Sinir terminallerinde sinaptik vezikül dağıtımının Ultrastrik morfometrik analizi için yenidoğan Rat beyin dokusunun hazırlanması

Özet

Biz sinir terminallerinde sinaptik vezikül dağılımı morfometrik analizi için yüksek çözünürlüklü elektron MİKROGRAFİ elde etmek için yenidoğan sıçan beyin dokusu işleme prosedürleri açıklanmaktadır. Bu yöntemlerle elde edilen mikrografikler, diğer hücresel bileşenlerin bir dizi morfolojisi ve boyutsal yapısal ilişkilerini incelemek için de kullanılabilir.

Özet

Laboratuvarımız ve diğerleri sinaptik veziküller Morfoloji ve mekansal organizasyonu incelemek için iletim elektron mikroskobu yüksek çözme gücü sömürüyor. Ön sinaptik vezikül dağılımının nicel analizi için gerekli olan morfolojik ayrıntı derecesini verebileceğiniz yüksek kaliteli elektron mikrografileri elde etmek için optimum numune hazırlama önemlidir. Kimyasal sabitleme, numune hazırlama sürecinde ilk adımdır ve ince ultrastrasyon korumak için son derece önemlidir. Bir glutaraldehit-formaldehit çözeltisi ile vasküler fiktasyon, ardından osmiyum tetrokid ile vibratome-kesitli numunelerin tedavisinde, moleküllerin maksimum sayısını stabilize, özellikle protein ve lipidler, ve üstün koruma sonuçları . Doku daha sonra counterstaining, sıralı dehidrasyon ve reçine katıştırma ile işlenir. Uranyl asetat ile en blok boyama (yani, reçine gömme önce vibratome-kesitli doku boyama) endojen kontrast geliştirir ve numune işleme sırasında ekstraksiyon karşı hücre bileşenlerini stabilize. Ultra ince bölümlerinde bir post-leke olarak uranyl asetat uygulayarak kontrast daha da artırılabilir. Uranyl asetat tedavisi sonrasında kurşun sitrat ile ultra ince bölümlerin çift boyama da görüntü çözünürlüğü geliştirir, nüklik asit içeren yapıların elektron-opaklık yoğunlaştırarak uranyl asetat yol seçici bağlama yoluyla. İletim Elektron Mikroskopisi sinaptik veziküller morfolojik detayları ve Terminal Bouton kendi boyutu ve mekansal organizasyon Ölçüleme için güçlü bir araçtır. Ancak, sabit doku kullandığından, iletim elektron mikroskobu sadece yaşam veya gelişen süreçler ile ilgili dolaylı bilgiler sağlayabilir. Bu nedenle, ana amaç sinaptik vezikül kaçakçılığı ve exocytosis dinamik veya işlevsel yönlerini incelemek için olduğunda diğer teknikler dikkate alınmalıdır.

Giriş

Biz sinir terminallerinde sinaptik vezikül uzamsal dağılımı derinlemesine morfometrik analizi için yüksek kaliteli elektron MİKROGRAFİ elde etmek için yenidoğan sıçan beyin dokusu hazırlanması için yöntemleri tarif^1,2. Bu yöntemlerden sonra numuneler işlenerek elde edilebilir yüksek karşıtlık MİKROGRAFİ Ayrıca hücresel bileşenlerin bir dizi ayrıntılı Morfoloji ve boyutsal yapısal ilişkileri incelemek için kullanılabilir^3,4.

İletim elektron mikroskobu (TEM) kantitatif organelleri ve diğer hücresel yapıların morfolojisi incelemek için güçlü bir araçtır. Bu on yıl itibariyle, yüksek basınçlı donma ile cryofixation hariç, immüno-etiketleme olmadan lipid membranlarının ve organelleri aynı ölçüde çözünürlük sağlayabilir başka soruşturma yöntemleri vardır. Ancak, dondurma ikame teknikleri yaygın olarak kullanılmaz ve normalde pahalı ekipman ve uzun hazırlık süreleri gerektirir.

