. Wenn Lösungen während der Lagerung oxidiert werden, werden sie grau, in diesem Fall müssen sie entsorgt werden.
2. OsO₄ in 0,1 M PB in die Probe vial geben und für 1 h sitzen lassen. Extrahieren OsO 4 nach 1 h mit einer Mikropipette_.
   NOTE: Bevor man OsO₄ auf den Abschnitt aufträgt, ist es wichtig, das Exemplar zu entfalten und zu flachen. Vermeiden Sie die Anwendung direkt auf dem Exemplar, sondern verwenden Sie die Wände der Ampulle, um OsO₄ sanft auf den Boden der Ampulle zu tropfen. Das Exemplar wird kurz nach der OsO_{4-Anwendung braun} und starr_. Handelt von nun an sanft, um Gewebeschäden zu vermeiden

5. Spülen

NOTE: Es ist wichtig, das Exemplar nach der Nachfixierung mit OsO₄ und vor der Austrocknung^zuspülen, da Restfixate mit Dehydratationsmitteln 37 reagieren können.

1. Spülen Sie mit 0,1 M PB für 3 min x 3.
   NOTE: Da das Gehirn der neugeborenen Ratte zutiefst empfindlich auf Veränderungen in der Osmolaritätreagiert,^führenSie die Wäsche im gleichen Fahrzeug durch, wie es in der Fixierung 12^{,35, 36,}37^verwendetwird.
2. Legen Sie die Osmium-Lösung und die ersten beiden PB-Spülungen in OsO_4-Abfall und entsorgen Sie sie nach den Richtlinien Ihrer Institution.

6. Sequentielle Dehydrierung und Staining mit Uranyl-Acetat

NOTE: Das Labor dieses Autors verwendet wasserverirrbare Epoxidharze für die Einbettung. Wenn Epoxidharze verwendet werden, muss das freie Wasser der Proben durch ein organisches Lösungsmittel ersetzt werden, bevor das Einbettungsmedium infiltriert wird. Das Wasser wird entfernt, indem das Exemplar durch eine Reihe von Lösungen aufsteigender Konzentrationen von Ethanol und Aceton¹²geleitet wird.

1. Vorbereitung von Uranyl Acetat (UA)
   1. Legen Sie eine 200 mL volumetrische Glasflasche mit 100 ml EtOH 70% auf eine Rührplatte.
   2. 4 g UA in die Flasche geben. In Aluminiumfolie wickeln (UA fällt bei Lichteinwirkung aus) und kontinuierlich umrühren.
      NOTE: UA löst sich langsam und unvollständig in 70% EtOH auf. Lassen Sie ungelöste Kristalle sich vor der Verwendung der Lösung niederlassen. Die UA-Lösung sollte vor dem Einsatz mit einem 0,45 μm Filter gefiltert werden. UA kann im Voraus zubereitet und monatelang in einer braunen Flasche in Alufolie gewickelt werden.
      CAUTION: UA ist leicht radioaktiv und hochgiftig. Das Einatmen von UA-Pulver kann zu Störungen der oberen Atemwege und Erkrankungen der Lunge, der Leber und der Nieren führen. UA ist gefährlich, wenn es aufgenommen wird oder wenn es in direkten Kontakt mit Haut und Schleimhäuten kommt. Alle Arbeiten sollten in einer Fume-Kapuze mit Handschuhen und Schutzkleidung durchgeführt werden. Die Handhabung und Entsorgung sollte nach den Richtlinien Ihrer Institution erfolgen.
2. Dehydraat in 50% EtOH für 1 Minute. Entfernen Sie 50% EtOH, bevor Sie UA hinzufügen.
3. Fügen Sie 4% UA in 70% EtOH. 1 Stunde oder über Nacht sitzen lassen. Wenn Sie über Nacht, in den Kühlschrank bei 4 ° C.
   Hinweis: Cap vial, um EtOH-Verdunstung zu vermeiden und mit Aluminiumfolie zu bedecken, um Lichteinwirkung zu vermeiden. Das Protokoll kann hier pausiert werden.
   1. Entsorgen von UA-Abfällen und den beiden folgenden Spülungen nach den Richtlinien Ihrer Institution
4. Dehydraid in 70% EtOH für 1 min.
5. Dehydraid in 90% EtOH für 5 min.
6. Dehydraat in 100% EtOH für 5 min x 2.
7. Das Exemplar in Aceton 2 min x 3 abspülen.

