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요약

우리는 신경 터미널에서 시 냅 스 소포 분포의 형태학 적 분석을 위한 고해상도 전자 현미경을 얻기 위해 신생아 쥐 뇌 조직을 처리 하는 절차를 설명 합니다. 이러한 방법으로 얻은 마이크로 그래프는 다양 한 세포 구성 요소와 그 차원 구조적 관계의 형태를 연구 하는 데에도 사용 될 수 있습니다.

초록

우리의 실험실 및 많은 다른 사람 시 냅 스 소포의 형태와 공간 조직을 연구 하는 전송 전자 현미경의 높은 해결 능력을 착취 했다. 시 냅 스 소포 분포의 정량적 분석에 필요한 형태학 적 디테일의 정도를 얻을 수 있는 고품질 전자 현미경을 얻기 위해서는 최적의 시 편 준비가 중요 하다. 화학 고정은 표본 준비 과정의 첫 번째 단계 이며 미세한 미세 구조를 유지 하는 데 가장 중요 합니다. 알데하이드 포 름 알 데히드 용액을 사용한 혈관 고정, 오 스미 눔과 함께 구조 단면 시 편을 처리 한 후, 분자의 최대 수, 특히 단백질과 지질을 안정화 하 고 우수한 보존 효과를 냅니다. 구조입니다. 조직은 반대 염색, 순차 탈수 및 수 지 임베딩으로 처리 됩니다. Uranyl 아세테이트를 사용한 En 블록 염색 (즉, 수 지 매 립 전에 진동-절편 된 조직의 염색)은 내 인 성 대비를 강화 하 고 표본 처리 시 추출에 대 한 세포 성분을 안정화 시킵니다. 우 라 아세테이트를 초박형 단면에 후 얼룩으로 적용 하 여 콘트라스트를 더욱 높일 수 있습니다. 우 라 닐 아세테이트 처리 후에 리드 구 연산 염을 가진 극 박 단면의 이중 염색은 또한 이미지 해상도를 향상 시키며, 우 라 닐 아세테이트에 대 한 리드의 선택적 결합을 통해 핵 산 함유 구조의 전자 불투명도를 심화 시킨다. 투과 전자 현미경은 시 냅 스 소포의 형태학 적 세부 분석 및 터미널 bouton의 크기 및 공간 조직의 정량화를 위한 강력한 도구입니다. 그러나, 그것은 고정 조직을 사용 하기 때문에, 전송 전자 현미경은 살아있는 또는 발전 프로세스에 관하여 간접적인 정보를 제공할 수 있습니다. 따라서, 주요 목적이 시 냅 스 소포 매매 및 해충 증의 동적인 또는 기능적인 양상을 공부 하는 때 그밖 기술은 고려 되어야 합니다.

서문

우리는 신경 말단1,2에서 시 냅 스 소포 공간 분포의 심층 형태학 적 분석을 위한 고품질 전자 현미경을 얻기 위해 신생 쥐 뇌 조직의 준비를 위한 방법을 설명 합니다. 이러한 방법에 따라 시 편을 처리 하 여 얻을 수 있는 고 콘트라스트 마이크로 그래프는 또한 다 수의 세포 성분 및 그들의 치수 구조 관계3,4의 상세한 형태학을 연구 하는데 사용 될 수 있다.

투과 전자 현미경 (TEM)은 세포 소기관 및 다른 세포 구조의 형태를 정량적으로 연구 하는 강력한 도구입니다. 이 10 년의 기준으로, 고압 동결에의 한 저온 고정을 제외 하 고는 면역 태그 추가 없이 지질 막과 소기관의 동일한 분해능을 제공할 수 있는 다른 조사 방법이 없습니다. 그러나, 동결 대체 기술은 널리 사용 되지 않고, 일반적으로 고가의 장비 및 긴 준비 시간을 필요로 한다.

TEM의 높은 분해 력을 이용 하기 위해서는 최적의 시 편 준비가 가장 중요 합니다. 표본 준비의 주요 목표는 살아있는 상태에서 최소한의 변경을 가진 조직 구조를 보전 하 고, 표본 대조를 강화 하 고, 처리 도중 세포 성분의 추출에 대하여 조직을 안정 시키고 전자에 노출 하기 위한 것입니다 빔. TEM 조직 준비를 위한 수많은 프로토콜이 수년간 여러 실험실에 의해 도입 되 고 완성 되었습니다. 그들 중 상당수는 시 냅 스 소포5,6,7,8,11의 최적의 시각화를 위한 방법에 초점을 맞추고 있다. 현재 사용 중인 여러 가지 잘 확립 된 금 표준 방법 중에서, 우리는 최적의 조직 구조를 보존 하는 것을 목표로 화학 고정, 사후 고정, en 블록 염색, 순차적 탈수, 수 지 매 립 및 사후 염색을 위한 절차를 선택 했습니다. 뛰어난 이미지 콘트라스트를 실현 합니다. 주의, 미세 울트라 구조의 보존 신생아 쥐 뇌 조직으로 작업 할 때 특히 어려울 수 있습니다. 사실, 매우 젊은 동물의 중추 신 경계는 성인 뇌 보다 더 높은 수 분 함량, 세포 외 공간의 눈에 띄는 확대, 셀 간 패자 연결을 특징으로 합니다12. 이것은 신생 쥐 두뇌 조직은 오 스몰 농도에 있는 변화에 깊이 과민 하 게 하 고, 다른 탄력성12의 순차 해결책을 통해 처리 될 때 정교 하 게 아 티의 수축 및/또는 팽 윤에 경향이 있습니다. 따라서, 우리의 방법은 쥐 신생 두뇌의 그것에 가능한 가까운 오 스몰 농도의 표본 처리를 위한 해결책을 채택 했습니다. 우리의 목표는 신경 말단에서 시 냅 스 소포 공간 분포의 정량적 평가를 위한 고품질, 고 분해능 전자 현미경 이미지를 얻는 것 이었습니다. 구체적으로, 우리는 신경 말단 내 소포 수, 시 냅 스 전 혈장 막 으로부터의 시 냅 스 소포의 거리를 측정 하기 위해 모색 하 고 시 냅 스 전 막에 도킹 된 소 낭의 수 및 간 소포 거리1.