TEM 'in yüksek çözme gücünün avantajlarından yararlanmak için en uygun numune hazırlama işlemleri çok önemlidir. Numune preparatın ana hedefleri, yaşam durumundan minimum değişiklik ile doku yapısını korumak, numune kontrastı geliştirmek ve elektron işleme ve maruz kalma sırasında hücresel bileşenlerin çıkarılması karşı doku stabilize etmektir ışın. TEM doku hazırlığı için çok sayıda protokol, yıllarca çeşitli laboratuvarlar tarafından tanıtıldı ve mükemmelleştirilmiştir. Çoğu sinaptik veziküller⁵,⁶,^7,8,9,10,11optimum görselleştirme için yöntemler üzerinde duruldu. Şu anda kullanılmakta olan bir dizi köklü, altın standart yöntem arasında, en iyi doku yapısını korumaya yönelik kimyasal fikmerasyon, sonrası fikmerasyon, özel blok boyama, sıralı dehidrasyon, reçine gömme ve sonrası boyama prosedürleri seçtik. mükemmel görüntü kontrastı elde edin. Dikkat, ince ultrastranın korunması özellikle yenidoğan sıçan beyin dokusu ile çalışırken zor olabilir. Aslında, çok genç hayvanların merkezi sinir sistemi yetişkin beyin daha yüksek bir su içeriği ile karakterize edilir, hücre dışı alanların daha belirgin genişlemesi, ve hücreler arasında daha gevşek bağlantılar¹². Bu, yenidoğan sıçan beyin dokusunu Osmolarite değişikliklerine derinden hassas hale getirir ve farklı tonallık¹²' nin sıralı çözeltileri ile işlenen artifaktüel daralma ve/veya şişlik için zarif bir şekilde eğilimli olur. Bu nedenle, yöntemlerimiz, sıçan yenidoğan beynin mümkün olduğunca yakın Osmolarite olan numune işleme için çözümler istihdam. Amacımız, sinir terminallerinde sinaptik vezikül mekansal dağılımının nicel değerlendirilmesi için yüksek kalitede, yüksek çözünürlüklü elektron mikroskobu görüntüleri elde etmektir. Özellikle, biz sinir terminali içinde veziküllerin sayısını ölçmek için, ön sinaptik plazma membrandan sinaptik veziküllerin uzaklığı, ön sinaptik membranda yerleştirilmiş veziküllerin sayısı, sinaptik veziküller büyüklüğü ve inter-vezikül mesafeler¹.

Tatmin edici kimyasal fiktasyon sinaptik vezikül Morfoloji ve mekansal organizasyon incelemek için gerekli morfolojik ayrıntı sağlayabilir yüksek kaliteli elektron MİKROGRAFİ elde etmek için bir ön koşuldur. Çeşitli fikrasyon modları olmasına rağmen, vasküler perfüzyon ile beyin dokusunun fikreme yöntemi diğer yöntemlere göre çok daha üstün. Vasküler perfüzyon yoluyla fiksasyon, sistemik dolaşımın tutuklandıktan hemen sonra başladığı için, beyin dokusunun deoxygenasyonu ile proteinleri fiksasyonlarla çapraz bağlama arasındaki aralığı kısaltır ve hücrelimde asgari değişiklikler sonuçlanır Yapısı. Ayrıca, vasküler yataktan ekstraküler ve hücresel bölmeler^12,13,14' e kadar olan fiktatif akışından dolayı hızlı ve Tekdüzen penetrasyon gerçekleştirir. , Osmiyum tetroksit ile ikincil fiktasyon (sonrası fikterasyon) ve ardından glutaraldehit ile primer fikfasyon, ince yapının mükemmel korunması sağlar^15,16,17. Glutaraldehit ve paraformaldehit karışımı, dokuya daha hızlı nüfuz etmek için ek bir avantaj sunuyor¹².

Biyolojik dokularda bir reçine matrisinin desteği olmadan ince bölümlere kesilecek kadar sert olmadığından, ince kesmeden önce bir ortama gömülmelidir. Su-immiscible Epoksi Reçineler genellikle TEM 'de gömme orta olarak kullanılır. Bu tür matris kullanıldığında, tüm numunenin serbest su reçine infiltrasyon önce organik bir çözücü ile değiştirilmesi gerekir. Su, numuneyi artan etanol ve/veya aseton¹²konsantrasyonlarının bir dizi çözeltisiyle geçirerek kaldırılır. Bu protokolde, numuneler ilk olarak esnek aclar çarşafları arasında gömülür ve sonra bir kapsülde gömülmüştür. Nihai sonuç, Mikrotom bölümleme sırasında kaynaklanan titreşimlerden en az etkilenecek ideal geometriye sahip silindirik reçine bloğunun ucunda yer alan dokudur.

Endojen doku kontrastı geliştirmek için ağır metaller ile boyama numune hazırlama başka önemli bir yönüdür. TEM 'de görüntü kontrastı, dokuda atomlar tarafından elektron saçılmadan kaynaklanmaktadır. Ancak, biyolojik malzemeler büyük ölçüde düşük Atomik ağırlık molekülleri (yani, karbon, hidrojen, oksijen ve azot) oluşur. Bu nedenle, yeterli saçılma kontrast nesil doku hücresel bileşenlerine yüksek Atomik ağırlık atomların eklenmesi gerektirir. Bu, ağır metaller^12,18,19ile numunenin boyama yoluyla elde edilir. Lipid için güçlü bir bağ olan Osmium tetroksit, uranyum ve kurşun, elektron lekeleri olarak kullanılan en yaygın ağır metaller.

Osmium (Atom numarası 76) varoluşun en yoğun metallerden biridir. TEM 'deki birincil rolü güvenilir bir fikreatif¹²olmakla birlikte, hem bir fikilatif hem de bir lekedir. Kullanımda olan çeşitli fiktasyon protokolleri arasında, numunenin hazırlanması sırasında hücre bileşenlerinin ekstraksiyonu azaltmada en etkili olan glutaraldehit ile çift fikreme yöntemi. Bu iki fiksatifler moleküllerin, özellikle protein ve lipidler farklı türde maksimum sayısını stabilize etmek için kullanılır, ve doku ultrastrture üstün korunması sonucu^{12,14,15, 16 , 17 yaşında}.