7. Infiltration und Einbettung

NOTE: Die Aufgaben sind nicht starr genug, um in dünne Abschnitte ohne die zusätzliche Unterstützung einer Harzmatrix geschnitten zu werden. Daher müssen die Infiltration und Einbettung der Sektionierung^{von 12}vorausgehen.

1. Zubereitung von EPON-Harz
   1. Verwenden Sie eine 60 ml Gavage Spritze. Den Spritzenpinsel entfernen und die Spritze mit einer Sicherheitsnadel kappen.
   2. Die Spritze mit der offenen Seite nach oben legen und das Volumen der einzelnen Inhaltsstoffe des Harzmixes schrittweise hinzufügen. 22 mL Embed-812 (Harz) dazugeben. DSA (Härter) auf ein Gesamtvolumen von 37 ml. Mit NMA (Härter) wird ein Gesamtvolumen von 50,5 mL. 525 μL DMP-30 (Beschleuniger) mit Pipette hinzufügen. Bewegen Sie den Kolben der Pipette sehr langsam, da DMP sehr zäh ist.
      Hinweis: Es ist wichtig, die Einbettenreagenzien in der aufgelisteten Reihenfolge hinzuzufügen. Der Beschleuniger (DMP-30) muss zuletzt hinzugefügt werden. Um einen ausgehärteten Block zu erhalten, der die gewünschten Eigenschaften hat, ist es wichtig, die genaue Menge des Härters und des Beschleunigers zu verwenden. Frisch zubereitete Einbettmischungen werden bevorzugt.
   3. Den Kolben zurücklegen und die Spritze auf einen Rocker legen, der mindestens 30 Minuten lang durchgehend schüttelt.
      NOTE: Alle Zutaten müssen sehr gründlich gemischt werden. Das führt nicht zu einer ungleichmäßigen Imprägnierung der Gewebeproben und zu einem Block ungleichmäßiger Härte.
2. Einen Volumen EPON-Harz mit einem Volumen Aceton in einem Sint Vial mischen und zum Mischen schütteln. Nach dem Entfernen der letzten Acetonspülung die 1:1 EPON: Acongemisch auf das Gewebe auftragen. Halten Sie sich bedeckt, um die Verdunstung von Aceton zu vermeiden. Die 1:1 Mischung aus Harz und Aceton nach 2-4 h entfernen oder über Nacht halten.
   Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
3. Die Mischung aus Harz und Aceton durch Vollharz ersetzen. 4 Stunden oder über Nacht ruhen lassen. Setzen Sie alle EPON-Abfälle in einen Sammelbehälter unter die Haube, um später polymerisiert und entsorgt zu werden.
   Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

8. Flacheinbettung

NOTE: Die Specimens sind in einer sandwich-ähnlichen Art und Weise zwischen zwei Aclar-Filmen flach.

1. Schneiden Sie zwei rechteckige Stücke von klaren Aklar-Blech. Wischen Sie die Folien mit EtOH 70% sauber. Schneiden Sie die Bleche so, dass auf jeder Seite des Abschnitts mindestens 1,5 cm gewebefreies Plastik vorhanden sind. Das Aklar-Blech oben sollte die gleiche Breite wie die untere haben, und seine Höhe sollte etwa zwei Drittel des unteren Blattes betragen.
2. Die Ampulle langsam mit dem Exemplar kippen und das Gewebe sanft vom Boden der Ampulle heben.
3. Verwenden Sie einen mikroflexiblen Spachtel und eine feine Bürste, um den Abschnitt entlang der Vialwände vorsichtig zu bewegen und auf das Aklar-Blech zu übertragen.
   NOTE: Handle Abschnitte mit Vorsicht, um Probenschäden zu vermeiden.
4. Das Aklar-Blech vorsichtig auf das Exemplar legen.
   NOTE: Achten Sie darauf, dass genügend Harz zwischen den beiden Blättern vorhanden ist, um das Sandwich zu versiegeln
5. Schieben Sie die eingeklemmten Luftblasen vorsichtig aus, ohne direkten Druck auf den Abschnitt auszuüben. Löschen Sie den überschüssigen EPON.
   NOTE: Die Beseitigung von Luftblasen ist wichtig, da ihre Anwesenheit die Visualisierung der Proben erschwert und die Stabilität der Harzbindungen schwächt.
6. Die Blätter mit einem lösemittelfesten Stift betikieren und im Backofen bei 60 ͦC für 2-3 Tage zum Polymeren anrichten.
   Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