만족 스러운 화학 고정은 시 냅 스 소포 형태학과 공간 조직을 연구 하는 데 필요한 형태학 적 세부 사항을 제공 할 수 있는 고품질 전자 현미경을 얻기 위한 전제 조건입니다. 고정의 여러 모드가 존재 하지만, 혈관 관류에의 한 뇌 조직의 고정은 다른 방법 보다 확실히 우수 하다. 혈관 관류를 통한 고정은 전신 순환의 체포 직후에 시작 되기 때문에 뇌 조직의 탈 산소 및 고정과 단백질의 가교 사이의 간격을 단축 하 여 세포에서 최소 변형을 초래 합니다. 구조. 더욱이, 세포 외 및 세포 구획12,14에 대 한 혈관 내에서의 급속 한 고착의 흐름 때문에 빠르고 균일 한 침투를 수행 한다. 알데하이드로 1 차 고정 후 2 차 고정 (사후 고정)을 사용 하 여 미세 구조15,16,17의 우수한 보존을 산출 합니다. 알데하이드 및 파라 포름알데히드의 혼합물은 조직 (12) 내로의 보다 빠른 침투의 추가적인 이점을 가진다.

생물학적 조직은 수 지 매트릭스의 지지 없이 얇은 부분으로 절단 될 정도로 강성이 충분 하지 않기 때문에, 얇은 절편 전에 매 질에 포함 시켜야 합니다. 물-비 혼 화성 에폭시 수 지는 TEM에 있는 매 립 매체로 일반적으로 사용 됩니다. 이 유형의 매트릭스를 사용 하는 경우, 모든 시 편의 무료 물은 수 지 침투 전에 유기 용 매로 교체 해야 합니다. 물은 상승 된 농도의 에탄올 및/또는 아세톤 (12)의 일련의 용액을 통해 시 편을 통과 시 킴으로써 제거 된다. 이 프로토콜에서 표본은 플 렉 시 블 한 aclar 시트 사이에 먼저 평평 하 게 삽입 된 다음 캡슐에 포함 됩니다. 최종 결과는 원통형 수 지 블록의 끝에 위치한 조직으로, 마이크로 톰 절편 중에 발생 하는 진동의 영향을 최소한으로 받는 이상적인 형상을가지고 있습니다.

내 인 성 조직 대비를 향상 시키기 위해 중 금속으로 염색 하는 것은 표본 준비의 또 다른 중요 한 측면입니다. TEM에서의 이미지 콘트라스트는 조직의 원자에의 한 전자 산란에 기인한 것 이다. 그러나, 생물학적 물질은 주로 낮은 원자 무게 분자 (즉, 탄소, 수소, 산소 및 질소)로 구성 됩니다. 따라서, 충분 한 산란 대비의 생성은 조직의 세포 성분에 높은 원자 무게 원자의 혼 입이 필요 하다. 이는 중 금속12,18,19로 시 편의 얼룩을 통해 달성 된다. 오 스미 늄은 지질에 강하게 결합 하는 우라늄 및 납, 전자 얼룩으로 사용 되는 가장 일반적인 중 금속입니다.

오 스미 (원자 번호 76)는 현존 하는 가장 흔한 금속 중 하나 이다. TEM에서 주요 역할은 신뢰할 수 있는 픽스 쳐12이지만, 그것은 모두 고착과 얼룩입니다. 사용 중인 다양 한 고정 프로토콜 중에서 알데하이드가 뒤 따른 이중 고정 방법은 표본 준비 중에 세포 성분의 추출을 줄이는 데 가장 효과적입니다. 이러한 두 개의 고정 제가 분자의 상이한 종류의 최대 수를 안정화 시키는데 사용 되 고, 특히 단백질과 지질은, 조직 초고 구조 12,14,15의 우수한 보존 결과 16 , 17.

우라늄 (원자 번호 92)은 전자 얼룩으로 사용 되는 가장 무거운 금속으로, 가장 전형적으로는 우르 닐 아세테이트의 형태 이다. 오 스미와 마찬가지로, 그것은 얼룩과 고정의 역할을 하지만 TEM에서의 주된 역할은 얼룩20,21입니다. 핵 산-함유 및 막 모양 궁 구조는 명백 하 게 알데하이드-고정 조직22,23의 우르 라 염으로 우선적으로 염색 된다. 우 라 닐 아세테이트를 사용한 조직의 치료 및 탈수 전에 막 모양 궁 및 핵 산 함유 구조물의 안정화를 초래 하 고, 콘트라스트를 향상 시키고, 일부 구조적 세부 사항을 식별 하 여 만12,24,25의 오 스미로 얼룩진 표본에서 쉽게 검출할 수 있습니다. 요로 닐 아세테이트는 오 스 설 하24시 지질 막에 증 착 되어 있는 환 원 질과 결합 하 여 미세 구조를 안정화 시킬 수 있다고 생각 된다. Uranyl 아세테이트를 포함 하기 전에 적용 하 고 얇은 섹션12에서 얼룩을 발생 시키면 최대 콘트라스트가 달성 됩니다.