Uranyl asetat şeklinde en yaygın elektron lekesi olarak kullanılan büyük metal (Atom numarası 92). Benzer şekilde Osmium 'a göre, bir leke ve fikilatif olarak davranır, ancak Tem 'deki birincil rolü bir leke olarak^20,21. Nüklenli asit içeren ve membranöz yapılar aldehit-sabit dokularda uranyl tuzları ile şiddetle ve tercihen lekelenmiştir^22,23. Osmikasyon sonrası uranyl asetat ile dokuların tedavisi ve dehidratasyon önce membranöz ve nüklik asit içeren yapıların stabilizasyonu, yanı sıra gelişmiş kontrast, ve izin vermez bazı yapısal detaylar tanımlaması tek başına osmiyum ile lekelenmiş numunelerde kolayca tespit edilebilir^12,24,25. Uranyl asetat, osmikasyon sırasında lipid membranlarına yatırılmış olan azaltılmış osmiyum ile birleştirerek ince yapıyı stabilize edebilir düşünülmüştür²⁴. En yüksek kontrast, uranyl asetat yerleştirilmeden önce ve ince bölümlerde¹²' de bir sonrası leke olarak uygulandığında elde edilir.

Lead (Atom numarası 82), TEM için kullanılan en sık görülen lekedir ve özellikle ince bölümlerin sonrası boyama için kullanılmaktadır. Kurşun tuzları yüksek elektron opaklığı ve membranlar, nükleer ve sitoplazmik proteinler, nükleik asitler ve glikojen dahil olmak üzere geniş bir hücre yapıları yelpazesi için benzeşimi göstermek^26,27. Çift boyama yöntemi kullanıldığında (yani, uranyl asetat ile boyama kurşun ile tedavi takip edilir), ikinci bir uranyl asetat boyama geliştiricisi olarak davranır. Örneğin, glutaraldehit ile sabit kromatin kurşun sonrası boya üç^{28,29,30,31,32}bir faktör tarafından uranyl asetat alımı artar. Lead de Osmium gibi diğer metaller tarafından öğretilir boyama geliştirir. Bu kurşun tuzları azalmış osmiyum³³varlığında fosfatidler kutup grubuna iliştirerek osmiyum-sabit dokuların membranlarının leke düşünülmektedir. Hem uranyl asetat ve kurşun ile boyama potansiyel bir dezavantajı, özellikle uzun süreli süreleri için, birçok farklı yapısal elemanlar eşit ve non-özellikle lekelenmiş olduğunu ve böylece kolayca diğerine ayırt edilmeyebilir¹² .

Optik süper çözünürlüklü fotoğraf aktive yerelleştirme mikroskobu gibi alternatif ışık kaynaklarının son giriş, önemli ölçüde ışık mikroskobu çözünürlüğü³⁴geliştirdi. Ancak, ışık mikroskopisi tek etiketli proteinlerin veya enzimlerin görselleştirilmesi için histokimyasal ve bağışıklık-sitokimyasal yöntemlerle bağlı olduğundan, TEM 'in tüm yapısal elemanları bir kerede görüntülemeleri, derinlemesine çalışma için benzersiz kalır doku yapılarının Morfoloji ve boyutsal ilişkileri. Özellikle, başka hiçbir tekniği önceden sinaptik sinir Boutons sinaptik vezikül dağılımı morfometrik analizi gerçekleştirmek için gerekli morfolojik ayrıntı sağlayabilir. Yine de, elektronik mikrografinin organizma öldükten sonra dokusunun yapısını yakalamasını ve bu nedenle ön sinaptik vezikül kaçakçılığı ve exocytosis dinamiklerine ilişkin bilgi veremiyor olması önemlidir. Bu nedenle, FM boya-canlı görüntüleme ve yama-kelepçe elektrofizyolojisi gibi diğer araçlar, ana amaç sinaptik vezikül kaçakçılığı ve exocytosis dinamik ve/veya işlevsel yönlerini incelemek için olduğunda dikkate alınmalıdır.

Protokol

Tüm çalışmalar, Virginia Üniversitesi 'nde (Charlottesville, VA) Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylandı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri kurallarına uygun olarak yürütülmüştür.

1. vasküler perfüzyon ile fikrasyon

Not: Sıçan beyin vasküler perfüzyon yönteminin genel bir açıklaması bu Journal¹³ ' te zaten ayrıntılı olarak saptandı ve bu protokol kapsamı dışındadır. Ancak, aşağıdaki adımlar ön sinaptik terminallerde sinaptik veziküller dağılımının nicel analizi için yüksek kaliteli elektron MİKROGRAFİ elde etmek için yenidoğan sıçan beyin dokusu hazırlanması için özeldir.