9. Kapsel Einbettung

NOTE: Ultramikrotome werden mit Chucks geliefert, um zylindrische Blöcke zu halten, die aus Einbettproben in Kapseln gewonnen werden. Zylindrische Blöcke haben die ideale Geometrie, um am wenigsten von Vibrationen beeinflusst zu werden, die während der Abtrennung entstehen.

1. Die geschliffen Aklar-Filme sanft öffnen. Das Exemplar wird an einem der beiden Aclar-Blätter haften.
2. Verwenden Sie einen lösungsmittelresistenten Stift, um die Seite des Aklarblechs zu markieren, das den Abschnitt enthält. Markierung in der Nähe des Gewebes.
   NOTE: Es ist wichtig, diesen Schritt durchzuführen, bevor man das Gewebe des Interesses ausstanzt.
3. Verwenden Sie einen Scheibenstempfang, um eine Kreisprobe des Abschnitts zu erhalten. Die Stiftermarke sollte Teil des ausgestanzten Gewebes sein.
4. Bereiten Sie die Kappe einer Einbettung Kapselseite nach oben auf einem Kapselhalter. Legen Sie einen Tropfen Harz auf die Kappe.
5. Legen Sie die gestanzte Scheibe in die Kappe mit dem Gewebeabschnitt nach oben. Die Stiftermarke leuchtet, wenn Licht auf das Exemplar leuchtet.
6. Legen Sie eine Kapsel in die Kappe und verwenden Sie feine Pinzette, um die Beschriftung einzulegen. Ein bedrucktes 2 cm langes Stück Papier in die Kapsel rollen und unterlassen. Machen Sie das Etikett, um an die Krümmung der Seitenwände der Kapsel passen. Warten Sie auf die Polymerisation, so dass das Etikett dauerhaft in das Harz eingebettet wird.
7. Das Einbettchen in die Kapsel gießen und bis zum Rand der Kapsel füllen.
8. Drücken Sie das Gewebe mit Hilfe eines spitzen Holzstäcks auf den Boden der Kapsel und legen Sie es 2-3 Tage lang in den Ofen.
   NOTE: Achten Sie darauf, das Gewebe nicht zu hart zu drücken, sondern locker liegen zu lassen, so dass zwischen Gewebe und Kapseloberfläche eine dünne Schicht des Einbettungmediums vorhanden ist. Das Protokoll kann hier pausiert werden.

10. Trimmen von Block Face

NOTE: Kleine Größe und entsprechende Form der Blockfläche sind Voraussetzung für eine zufriedenstellende Abtrennung. Daher ist das Beschneiden des Probenblocks eine Notwendigkeit.