납 (원자 번호 82)은 TEM에 사용 되는 가장 흔한 얼룩 이며 주로 얇은 단면의 후 염색에 채택 됩니다. 납 염은 높은 전자 불투명도를 가지 며 멤브레인, 핵 및 세포질 단백질, 핵 산 및 글 리 코겐26,27을 포함 한 광범위 한 세포 구조에 대 한 친화도를 보여줍니다. 이중 염색 방법이 채용 되는 경우 (즉, 우르 라 아세테이트로 염색 하 여 납으로 처리 한 후), 후자는 우르 라 아세테이트 염색의 현상 액으로 작용 한다. 예를 들면, 알데하이드로 결정 된 염색 질의 납 후 염색 질은 3 개의28,29,30,31의 인자에 의해 우 라 닐 아세테이트 흡수를 증가32. 납은 또한 오 스미 움과 같은 그밖 금속에 의해 부여 된 얼룩을 강화 합니다. 인지질의 존재 하에의 극성 기에 부착 하 여 고정 된 조직-오 스미 움의 막으로의 납 염의 얼룩을 감소 시키는 것으로 생각 된다33. Uranyl 아세테이트와 납 모두로 염색의 잠재적인 단점은 특히 장기간 지속 되는 경우, 많은 다른 구조적 요소가 동등 하 게 그리고 비 특이 적으로 염색 되 고, 따라서 서로 쉽게 구별 되지 않을 수 있다는 것입니다12 .

최근의 광학 슈퍼 해상도 사진 활성화 국 소화 현미경과 같은 대체 광원의 도입은 현저 하 게 개선 된 광 현미경 해상도34을 갖는다. 그러나, 가벼운 현미경 검사 법은 개별적인 라벨링 한 단백질 또는 효소를 구상 하기 위하여 조직학 및 면역 세포 화학 방법에 의존 하기 때문에, 한 번에 모든 구조상 요소를 표시 하는 TEM의 힘은의 깊이 있는 연구를 위해 타의 추종을 불허 남아 있습니다 조직 구조의 형태학 및 차원 관계. 특히 시 냅 시스 신경 boutons 시 냅 스 소포 분포의 형태학 적 분석을 수행 하는 데 필요한 형태학 적 세부 사항을 제공할 수 있는 다른 기술은 없습니다. 그럼에도 불구 하 고, 전자 현미경은 유기 체가 죽으면 조직의 구조를 포착 하는 것이 중요 합니다, 따라서 그들은 전 시 냅 스 소포 매매 및 exocytosis의 역학에 관하여 정보를 제공할 수 없습니다. 따라서, FM 염료-라이브 이미징 및 패치 클램프 전기 생리학 등의 다른 도구는 주요 목적이 시 냅 스 소포 매매 및 배설의 동적 및/또는 기능적 측면을 연구 하는 것입니다 때 고려해 야 합니다.

프로토콜

모든 연구는 버지니아 대학에서 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 (샬러츠빌, 버지니아) 건강 지침의 국가 학회에 따라 실시.

1. 혈관 관류에의 한 고정

참고: 랫 트 뇌 혈관 관류를 위한 방법에 대 한 일반적인 설명은이 학술지 (13 )에서 이미 상세히 기술 되어 왔으며이 프로토콜의 범위를 벗어납니다. 그러나, 다음의 단계는 시 냅 스 전 터미널에서의 지 냅 스 소포 분포의 정량적 분석을 위한 고품질 전자 현미경을 얻기 위해 신생 쥐 뇌 조직의 제조에 특이 적 이다.