1. Hazırlamak 4% civarında formaldehite
   1. Yer 800 ml 0,1 M fosfat tampon (Pb) bir duman-kaput altında bir karıştırma plaka üzerinde 2 L cam kabı. Tampon kaynatmadan yaklaşık 60 °C ' ye kadar ısı.
   2. Civarında formaldehite tozu 40 g ekleyin. Sürekli karıştırın
   3. PH ölçümü sırasında, çözüm temizleninceye kadar küçük damla 10 N NaOH ekleyin. Son pH 7.2-7.4 olmalıdır.
   4. 1 L son hacmine M PB kalan 0,1 ekleyin. Serin, 0,45 μm membran ile filtre ve gece 4 °C ' de saklayın.
      Not: Perfüzyon önceki gün taze civarında formaldehite hazırlayın.
      Dikkat: Aldehit buharlarının solunması burun semptomlarına ve hava yolu tahrişine neden olabilir. Cilt ile temas dermatit nedenleri. Aldehydes eldiven, koruyucu elbise ve güvenlik gözlükleri takarken bir duman kaputu içinde ele alınması gerekir
2. Tyrode çözümünü hazırlayın
   1. 1 L damıtılmış su bir karıştırma plaka üzerinde bir cam kabı yerleştirin. NaCl ekleyin (8 g), KCl (0,15 g), CaCl₂ (0,1 g), MgCl₂ (0,006 g), nah₂Po₄ (0,055 g), NaHCO₃ (1 g) ve Dekstroz (1 g) Beaker.
   2. Sürekli karıştırın ve pH ölçmek. 7,2 ve 7,4 arasında pH tutun.
      Not: Tyrode çözümü de ticari olarak mevcuttur.
3. % 2 son konsantrasyonda glutaraldehit ile% 4 civarında formaldehite karıştırın. 40 mL elektron mikroskobu-sınıf 50% glutaraldehit 1 L% 4 paraformaldehyde ekleyin. Mix iyi bir karıştırma plaka içinde
   Not: Yaklaşık 100 mL paraformaldehyde-glutaraldehit fiktatif çözelti yeni doğmuş bir sıçan vücudu perfkullanmak için gereklidir. Bu nedenle, en az 10 yenidoğan fareler perfatif 1 L ile Mükemmelleştirici olabilir. Kullanmadan hemen önce civarında formaldehite ve glutaraldehit karıştırmayın. Perfüzyon öncesinde tüm çözümleri oda sıcaklığına getirin.
4. Bir kez sol ventrikül erişim elde edilmiştir (tüm hayvan perfüzyon Protokolü¹³bakın), bir perfüzyon basıncında 30 s Için tyrode çözeltisi ile damar sistemi Flush 120 mmHg.
   Not: Perfüzyon başarısı vasküler yataktaki kanın tam dışlanmasına bağlıdır.
5. 10 dakika aynı basınçta paraformaldehyde-glutaraldehit çözeltisi ile Flush.
   Not: Sürekli perfüzyon basıncı Bakımı eserler giriş önlemek için esastır. Buna ek olarak, perfuzatta sıcaklık vazokonstriksiyon önlemek için sıçan vücut sıcaklığının altında olmamalıdır
6. Sabit beyin kafatasından çıkarın ve taze paraformaldehyde-glutaraldehit fiktatif yer 4 °C gece.
   Not: protokol burada duraklatılmış olabilir.

2. beyin Dilimleme

1. % 4 agaroz içinde sabit beyin embed ve vibratome aşamasında beyin-agaroz bloğu tutkal
   Not: Diğer laboratuvarlar agar desteği olmadan vibratome üzerinde istikrarlı bir blok elde ederek kaliteli bölümler elde ettik
2. 50 μm kalınlığında kesit dilimleri. Mikrotom düşük frekans ve hız ayarlayın.
   Not: Bölümler, birkaç yıl boyunca 4 °C ' de% 0,05 sodyum azid ile 0,1 M PB cinsinden depolanabilir.
3. Bir petri çanak 0,1 M PB bölümler yerleştirin, bir diseksiyon mikroskop altında bölümlerini incelemek ve katıştırmak için örnekleri seçin
   Not: Protokol burada duraklatılmış olabilir.

3. durulama

Not: Numuneyi aldehylar ile fiksasyon sonrası ve osmiyum ile refikasyon işleminden önce durulamak önemlidir, çünkü kalıntı fiksatifler osmiyum çökeltecisi üretebilir

1. Pipet 0,1 M PB, kısa, geniş ağız cam şişe içine kap. Her şişenin başına bir numune yerleştirin. Tamamen kuru değil böylece numune kapağı.
   Not: Numuneleri, düz gömme için hazır olana kadar, sabitleme, dehidrasyon ve infiltrasyon tüm çözüm değişikliklerinden Bu adımda aynı şişede tutun.
2. Numuneyi 3 dk x 2 için 0,1 M PB cinsinden durulayın ve ardından bir mikropipet ile PB 'yi çıkarın.
   Not: Yeni doğmuş sıçan beyni Osmolarite değişikliklerine derinden duyarlı olduğundan^12,35,36,37, sabitleme karışımı kullanılan aynı araç içinde yıkanmaları yürütmek