1. Verwenden Sie eine scharfe Einkanten-Rasierklinge. Achten Sie sofort vor dem Gebrauch mit Aceton.
2. Montieren Sie den Kapselblock in einen Blockhalter und legen Sie den Blockhalter auf die Stufe eines Stereomikroskops.
   NOTE: Der Schneidevorgang sollte unter Mikroskop-Fernglas und schräg beleuchtetes Licht erfolgen.
3. Entfernen Sie das Aklarblech mit einer Rasierklinge von der Kapselspitze. Das Aklar-Blech erscheint als glänzende Schicht unter dem Licht des Abschnittsbereichs.
4. Halten Sie die Rasierklinge in einem Winkel von 45 Grad und schneiden Sie vier Seiten des Kapselblocks.
   NOTE: Eine bessere Kontrolle des Trimmens wird erreicht, wenn die Klinge mit beiden Händen gehalten wird.
5. Machen Sie kurze Schnitte, so dass der Block die Form einer kurzen Pyramide mit Wandwinkeln von ca. 45 ° annimmt.
   NOTE: Das Probengesicht wird viel besser gestützt, wenn die Seiten, die zu ihm führen, kurz gehalten werden. Ist die Blockspitze zu dünn und zu lang, vibriert sie bei dünner Abtrennung. Idealerweise sollte der Interessenbereich in der Blockfläche zentriert werden.
6. Schneiden Sie die Spitze der Kapsel, um überflüssiges Gewebe abzuwerfen und nur den Bereich des Interesses zu erhalten.
   NOTE: Kein Teil des Abschnitts sollte ohne Gewebe sein, da Abweichungen in der Dichte der Blockfläche eine Hauptursache für Schwierigkeiten bei der Abtrennung sind. Idealerweise sollte die Oberfläche der Kapselwand nicht mehr als 1 mm²betragen.
7. Die Kapselwand in Form eines skalenen Trapezes zerkleinern. Da in einem Skalen-Trapez keine Seite gleich ist, ist diese Form am besten, um den Bereich des Interesses im Verhältnis zum Rest des Exemplars zu orientieren.
   NOTE: Bei der Abtrennung wird das trapezförmige Gesicht viel besser getragen als bei jeder anderen Form.

11. Mikrotome Sectioning

NOTE: Die Mehrzahl der biologischen Exemplare ist in ihrem natürlichen Zustand zu dick, als dass sie von einem Elektronenstrahl durchdrungen werden könnten. Daher muss das Material in dünne Abschnitte geschnitten werden, die durch den Elektronenstrahl durchdrungen werden können.

1. Schneiden Sie dünne Abschnitte (silberne Interferenzfarbe, 600-900 °) auf einem ultramikrotomen an parallel zur Oberfläche parallelen Ebenen.
2. Legen Sie die Abschnitte auf Gitter. In diesem Autorenlabor werden Kupfergitter von 3,05 mm Außendurchmesser verwendet.
   NOTE: Das Protokoll kann hier pausiert werden.

12. Nachfärbung mit Uranyl-Acetat

1. In destilliertem Wasser 2% UA zubereiten. Legen Sie eine 200 ml volumetrische Glasflasche mit 100 ml destilliertem Wasser auf eine Rührplatte. 2 g UA in die Flasche geben. In Aluminiumfolie wickeln (UA fällt bei Lichteinwirkung aus) und kontinuierlich umrühren.
   NOTE: Details zur UA-Vorbereitung finden Sie in Abschnitt 6 dieses Protokolls.
2. Mehrere individuelle Tropfen von 2% UA auf ein sauberes Blatt Zahnwachs in einer Petrischale legen.
3. Schweben Sie das Gitter mit dem Exemplar (Sektionsseite nach unten) auf einem Tropfen UA für 25 min.
   NOTE: Schweben Sie jedes Raster auf einem separaten Tropfen UA.
4. Halten Sie das Gitter an seinem Rand mit Zangen und spülen Sie zweimal unter einem sanften Strahl gekochten destillierten Wassers bei Raumtemperatur aus einer Plastikwaschflasche.
   NOTE: Lassen Sie das Gitter nicht trocknen, bevor Sie mit Blei färben.