  1. 4% 파라 포름알데히드를 준비 하십시오
    1. 흄 후드 아래에 있는 교 반 플레이트에 2l 유리 비 커에 0.1 M 인산 완충 (PB) 800 mL를 넣습니다. 완충 액을 끓이는 것 없이 약 60 ° c로가 열 합니다.
    2. 파라 포름알데히드 분말 40 g을 추가 합니다. 지속적으로 저 어 주세요
    3. PH를 측정 하는 동안 용액이 지워질 때까지 10 N NaOH의 작은 방울을 추가 하십시오. 최종 pH는 7.2-7.4 여야 합니다.
    4. 나머지 0.1를 1l의 최종 볼륨에 추가 합니다. 0.45 μ m 멤브레인으로 식힌 후 필터링 하 여 밤새 4°c에서 보관 하십시오.
      참고: 관류 전날 신선한 파라 포 름 알 데히드를 준비 하십시오.
      주의: 알데하이드 증기를 흡입 하면 비 강 증상과 기도 자극이 발생할 수 있습니다. 피부에 접촉 하면 피부염이 발생 합니다. 알 데히드는 장갑, 보호 가운 및 안전 고글을 착용 하는 동안 흄 후드에서 처리 해야 합니다.
  2. Tyrode 솔루션 준비
    1. 1 리터의 증류수를 유리 비 커에 넣고 교 반 플레이트에 넣습니다. 0.15의 염화 나트륨 (8g), cacl2(0.006 0.1), na2po4(1g(0.055 그램) 및 비 커내에 1 그램의 덱 스트로 스를 첨가 한다.
    2. 지속적으로 저 어 서 pH를 측정 하십시오. PH를 7.2에서 7.4 사이로 유지 하십시오.
      참고: Tyrode 솔루션은 상업적으로도 이용 가능 하다.
  3. 4% 파라 포름알데히드를 알데하이드와 혼합 하 여 최종 농도 2%로 섞어 줍니다. 40 mL의 전자 현미경-등급 50% 알데하이드에 1l의 4% 파라 포름알데히드를 추가 합니다. 교 반 판에 잘 섞어 주세요
    참고: 신생아 쥐의 몸을 관류 하기 위해 파라 포 름 알데하이드 고정 용액의 약 100 mL이 필요 합니다. 따라서 최소 10 마리의 신생아 쥐를 1 L의 고정과 함께 사용할 수 있습니다. 파라 포름알데히드와 알데하이드를 사용 직전까지 혼합 하지 마십시오. 관류 전에 모든 용액을 실 온에 가져온다.
  4. 좌 심 실에 대 한 접근이 얻어 졌으 면 (전체 동물 관류 프로토콜13참조), 120 mmHg의 관류 압력에서 30 초 동안 Tyrode 용액으로 혈관 시스템을 세척 한다.
    참고: 관류의 성공은 혈관 침대에서 혈액의 완전 한 배제에 부분적으로 달려 있습니다.
  5. 10 분 동안 동일한 압력에서 파라 포 름 알데하이드 용액으로 씻어 내십시오.
    참고: 일정 한 관류 압력의 유지는 유물의 도입을 피하기 위해 필수적입니다. 또한, 관류 물의 온도는 혈관 수 축을 피하기 위해 쥐의 체온 이하로 되어서는 안됩니다.
  6. 두개골에서 고정 된 뇌를 제거 하 고 신선한 파라 포 름 알 데히드-알데하이드에서 밤새 4 ° c에서 정착 시킵니다.
    참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

2. 뇌 슬 라이 싱

  1. 4% 아가 로스에 고정 된 뇌를 삽입 하 고 진동 단계에 뇌 아가 로스 블록을 붙입니다.
    참고: 다른 실험실은 한 천 지원을 하지 않고 진동에 안정적인 블록을 달성 하 여 좋은 품질의 섹션을 얻었다
  2. 섹션 50 μ m 두께의 슬라이스. 마이크로 톰을 저주파 수와 속도를 설정 합니다.
    참고: 섹션은 0.1에서 몇 년 동안 4°c에서 0.05% 나트륨 아 지 드으로 저장 될 수 있다.
  3. 0.1 M PB의 섹션을 페 트리 접시에 놓고, 해 부 현미경의 섹션을 검사 하 고 포함 시 편을 선택 하십시오.
    참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

3. 헹 굼

참고: 알 데히드로 고정 한 후에는 시 편을 헹 구는 것이 중요 하 고, 잔류 고정 제가 오 스미 침전 물을 생성 할 수 있기 때문에, 오 스미와의 사후 정착 전에

  1. 캡이 있는 짧고 넓은 입 유리 바이 알에 0.1 피 펫을 넣습니다. 각 유리병 당 하나의 표본을 배치 합니다. 건조 하지 않도록 시 편을 완전히 덮습니다.
    참고: 고정, 탈수 및 침투의 모든 솔루션 변경을 통해이 단계에서 동일한 유리병에 표본을 유지, 그들은 편평한 포함에 대 한 준비가 될 때까지.
  2. 시 편을 0.1 M PB에서 3 분 x2로 헹 구 고, 마이크로 피 펫으로 PB를 제거 합니다.
    참고: 신생아 쥐의 뇌는 오 스몰 농도12,35,36,37의 변화에 깊이 민감 하기 때문에 고정 혼합물에서 사용 되는 것과 같은 차량에서 세척을 수행 합니다.