4. Osmium ile sonrası fikreme

1. Osmiyum tetroksit hazırlanması (OsO₄)
   Not: Bu yazarın laboratuarı OsO₄ 4% cam ampul bir sulu çözelti (5 ml oso₄ 4% H₂O) sağlanan kullanır. Diğer Labs, OsO₄ kristalleri başarıyla kullandı. Ancak, bir araç içinde OsO₄ kristalleri çözmek için birkaç saat gereklidir.
   1. 5 mL (bir ampul) alın 4% OsO₄/H₂o, açık ve kahverengi cam şişe içine yerleştirin
      Not: OsO₄ güçlü bir oksitleyici ajan ve kolayca ışığa maruz kalma azalır. Bir kahverengi cam şişede OsO₄ yerleştirerek hazırlama sırasında azaltma önlenebilir
   2. 5 mL 0,2 M PB ekleyin. Bu 10 mL% 2 OsO₄/0,1 M PB verecektir.
      Not: Yenidoğan sıçan beyin derin Osmolarite değişikliklere duyarlı olduğundan, aldehit fiksatifler ve oso hazırlamak için aynı tampon kullanın₄ çözüm^12,35,36,37
   3. Ek 10 mL 0,1 M PB ekleyin. Bu, 0,1 m PB 'de 20 mL% 1 OsO₄ ' ün son çözümünü verecektir.
   4. % 1 OsO₄ çizmek için uzun bir iğne ile donatılmış 20 ml şırınga kullanın ve kahverengi bir cam şişe veya alüminyum folyo ile kaplı bir scint şişe yerleştirin.
      Dikkat: OsO₄ son derece uçucu ve dumanı burun, gözler ve boğaz için toksik. Tüm çalışma eldiven ve koruyucu giysiler kullanarak bir duman-Hood yapılmalıdır, ve hiçbir vücut parçası OsO maruz olmamalıdır₄. Taşıma ve atık imha kurumunuzun yönergelerine göre yapılmalıdır. Kullanılmayan oso₄ ' ü, cam stoper Teflon liner ile sıkıca dindiğini kahverengi cam şişe içinde saklayın, çift alüminyum folyo ve mağaza bir dessicator içinde şişe sarın. Duman sızıntının varlığında, OsO₄ iç yüzeyleri ve buzdolabında içeriğini discolor olabilir. Yukarıda belirtilen depolama koşullarında OsO₄ çözeltisi birkaç ay boyunca kararlı. Depolama sırasında çözümler oksitlenmiş olduğunda, onlar, bu durumda onlar bertaraf edilmesi gerekir gri açın.
2. Ekleme 1% OsO₄ ın 0,1 M PB numune şişesine ve otur 1 saat. özü oso₄ sonra 1 h bir mikropipet ile.
   Not: OsO₄ ' ü bölüme uygulamadan önce, numuneyi açığa atmak ve yassılaştırmak önemlidir. Doğrudan numunenin üstünde uygulama kaçının, bunun yerine yavaşça şişenin altına OsO₄ damla şişe duvarları kullanın. Numune, OsO₄ uygulamasından kısa bir süre sonra kahverengi ve rijit hale gelir_. Doku hasarını önlemek için şu andan itibaren yavaşça kolu

5. durulama

Not: Numuneyi OsO₄ ve önce dehidrasyon ile sonrası fiksasyon yaptıktan sonra durulamak önemlidir, çünkü kalıntı fiksasyon maddeleri dehidrasyon ajanları³⁷ile reaksiyona gelebilir.

1. 3 dk x 3 için 0,1 M PB ile durulayın.
   Not: Yeni doğmuş sıçan beyni Osmolarite değişikliklerine derinden duyarlı olduğundan, bu fikşatif karışımı kullanılan aynı araç içinde yıkanmaları yürütmek^12,35,36,37.
2. Osmiyum çözümünü ve ilk iki PB durulama değerini OsO₄ atığa yerleştirin ve kurumunuzun yönergelerine göre atın.

6. Uranyl asetat ile sıralı dehidrasyon ve boyama

Not: Bu yazarın Laboratuvarı gömme için su-immiscible Epoksi Reçineler kullanır. Epoksi Reçineler kullanıldığında, tüm numunenin serbest su gömme ortamı tarafından infiltrasyon önce organik bir çözücü ile değiştirilmesi gerekir. Su, etanol ve aseton¹²artan konsantrasyonlarda bir dizi çözeltiler aracılığıyla numune geçirerek kaldırılır.

1. Uranyl asetat hazırlanması (UA)
   1. Bir 200 ml hacimsel cam Flask 100 ml EtOH% 70 içeren bir karıştırma plakasına yerleştirin.
   2. Flask 4 g UA ekleyin. Alüminyum folyo sarın (UA ışığa maruz kaldığında çökelir) ve sürekli karıştırın.
      Not: UA% 70 EtOH 'da yavaşça ve tamamen çözülür. Çözelti kullanmadan önce çözülmemiş kristallerin yerleşmesine izin verin. UA çözeltisi kullanmadan önce 0,45 μm filtre ile filtrelenmelidir. UA zamandan önce hazırlanabilir ve ay boyunca 4 °C ' de alüminyum folyo sarılmış kahverengi bir şişe içinde tutulur.
      Dikkat: UA hafif radyoaktif ve son derece zehirlidir. UA tozu inhalasyonu üst solunum yolu bozuklukları ve akciğer, karaciğer ve böbrekler hastalığı neden olabilir. UA, yutulması veya cilt ve Mukoza zarları ile doğrudan temas ettiğinde tehlikelidir. Tüm çalışma eldiven ve koruyucu giysiler kullanarak bir duman-Hood yapılmalıdır. Taşıma ve atık imha kurumunuzun yönergelerine göre yapılmalıdır.
2. 1 dk için% 50 EtOH içinde dehydrate. UA eklemeden önce 50% EtOH kaldır.
3. Ekle 4% UA içinde 70% EtOH. 1 saat ya da bir gecede oturalım. Eğer bir gecede, buzdolabında 4 °C yer.
   Not: Cap Vial EtOH buharlaşma önlemek ve ışık maruz önlemek için alüminyum folyo ile kapak. Protokol burada duraklatılmış olabilir.
   1. UA atık ve iki aşağıdaki durulama kurumunuzun yönergelerine göre bertaraf
4. 1 dakika için 70% EtOH içinde dehydrate
5. 5 dk için% 90 EtOH içinde dehydrate
6. 5 dk x 2 için 100% EtOH içinde dehydrate.
7. Numuneyi 2 dk x 3 için aseton halinde durulayın.