13. Nachfärbung mit Blei

1. Bereiten Sie eine_CO-2-freieKammer vor (CO₂ in der Luft ist die primäre Quelle für Bleiniederschlag). Legen Sie ein Stück Filterpapier mit 1 N NaOH in einer Petrischale getränkt. Legen Sie ein kleines Blatt sauberes Zahnwachs auf das Filterpapier und legen Sie mehrere NaOH-Pellets auf eine Seite der Schüssel. Das Gericht bedecken.
   NOTE: Bereiten Sie dieses Setup vor, bevor die Gitter mit UA befleckt sind, so dass die Atmosphäre in der Kammer frei von CO_{2 ist} und bis zur vollständigen UA-Färbung für die Bleibeflärbung bereit ist.
2. Machen Sie 4% NaOH. 0,2 g NaOH bis 5 ml destilliertes Wasser hinzufügen.
3. Bereiten Sie Sato es dreifache Lead-Lösung vor. Um 10 mL vorzubereiten, 0,1 g Bleinitrat, 0,1 g Bleizitrat, 0,1 g Bleiacetat und 0,2 g Natriumcitrat in eine Glasflasche geben. 8,2 ml destilliertes Wasser dazugeben und 5 min kräftig schütteln. Sonicate für 30 s, dann 1,8 ml frisch gemachte 4% NaOH hinzufügen.
4. In der Petrischale mehrere Tropfen von Satos Vorsprung auf das Wachs legen.
5. Legen Sie das mit UA befleckte Gitter (Sektionsseite nach unten) auf den Bleitropfen.
   NOTE: Jedes Gitter sollte auf einem separaten Tropfen Blei geflogen werden. Jeder Tropfen sollte klein genug sein, damit das Gitter auf der Kuppel des Tropfens schweben kann, anstatt an den Seiten nach unten zu rutschen.
6. Die Schüssel bedecken und 5 min flecken lassen.
7. Halten Sie das Gitter an seinem Rand mit Zangen und waschen Sie gründlich unter einem sanften Strahl gekochten destillierten Wassers bei Raumtemperatur aus einer Plastikwaschflasche.
8. Das Gitter auf Filterpapier trocknen und das Gitter aufbewahren.
   NOTE: Achten Sie darauf, dass der Abschnitt nicht in direktem Kontakt mit dem Filterpapier steht.

Ergebnisse

Allgemeine Kriterien, die meist als Indikator für eine zufriedenstellende oder fehlerhafte Konservierung von Proben für TEM akzeptiert werden, wurden festgelegt. Diese Kriterien werden in vier ausgewählten Elektronenmikrographen (zwei Beispiele für optimale Präparate, zwei Beispiele für mangelhafte Präparate) veranschaulicht, die durch die Behandlung des jungen Rattenhirngewebes nach den in diesem Protokoll beschriebenen Methoden gewonnen wurden.

In der Regel erscheint ein hochwertiges ...

Diskussion

Der Umgang mit Gewebeabschnitten während der Probenvorbereitung für TEM erfordert ein hohes Maß an Finesse, Konzentration und Geduld. Bei der Verwendung einer Mikropipette können durch Oberflächenspannung Proben in die Pipette-Spitze gesaugt werden, daher sollte man sehr darauf achten, dass die Pipette durch Gewebeschäden vermieden wird. Außerdem können bestimmte Schritte der Dehydratationssequenz so schnell wie 1 min sein, daher muss der Bediener schnell arbeiten, um sicherzustellen, dass der nächste Dehydrieru...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19170	acqueous
50% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16310	EM grade, acqueous
Aclar 33 C embedding film	Electron Microscopy Sciences	50425-25	7.8 mil thickness, size 8"x10"
BEEM capsule holder	Electron Microscopy Sciences	69916	holds size "00" capsules
BEEM embedding capsules	Electron Microscopy Sciences	70021	size "00", flat
Butler block trimmer	Electron Microscopy Sciences	69945-01
Camel hair paint brush	Electron Microscopy Sciences	65576-01
Disc punch	Electron Microscopy Sciences	77850-09
Embed 812 kit	Electron Microscopy Sciences	14120
Lead acetate	Electron Microscopy Sciences	17600
Lead citrate	Electron Microscopy Sciences	17800
Lead nitrate	Electron microscopy Sciences	17900
Leica UC7 ultracut microtome	Leica
Micro scale	Electron Microscopy Sciences	62091-23
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19208	EM grade, granular
Precision Thelco laboratory oven	Thelco	51221159
Sodium azide	Sigma-Aldricht	S2002
StatMark pen	Electron Microscopy Sciences	72109-01
Tyrode solution	Electron Microscopy Sciences	11760-05
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400	powder