4. 사후 고정

  1. 오 스미 움 테 트로 시더 (소4)의 준비
    참고: 이 저자의 연구실은 오 소 4%를 유리 앰 플의 수 용액에 공급 하 고 있습니다 (H2o 의 5 mL 4%). 다른 랩은 오 소4 결정을 성공적으로 사용 했다. 그러나, 몇 시간 자동차에 오 소4 결정을 분해 할 필요가 있다.
    1. 오 소4%의 5 mL (1 개의 앰 플)을 넣고 갈색 유리병에 넣습니다.
      참고: 오 소4 강한 산화 제 이며 빛에 노출에 의해 쉽게 감소. 갈색 유리병에 오 소4 를 배치 하 여 준비 하는 동안 감소를 피할 수 있다
    2. 0.2의 5 mL를 추가 합니다. 오 소4/0.1 M PB의 10ml를 얻을 수 있습니다.
      참고: 신생아 쥐의 뇌는 오 스몰 농도의 변화에 깊이 민감 하기 때문에, 알데하이드 픽스와 오 소4 용액을 준비 하기 위해 동일한 완충 제를 사용 하 여35,36,37
    3. 10 mL의 0.1를 추가로 추가 합니다. 이것은 0.1 m PB의 1% 오 소4 의 20 mL의 최종 용액을 얻을 것 이다.
    4. 긴 바늘이 장착 된 20ml 주사기를 사용 하 여 1% 오 소4 를 그린 후 갈색 유리병 또는 알루미늄 호 일로 덮인 scint 유리병에 넣습니다.
      주의: 오 소4 는 매우 휘발성 이며, 그것의 연기는 코, 눈 및 목에 유독 합니다. 모든 작업은 장갑과 보호 복을 사용 하 여 연기 후드에서 수행 되어야 하며, 어떤 신체 부분은 오 소4에 노출 되어야 한다. 취급 및 폐기물 처리는 교육 기관의 지침에 따라 수행 해야 합니다. 사용 하지 않은 오 소4 를 유리 스 토퍼에 테 프 론 라이너가 있는 단단히 stoppered 갈색 유리병에 보관 하 고, 병을 이중 알루미늄 호 일에 싸서 dessicator에 보관 하십시오. 누출 된 연기의 존재에서, 오 소4 내부 표면과 냉장고의 내용물을 변색 할 수 있다. 위에서 언급 한 저장 조건 하에서 오 소4 용액은 몇 개월 동안 안정 하다. 저장 중에 용액이 산화 되 면 회색으로 켜지 고,이 경우 폐기 해야 합니다.
  2. 시 편 바이 알에 0.1의 1% 오 소4 를 추가 하 고 1 시간 동안 앉으 세요. 오 쏘4 를 마이크로 피 펫으로 1 시간 후에 추출 하십시오.
    참고: 섹션에 소4 를 적용 하기 전에, 시 편을 전개 하 고 평평 하 게 하는 것이 중요 합니다. 시 편의 상단에 직접 적용 하지 말고 바이 알의 벽을 사용 하 여 병4 를 바이 알의 바닥에 부드럽게 떨어 뜨 렸 습니다. 시 편은 오 소4 응용 프로그램 직후 갈색 및 강성이 된다. 조직 손상을 방지 하기 위해 지금부터 부드럽게 처리

5. 헹 굼

참고: 잔류 하는 고정 제가 탈수 제37과 반응할 수 있기 때문에 소 (4 )와 탈수 전에 후 시 편을 헹 구는 것이 중요 합니다.

  1. 3 분 x 3에 대해 0.1 M PB로 헹 궈 냅니다.
    참고: 신생아 쥐의 뇌는 오 스몰 농도의 변화에 깊이 민감 하기 때문에, 고정 혼합물12,35,36,37에 사용 되는 것과 같은 차량에서 세척을 수행 합니다.
  2. 오스뮴 솔루션을 배치 하 고 처음 두 PB에 씻어 오 소4 쓰레기와 기관의 지침에 따라 처분.

6. 우 라 닐 아세테이트로 순차적 탈수 및 염색

참고: 이 저자의 실험실은 포함을 위한 물 비 혼 화성 에폭시 수 지를 사용 합니다. 에폭시 수 지가 사용 될 때, 모든 시 편의 자유 물은 매 립 매 질에 의해 침 윤 되기 전에 유기 용 제로 대체 되어야 한다. 물은 오름차순 에탄올 및 아세톤12의 일련의 용액을 통해 시 편을 통과 시 킴으로써 제거 된다.

  1. 우르 닐 아세테이트 (UA)의 제조
    1. 200 mL 용량 유리 플라스 크를 넣고 교 반 플레이트에 토 에이치 70%의 100 mL를 넣습니다.
    2. 4 g의 UA를 플라스 크에 추가 합니다. 알루미늄 호 일에 싸서 (빛에 노출 되 면 UA 석 출) 연속적으로 저 어.
      참고: UA는 70%에 토에 천천히 그리고 불완전 하 게 녹 습니다. 용액을 사용 하기 전에 용 해 되지 않은 결정이 정착 되도록 하십시오. UA 용액은 사용 전에 0.45 μ m 필터로 여과 해야 합니다. UA는 미리 준비 하 여 수개월 동안 4 ° c에서 알루미늄 호 일로 포장 된 갈색 병에 보관할 수 있다.
      주의: UA는 약간 방사성이 고 독성이 매우 높은 것 이다. UA 분말의 흡입은 위 호흡 기관 무질서 및 폐, 간 및 신장의 질병을 일으키는 원인이 될 수 있습니다. UA는 섭취 할 때 또는 피부와 점 막과 직접 접촉할 때 위험 합니다. 모든 작업은 장갑과 보호복을 사용 하 여 연기 두건에서 수행 해야 합니다. 취급 및 폐기물 처리는 교육 기관의 지침에 따라 수행 해야 합니다.
  2. 50%에 토에의 탈수를 1 분 동안 제거 합니다. UA를 추가 하기 전에 50%의에 토.
  3. 에 토에 70%에 4% UA를 추가 합니다. 1 시간 또는 밤새 앉아 보자. 하룻밤 이면 4 ° c에서 냉장고에 두십시오.
    참고:     에 토 h 증발을 방지 하 고 빛에 노출을 피하기 위해 알루미늄 호 일로 커버 하는 캡 바이 알. 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
    1. 귀하의 교육 기관 지침에 따라 UA 폐기물 및 다음 두 가지 헹 굼을 처분 하십시오.
  4. 1 분 동안에 토에 70%의 탈수.
  5. 5 분간에 토에 90%의 탈수.
  6. 5 분 동안에 토에 100%의 탈수.
  7. 시료를 아세톤에 2 분 x 3으로 헹 구 십시오.