7. infiltrasyon ve gömme

Not: Dokular, reçine matrisinin ek desteği olmadan ince bölümlere kesilecek kadar katı değildir. Bu nedenle, infiltrasyon ve katıştırma¹²bölümlenme öncesinde gerekir.

1. EPON reçinesinin hazırlanması
   1. 60 ml gavaj şırınga kullanın. Şırınga pistonu çıkarın ve şırınga bir emniyet iğnesi ile kap.
   2. Açık tarafı yukarı ile şırınga yerleştirin ve artımlı olarak reçine karışımı her maddenin hacmi ekleyin. Eklemek 22 mL embed-812 (reçine). 37 mL toplam hacmine DDSA (sertleştirici) ekleyin. 50,5 mL toplam hacmine NMA (sertleştirici) ekleyin. 525 μL DMP-30 (Hızlandırıcı) ile bir pipet ekleyin. DMP çok viskoz olarak pipet pistonu çok yavaş hareket ettirin.
      Not: katıştırma reaktifleri listelenen sıraya eklemek önemlidir. Hızlandırıcı (DMP-30) son eklenmesi gerekir. İstenilen özelliklere sahip bir tedavi blok elde etmek için, sertleştirici ve Hızlandırıcı tam miktarını kullanmak için önemlidir. Taze hazırlanmış gömme karışımları tercih edilir.
   3. Pistonu geri koyun ve şırıngayı, en az 30 dakika boyunca sürekli sallayarak bir rocker üzerine yerleştirin. renk sarı kehribar değişecek.
      Not: Tüm maddeler çok iyice karıştırılmalıdır. Bunu yapmak için başarısızlık doku numunesi ve düzensiz sertliğin bir blok düzensiz emsizler sonuçlanır
2. Bir scint şişede 1 adet aseton ile EPON reçine 1 hacmi karıştırın ve karıştırın sallamak. Uygulama 1:1 EPON: son aseton durulama kaldırdıktan sonra doku üzerinde aseton karışımı. Aseton buharlaşma önlemek için kapalı tutun. 2-4 h sonra reçine ve aseton 1:1 karışımı çıkarın veya gece tutun.
   Not: protokol burada duraklatılmış olabilir.
3. Tam reçine ile reçine ve aseton karışımı değiştirin. 4 saat ya da bir gecede oturalım. Tüm EPON israfını, daha sonra polimerize ve bertaraf edilecek bir toplama kapsayıcısına yerleştirin.
   Not: protokol burada duraklatılmış olabilir.

8. düz gömme

Not: Numuneler, sandviç benzeri bir moda iki aclar filmi arasında düz gömülüdür.

1. İki dikdörtgen parça net aclar levha kes. EtOH 70% ile temiz filmler silin. Bölümün her tarafında en az 1,5 cm doku içermeyen plastik olması için sayfaları kırpın. Üstte bulunan aclar levha altta aynı genişliğe sahip olmalıdır ve yüksekliği alt levha yaklaşık üçte ikisi olmalıdır.
2. Yavaşça numune ile şişe eğim ve yavaşça şişenin alt dokusunu kaldırın.
3. Bir mikro esnek spatula ve ince fırça kullanın dikkatle şişe duvarları boyunca bölümü taşımak ve aclar levha üzerine aktarmak için.
   Not: Numune hasarını önlemek için bölümleri dikkatle ele almak.
4. Aclar sayfasını yavaşça numunenin üstüne yerleştirin.
   Not: Sandviç mühürlemek için iki yaprak arasında yeterli reçine olduğundan emin olun
5. Herhangi bir sıkışmış hava kabarcıklarını, bölüme doğrudan basınç kullanmadan hafifçe itmek. Aşırı EPON silin.
   Not: Hava kabarcıklarının eliminasyonu önemlidir, çünkü onların varlığı numunenin görselleştirilmesini zorlaştırır ve reçine bağlarının kararlılığını zayıflatır.
6. Bir solvent dayanıklı kalem ve fırın yer 60 ͦC için 2-3 gün polimerize ile yaprak etiket.
   Not: protokol burada duraklatılmış olabilir.

9. kapsül gömme

Not: Ultraminomes, kapsüllerde numuneleri katıştırarak elde edilen silindirik blokları tutmak için aynalar ile birlikte verilir. Silindirik bloklar, sekleme sırasında kaynaklanan titreşimlerden en az etkilenecek ideal geometriye sahiptir.