7. 침투 및 임베딩

참고: 조직은 수 지 매트릭스의 추가 지원 없이 얇은 섹션으로 절단 될 정도로 강성이 충분 하지 않습니다. 따라서 침 윤 및 포함은 절편12에 선행 해야 합니다.

  1. EPON 수 지의 제조
    1. 60 mL가 위 주사기를 사용 합니다. 주사기 플런저를 제거 하 고 주사기를 안전 바늘로 캡을 합니다.
    2. 주사기를 열린 면 위로 올려 놓고 수 지 믹스의 각 성분의 부피를 점진적으로 추가 합니다. 812 (수 지) 22 mL를 추가 합니다. 37의 총 부피에 DDSA (경화제)를 추가 합니다. 총 부피 50.5 mL의 NMA (경화제)를 첨가 합니다. 525 μ l의 DMP-30(가속기)를 파이 펫과 함께 첨가 하십시오. DMP가 매우 점성이 있기 때문에 파이 펫의 플런저를 매우 느리게 움직입니다.
      참고: 포함 시 약을 나열 된 순서 대로 추가 하는 것이 중요 합니다. 가속기 (DMP-30)를 마지막에 추가 해야 합니다. 원하는 특성을 갖는 경화 된 블록을 얻기 위해, 경화제 및 가속기의 정확한 양을 사용 하는 것이 중요 하다. 갓 준비 된 매 립 혼합물이 바람직하다.
    3. 플런저를 뒤에 넣고 적어도 30 분 동안 연속 흔들어와 로커에 주사기를 놓습니다. 색상은 노란색에서 황색으로 변경 됩니다.
      참고: 모든 성분은 매우 철저히 혼합 해야 합니다. 그렇게 하지 않으면 조직 표본의 고르지 않은 함 침과 고르지 못한 경도의 블록이 발생 합니다.
  2. 1 부피의 EPON 수 지를 혼합 하 고 1 부피의 아세톤을 scint 바이 알에 넣고 섞어 흔들어 주세요. 1:1 EPON 적용: 마지막 아세톤 린스를 제거한 후 조직 상의 아세톤 혼합물. 아세톤 증발을 방지 하기 위해 덮여 유지. 2-4 h 후에 수 지 및 아세톤의 1:1 혼합물을 제거 하거나 하룻밤 유지.
    참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
  3. 수 지와 아세톤의 혼합물을 전체 수 지로 교체 하십시오. 4 시간 또는 밤새 앉아 보자. 모든 EPON 폐기물을 후드 아래의 컬렉션 컨테이너에 넣어 중 합 하 고 나중에 폐기 한다.
    참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

8. 플랫 임베딩

참고: 표본은 샌드위치 같은 방식으로 두 개의 aclar 필름 사이에 평평 하 게 삽입 됩니다.

  1. 투명 한 아실 시트의 직사각형 조각 2 개를 자릅니다. 70%로 필름을 깨끗 하 게 닦습니다. 섹션의 모든 측면에 최소한 1.5 cm의 티슈 프리 플라스틱이 되도록 시트를 자릅니다. 상단에 있는 aclar 시트는 바닥과 동일한 폭을 가져야 하며 높이는 하단 시트의 약 2/3 여야 합니다.
  2. 표본으로 유리병을 천천히 기울이고 유리병의 바닥에서 조직을 부드럽게 들어올립니다.
  3. 미세 유연한 주걱 및 미세 브러시를 사용 하 여 조심 스럽게 바이 알 벽을 따라 섹션을 이동 하 고 aclar 시트로 이동 합니다.
    참고: 시 편이 손상 되지 않도록 조심 스럽게 섹션을 다루십시오.
  4. 액 슬 시트를 시 편 위에 부드럽게 놓습니다.
    참고: 샌드위치를 봉인 하기 위해 두 시트 사이에 수 지가 충분 한지 확인 하십시오.
  5. 섹션에 직접 압력을가 하지 않고 갇힌 기포를 부드럽게 밀어 냅니다. 여분의 EPON을 닦아.
    참고: 기포의 제거는 그 존재가 시 편의 가시화가 어렵고 수 지 결합의 안정성을 약화 시키기 때문에 중요 합니다.
  6. 솔벤트 내성 펜으로 시트에 라벨을 부착 하 고 오븐에 60 ͦC 2-3 일 동안 중 합 할 수 있습니다.
    참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

9. 캡슐 내장

참고: 울트라 아미로 토 메스는 캡슐에 포함 된 표본에서 얻은 원통형 블록을 고정 하는 척과 함께 제공 됩니다. 원통형 블록은 절편 중에 발생 하는 진동의 영향을 최소한으로 받는 이상적인 형상을가지고 있습니다.