1. Yumuşak aclar filmleri nazikçe açın. Numune, iki aclar çarşafdan birine uyacaktır.
2. Bölümü içeren aclar levha tarafını işaretlemek için solvent dirençli bir kalem kullanın. Dokusunun yakınında Mark.
   Not: Bu ilgi dokusu dışarı Punch önce bu adımı gerçekleştirmek için önemlidir.
3. Bölümün daire örneğini elde etmek için disk yumruk kullanın. Kalem işareti, delikli dokuların bir parçası olmalı.
4. Gömme kapsül tarafındaki kapağı bir kapsül tutucuya hazırlayın. Kap üzerinde bir damla reçine yerleştirin.
5. Delikli diski, doku bölümü yukarı bakacak şekilde kapağın içine yerleştirin. Numune üzerine ışık döküldiğinde kalem işareti parıldıracaktır.
6. Kapağın içine bir kapsül yerleştirin ve etiketleme eklemek için ince cımbız kullanın. Kapsül içine baskılı 2 cm uzunluğunda bir kağıt rulo ve aşağı. Kapsülün yan duvarlarının eğriliği için etiketi uygun hale getirmek. Polimerizasyon tamamlanması için bekleyin, böylece etiket kalıcı olarak reçineye gömülür olur.
7. Kapsül içine gömme reçine dökün ve kapsülün kenarına kadar doldurun.
8. 2-3 gün boyunca 60 °C ' de fırında sivri bir tahta sopa ve yer yardımı ile doku örneğiyle kapsülün altına itin.
   Not: Çok sert doku basın değil dikkat alın, bunun yerine gömme orta ince bir tabaka doku ve kapsül yüzeyi arasında mevcut böylece gevşek yalan izin. Protokol burada duraklatılmış olabilir.

10. blok yüz kırpma

Not: Küçük boyut ve blok yüzü uygun şekli tatmin edici sekleme için Önkoşullar vardır. Bu nedenle, numune bloğu kırpma bir zorunluluktur.

1. Keskin tek kenarlı bir tıraş bıçağı kullanın. Kullanmadan önce hemen aseton ile temizleyin.
2. Kapsül bloğunu bir blok tutucuya monte edin ve blok tutucusunu bir stereomikoskop aşamasına yerleştirin.
   Not: Kırpma prosedürü mikroskop dürbün ve eğik aydınlatma altında yapılmalıdır.
3. Bir jilet kullanarak kapsülün ucunda aclar levha çıkarın. Aclar levha, diseksiyon kapsamı ışığında parlak bir tabaka olarak görünür.
4. 45 derecelik bir açıyla razor blade tutun ve kapsül bloğunun dört tarafı aşağı kesmeler yapmak.
   Not: Blade her iki elle de tutulsa, kırpma daha iyi kontrol edilir.
5. Blok yaklaşık 45 ° duvar açıları ile kısa bir piramit şeklinde alır, böylece kısa kesikler olun.
   Not: Örnek yüz, yan tarafa giden taraf kısa tutulduğu takdirde çok daha iyi desteklenir. Blok ucu çok ince ve uzun ise, ince sekleme sırasında titreşecek. İdeal olarak, ilgi alanı blok yüzünde ortalanmalıdır.
6. Gereksiz dokusu atmak ve sadece ilgi alanı korumak için kapsül ucunu Trim.
   Not: Kesit hiçbir parçası doku olmadan olmamalıdır, blok yüzü yoğunluğu varyasyonları sekleme zorluk önemli bir nedenidir. İdeal olarak, kapsül yüzünün yüzey alanı 1 mm 'den fazla olmamalıdır².
7. Kapsül yüzünü bir skalen trapezoid şeklinde kırpın. Çünkü bir skalen yamuk hiçbir yan eşittir, bu şekil en iyi örnek geri kalanı göreli ilgi alanı yönlendirmek için.
   Not: Kesme sırasında, Trapezoid şekilli yüz başka herhangi bir şekle göre çok daha iyi desteklenir.

11. mikrotome bölümleme

Not: Biyolojik numunelerin çoğunluğu bir elektron ışını ile nüfuz etmek için doğal durumlarında çok kalın. Bu nedenle, malzeme elektron ışını tarafından nüfuz edilebilir ince bölümlerde kesilmelidir.

1. Yüzeye paralel düzlemlerde ultrayicrotome üzerinde ince bölümleri (gümüş girişim rengi, 600-900 Å) kes.
2. Bölümleri kılavuzlara yerleştirin. Bu yazarın Laboratuvarı, 3,05 mm 'lik bakır ızgaraları Dış çapta kullanır.
   Not: Protokol burada duraklatılmış olabilir.

12. Uranyl asetat ile sonrası boyama

1. Damıtılmış suda% 2 UA hazırlayın. Bir 200 ml hacimsel cam Flask 100 ml damıtılmış su içeren bir karıştırma plaka yerleştirin. Flask için 2 g UA ekleyin. Alüminyum folyo sarın (UA ışığa maruz kaldığında çökelir) ve sürekli karıştırın.
   Not: UA hazırlık ayrıntıları için bu protokol 6 bölümüne bakın.
2. Bir petri çanak Diş balmumu temiz bir levha üzerinde 2% UA birkaç bireysel damla yerleştirin.
3. 25 dakika boyunca bir damla UA üzerinde numune (kesit tarafı aşağı) ile ızgarayı float.
   Not: Ayrı bir damla UA üzerinde her ızgarayı float.
4. Forseps ile kenarında ızgara tutun ve bir plastik yıkama şişesi oda sıcaklığında haşlanmış damıtılmış su yumuşak bir Jet altında iki kez durulayın.
   Not: Kurşun ile boyama yapmadan önce ızgaranın kurumasına izin verme.

13. Lead ile boyama sonrası

1. Bir CO₂-Free odası hazırlamak (Co₂ havada kurşun yağış birincil kaynağıdır). Bir petri çanak 1 N NaOH ile ıslatılmış filtre kağıdı bir parça yerleştirin. Filtre kağıdı üstüne temiz diş balmumu küçük bir levha yerleştirin ve yemeğin bir tarafında birkaç NaOH peletler yerleştirin. Tabağı koru.
   Not: Izgaralar UA ile lekelenmeden önce bu kurulumu hazırlayın, böylece odanın atmosferi CO₂ ücretsiz ve zaman UA boyama tamamlandığında kurşun boyama için hazır.
2. % 4 NaOH olun. 5 mL damıtılmış su için NaOH 0,2 g ekleyin.
3. Sato 'nun Üçlü kurşun çözümünü hazırlayın. Hazırlamak için 10 mL, eklemek 0,1 g Kurşun nitrat, 0,1 g kurşun sitrat, 0,1 g Kurşun asetat ve 0,2 g sodyum sitrat bir cam şişe içine. 8,2 mL distile su ekleyin ve 5 dk için şiddetle sallayın. 30 s için sonicate, sonra eklemek 1,8 mL taze yapılmış 4% NaOH.
4. Petri çanak balmumu üzerinde Sato 's kurşun birkaç damla yerleştirin.
5. Yol damlası üzerinde UA (Bölüm tarafı aşağı) ile lekelenmiş ızgara yerleştirin.
   Not: Her ızgaranın ayrı bir kurşun damlası üzerinde kaydırılmalıdır. Her damla yeterli ızgaranın kenarlarında aşağı kayar yerine damla kubbe üstünde float izin vermek için küçük olmalıdır.
6. Kapak çanak ve 5 dakika için leke izin.
7. Forseps ile kenarında ızgara tutun ve plastik yıkama şişesi oda sıcaklığında haşlanmış damıtılmış su yumuşak bir Jet altında iyice yıkayın.
8. Blot filtre kağıdı üzerinde ızgarayı kurutun ve ızgarayı saklayın.
   Not: Bölümün filtre kağıdıyla doğrudan temas etmediği emin olun.

Sonuçlar

Özellikle TEM için numunenin tatmin edici veya arızalı Koruma göstergesi olarak kabul edilen genel kriterler kurulmuştur. Bu kriterler, bu protokolde açıklanan yöntemlerden sonra genç sıçan beyin dokusunu tedavi ederek elde edilen dört seçilmiş elektron mikrografında (optimum hazırlık iki örnek, kusurlu hazırlık iki örnek) örneklenmiştir.

Genel olarak, iyi kaliteli bir elektron MİKROGRAFİ düzenli, farklı ve genel grimsi görüntü olarak görünür. Tatmin edici haz...

Tartışmalar

TEM için numune hazırlama sırasında doku bölümlerinin işlenmesi önemli ölçüde incelik, konsantrasyon ve sabır gerektirir. Çözümler eklemek ve kaldırmak için bir mikropipet kullanırken, numuneler yüzey gerilimi ile Pipet ucunu içine çekilebilir, bu nedenle pipet tarafından doku hasarından kaçınmak için büyük bir özen gösterilebilir. Ayrıca, dehidrasyon dizisinin belirli adımlar kadar hızlı olabilir 1 dakika, bu nedenle operatör hızlı bir sonraki dehidrasyon adım zamanında başlatıld...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19170	acqueous
50% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16310	EM grade, acqueous
Aclar 33 C embedding film	Electron Microscopy Sciences	50425-25	7.8 mil thickness, size 8"x10"
BEEM capsule holder	Electron Microscopy Sciences	69916	holds size "00" capsules
BEEM embedding capsules	Electron Microscopy Sciences	70021	size "00", flat
Butler block trimmer	Electron Microscopy Sciences	69945-01
Camel hair paint brush	Electron Microscopy Sciences	65576-01
Disc punch	Electron Microscopy Sciences	77850-09
Embed 812 kit	Electron Microscopy Sciences	14120
Lead acetate	Electron Microscopy Sciences	17600
Lead citrate	Electron Microscopy Sciences	17800
Lead nitrate	Electron microscopy Sciences	17900
Leica UC7 ultracut microtome	Leica
Micro scale	Electron Microscopy Sciences	62091-23
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19208	EM grade, granular
Precision Thelco laboratory oven	Thelco	51221159
Sodium azide	Sigma-Aldricht	S2002
StatMark pen	Electron Microscopy Sciences	72109-01
Tyrode solution	Electron Microscopy Sciences	11760-05
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400	powder