  1. 끼워 넣어진 aclar 필름을 부드럽게 여십시오. 표본은 두 개의 aclar 시트 중 하나에 부착 됩니다.
  2. 섹션을 포함 하는 aclar 시트의 측면을 표시 하는 솔벤트 내성 펜을 사용 합니다. 조직 근처에 표시.
    참고: 관심 있는 조직을 펀칭 하기 전에이 단계를 수행 하는 것이 중요 합니다.
  3. 디스크 펀치를 사용 하 여 단면의 원 샘플을 얻습니다. 펜 마크는 펀칭 아웃 된 조직의 일부 여야 합니다.
  4. 캡슐 홀더에 포함 된 캡슐 면의 뚜껑을 위쪽으로 준비 합니다. 캡에 수 지 한 방울을 놓습니다.
  5. 티슈 섹션이 위로 향하게 하 여 펀치 디스크를 캡 내부에 놓습니다. 빛이 시 편으로 빛나고 있을 때 펜 마크가 반짝입니다.
  6. 캡슐을 캡에 넣고 미세 핀셋을 사용 하 여 라벨을 삽입 합니다. 인쇄 된 2cm 길이의 종이를 캡슐에 넣고 아래쪽으로 롤 합니다. 캡슐의 측면 벽의 곡률에 맞도록 라벨을 만듭니다. 중 합이 완료 될 때까지 기다린 후 라벨이 수 지에 영구적으로 삽입 됩니다.
  7. 캡슐 내부에 포함 수 지를 붓고 캡슐의 가장자리까지 채우십시오.
  8. 뾰족한 나무 막대기의 도움으로 캡슐의 바닥에 조직 표본을 밀어 넣고 2-3 일 동안 60 ° c에서 오븐에 놓습니다.
    참고: 너무 열심히 조직을 누르지 않도록 주의 하십시오, 대신에 매 립 배지의 얇은 층이 조직과 캡슐 표면 사이에 존재 하도록 느슨하게 거짓말을 하자. 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

10. 블록 면 트리밍

참고: 작은 크기와 적절 한 형태의 블록 면은 만족 스러운 절편을 위한 전제 조건입니다. 따라서 시 편 블록의 트리밍이 필요 하다.

  1. 날카로운 한 쪽 면도날을 사용 하십시오. 사용 직전에 아세톤으로 닦아 내 세요.
  2. 블록 홀더에 캡슐 블록을 장착 하 고 블록 홀더를 실체 현미경의 스테이지에 놓습니다.
    참고: 트리밍 절차는 현미경 쌍안경 및 비스듬한 조명 하에서 수행 되어야 합니다.
  3. 면도기 블레이드를 사용 하 여 캡슐의 끝에서 aclar 시트를 제거 하십시오. Aclar 시트는 하 부 범위의 빛 아래에 반짝이는 레이어로 나타납니다.
  4. 면도기 블레이드를 45도 각도로 잡고 캡슐 블록의 네 면을 아래로 자릅니다.
    참고: 블레이드가 양손으로 고정 되어 있으면 트리밍 제어가 더 잘 이루어집니다.
  5. 블록이 약 45 °의 벽 각도와 짧은 피라미드의 형태를 취하는 있도록 짧은 절단을 합니다.
    참고: 그것으로 이어지는 측면이 짧게 유지 하는 경우 시 편 얼굴은 훨씬 더 지원 됩니다. 블록 팁이 너무 얇고 길면 얇은 절편 중에 진동 합니다. 이상적으로, 관심 영역은 블록 면의 중심에 있어야 합니다.
  6. 불필요 한 조직을 버리고 관심 영역을 보존 하기 위해 캡슐의 끝부분을 자릅니다.
    참고: 섹션의 어떤 부분도 조직 없이 해야, 블록 면의 밀도의 변화는 절편에 어려움의 주요 원인. 이상적으로, 캡슐 면의 표면적은 1mm이 하 이어야 한다2.
  7. 부 등변 사다리꼴 모양으로 캡슐 면을 자릅니다. 부 등변 사다리꼴에는 측면이 동일 하기 때문에,이 모양은 시 편의 나머지 부분에 상대적인 관심 영역을 방향으로 하는 것이 가장 좋습니다.
    참고: 절편 중에 사다리꼴 모양의 면은 다른 형상의 것 보다 훨씬 더 잘 지원 됩니다.

11. 마이크로 톰 절편

참고: 대부분의 생물학적 시 편은 전자 빔에 의해 침투 되는 자연 상태에서 너무 두 껍 습니다. 따라서, 재료는 전자 빔에 의해 침투 될 수 있는 얇은 섹션으로 절단 되어야 한다.

  1. 표면에 평행한 평면에서 극 세 (은 간섭 색상, 600-900 Å) 얇은 부분을 잘라냅니다.
  2. 그리드에 단면을 배치 합니다. 이 저자의 연구실은 외경 3.05 mm의 구리 그리드를 사용 합니다.
    참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

12. 우 라 닐 아세테이트를 사용한 후 염색

  1. 증류수에 2% UA를 준비 합니다. 100 mL의 증류수를 함유한 200 mL 부피 유리 플라스 크를 교 반 플레이트에 넣습니다. 2 g의 UA를 플라스 크에 추가 합니다. 알루미늄 호 일에 싸서 (빛에 노출 되 면 UA 석 출) 연속적으로 저 어.
    참고: UA 준비에 대 한 자세한 내용은이 프로토콜의 섹션 6을 참조 하십시오.
  2. 페 트리 디쉬에 깨끗 한 치아 왁 스에 2% UA의 여러 개별 방울을 놓습니다.
  3. 25 분 동안 UA 한 방울에 표본 (단면 면 아래로)을 사용 하 여 그리드를 플 로트 합니다.
    참고: 각 그리드를 별도의 UA 드롭에 띄워 놓습니다.
  4. 핀셋으로 가장자리에 있는 격자를 잡고 플라스틱 세척 병에서 상 온에서 끓인 증류수의 부드러운 제트 아래에 두 번 헹 궈 냅니다.
    참고: 납으로 염색 하기 전에 그리드가 건조 되는 것을 허용 하지 마십시오.

13. 납을 사용한 후 염색

  1. CO2 없는 챔버를 준비 합니다 (공중에서 co2는 납 침전의 주요 원인입니다). 1 N NaOH를 사용 하 여 담가 놓은 여과 지를 페 트리 접시에 넣습니다. 필터 페이퍼 위에 깨끗 한 치과 용 왁 스의 작은 시트를 놓고 접시의 한쪽에 몇 NaOH 펠 릿을 놓습니다. 접시를 덮으 십시오.
    참고: 그리드가 UA로 염색 되기 전에이 설정을 준비 하 여 챔버의 대기는 CO2가 없고 UA 염색이 완료 될 때까지 납 염색을 준비 합니다.
  2. 4% NaOH를 만드십시오. 0.2 g의 NaOH를 증류수 5 mL에 첨가 하십시오.
  3. 사토의 트리플 리드 솔루션을 준비 합니다. 10ml의 납 질 산 0.1 g, 납 시트르산 0.1 g, 납 아세테이트 0.1 g, 구 연산 나트륨의 0.2 g을 유리병에 첨가 한다. 증류수 8.2 mL를 넣고 5 분간 힘차게 흔들어 30 초 동안 초음파 처리 한 다음 갓 만든 4% NaOH의 1.8 mL를 추가 하십시오.
  4. 배양 접시의 왁 스에 사토 리드의 몇 방울을 놓습니다.
  5. 리드 방울에 UA (단면 면 아래로)로 얼룩진 격자를 놓습니다.
    참고: 각 그리드는 별도의 잠재 고객 드롭에 떠 있어야 합니다. 각 드롭은 그리드를 측면에서 아래로 슬라이딩 하는 대신 드롭 돔의 상단에 떠 있게 할 수 있을 정도로 작습니다.
  6. 접시를 덮고 5 분간 얼룩을 주세요.
  7. 집게와의 가장자리에 격자를 잡고 플라스틱 세척 병에서 상 온에서 끓인 증류수의 부드러운 제트에서 철저히 씻으십시오.
  8. 여과 지의 그리드를 건조 하 고 그리드를 보관 하십시오.
    참고: 단면이 필터 용지와 직접 접촉 하지 않는지 확인 하십시오.

결과

TEM에 대 한 시 편의 만족 또는 결함 보전을 나타내는 것으로 대부분 인정 되는 일반 기준이 확립 되었다. 이러한 기준은 4 개의 선택 된 전자 현미경 (최적의 제제의 두 가지 예, 결함 있는 제제의 두 가지 예)에서 예시 되는데,이는이 프로토콜에 기재 된 방법에 따라 젊은 쥐 뇌 조직을 치료 함으로써 얻어진 다.

일반적으로, 상 질 전자 현미경 사진은 질서 있는, 독특하고 전반?...

토론

TEM에 대 한 표본 준비 중 조직 섹션의 처리는 상당한 기교, 집중력 및 인내심을 필요로 합니다. 마이크로 파이 펫을 사용 하 여 용액을 추가 하 고 제거 하는 경우, 시 편은 표면 장력에 의해 피 펫 팁으로 빨려 들어갈 수 있으므로 파이 펫에의 한 조직 손상을 방지 하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 또한, 탈수 서 열의 특정 단계는 1 분으로 빨리 할 수 있으므로 작업자는 다음 탈수 단계가 시간에 ?...

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

이 원고는 NIH/니 치 K08 123321에 의해 지원 되었다 (N.L.에) 및 버지니아 대학의 마 취 학과에서 자금. 저자는 Alev Erisir에 게 감사를 기원 합니다 (생물학과 버지니아의 대학, 샤 러 츠 빌, VA)에 대 한 우수한 교육과 기술 지원을 위한 TEM, 그리고 그녀의 귀중 한 원고 비판. 저자는 또한 시 편 절편 및 사후 염색에 대 한 기술 지원을 위해 버지니아 대학의 고급 전자 현미경 검사 시설에 감사 드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
4% Osmium tetroxideElectron Microscopy Sciences19170acqueous
50% GlutaraldehydeElectron Microscopy Sciences16310EM grade, acqueous
Aclar 33 C embedding filmElectron Microscopy Sciences50425-257.8 mil thickness, size 8"x10"
BEEM capsule holderElectron Microscopy Sciences69916holds size "00" capsules
BEEM embedding capsulesElectron Microscopy Sciences70021size "00", flat
Butler block trimmerElectron Microscopy Sciences69945-01
Camel hair paint brushElectron Microscopy Sciences65576-01
Disc punchElectron Microscopy Sciences77850-09
Embed 812 kitElectron Microscopy Sciences14120
Lead acetateElectron Microscopy Sciences17600
Lead citrateElectron Microscopy Sciences17800
Lead nitrateElectron microscopy Sciences17900
Leica UC7 ultracut microtomeLeica
Micro scaleElectron Microscopy Sciences62091-23
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences19208EM grade, granular
Precision Thelco laboratory ovenThelco51221159
Sodium azideSigma-AldrichtS2002
StatMark penElectron Microscopy Sciences72109-01
Tyrode solutionElectron Microscopy Sciences11760-05
Uranyl acetateElectron Microscopy Sciences22400powder

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