Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نقدم العديد من الطرق البسيطة لتقييم الجدوى والموت في كروية الخلايا السرطانية ثلاثية الأبعاد، والتي تحاكي التدرجات الفيزيائية الكيميائية للأورام الحية أفضل بكثير من الثقافة 2D. نموذج كروي, وبالتالي, يسمح تقييم فعالية المخدرات السرطان مع تحسين الترجمة إلى في ظروف الجسم الحي.

Abstract

الكرويات ثلاثية الأبعاد من الخلايا السرطانية هي أدوات هامة لكل من شاشات المخدرات السرطان واكتساب البصيرة الميكانيكية في بيولوجيا الخلايا السرطانية. قوة هذا الإعداد يكمن في قدرتهعلى تقليد العديد من جوانب الظروف في الجسم الحي من الأورام في حين يجري سريعة ورخيصة، وتنوعا بما فيه الكفاية للسماح فحص عالية الإنتاجية نسبيا. يمكن أن تلخص ظروف الثقافة الكروية التدرجات الفيزيائية الكيميائية في الورم، بما في ذلك الحموضة خارج الخلايا المتزايدة، وزيادة اللاكتات، وتقليل توافر الجلوكوز والأكسجين، من محيط كروي إلى جوهره. أيضا، يتم تقليد الخصائص الميكانيكية والتفاعلات خلية الخلية من الأورام في الجسم الحي جزئيا من قبل هذا النموذج. خصائص محددة، وبالتالي ظروف النمو الأمثل، من كروية 3D، تختلف على نطاق واسع بين أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية. وعلاوة على ذلك، فإن تقييم صلاحية الخلايا والموت في الكرويات ثلاثية الأبعاد يتطلب أساليب تختلف جزئياً عن تلك المستخدمة في الثقافات ثلاثية الأبعاد. هنا نحن وصف عدة بروتوكولات لإعداد كروية 3D من الخلايا السرطانية، واستخدام هذه الثقافات لتقييم قدرة الخلايا على البقاء والموت في سياق تقييم فعالية الأدوية المضادة للسرطان.

Introduction

استخدام نماذج متعددة الخلايا كروية في علم الأحياء السرطان هو عدة عقود من العمر1,2, ولكن اكتسبت زخما كبيرا في السنوات الأخيرة. وهذا يعكس إلى حد كبير زيادة الوعي بمدى قوة النمط الظاهري للخلايا السرطانية يعتمد على بيئتها الدقيقة وظروف نموها المحددة. البيئة الدقيقة في الأورام الصلبة تختلف اختلافا جوهريا عن تلك التي في الأنسجة العادية المقابلة. ويشمل ذلك الظروف الفيزيائية الكيميائية مثل درجة الألف الألف، وتوتر الأكسجين، وكذلك الضغط الخلالي، وتدرجات تركيز العوامل القابلة للذوبان مثل المواد الغذائية، ومنتجات النفايات، ومركبات الإشارات المفرزة (عوامل النمو، السيتوكينات). وعلاوة على ذلك، فإنه يشمل تنظيم المصفوفة خارج الخلية (ECM)، والتفاعلات الخلية الخلية والإشارات بين الخلايا، وجوانب أخرى من العمارة ثلاثية الأبعاد (3D) معينة للورم3،4، 5,6. الظروف البيئية الدقيقة المحددة التي توجد فيها الخلايا السرطانية، تؤثر بشكل عميق على ملامح التعبير الجيني والخصائص الوظيفية، ومن الواضح أنه، بالمقارنة مع تلك التي تنمو في الخلايا 2D، والنمط الظاهري من كروية 3D يحاكي عن كثب أن من الأورام في الجسم الحي7،8،9،10،11. نماذج 2D، حتى لو كانت تستخدم نقص الأكسجة، الحموضة الحمضية، والتركيزات اللاكتات عالية لتقليد الجوانب المعروفة من البيئة الدقيقة الورم، لا تزال تفشل في التقاط تدرجات المعلمات الفيزيائية الكيميائية الناشئة داخل الأورام، فضلا عن ورمها 3D الهندسه المعماريه. من ناحية أخرى، النماذج الحيوانية مكلفة، بطيئة، وإشكالية أخلاقيا، وعموما، لديها أيضا أوجه القصور في قدرتها على تلخيص ظروف الورم البشري. وبالتالي، تم تطبيق كرويات ثلاثية الأبعاد كنموذج تعقيد متوسط في دراسات مجموعة واسعة من خصائص معظم أنواع السرطان الصلبة9،11،12،13، 14,15,16,17.

استخدام المستخدمة على نطاق واسع من كروية 3D هو في فحص الاختبارات من فعالية العلاج بالسرطان9,18,19,20. الاستجابات العلاجية حساسة بشكل خاص للورم الميكروي، مما يعكس كل من تأثير التقصير، والانتشار المقيد، والضغط الخلالي العالي، ودرجة الحموضة البيئية الحمضية على تسليم الأدوية، وتأثير نقص الأكسجة وغيرها جوانب من البيئة الدقيقة على استجابة موت الخلية9,17. لأن البيئة داخل كروية 3D يتطور بطبيعتها كل هذه الخصائص7،8،9،10،11، يمكن توظيف الثقافات خلية 3D تحسين ترجمة النتائج إلى ظروف حية بشكل كبير، مع السماح بكفاءة وبأسعار معقولة عالية الإنتاجية الفرز من صافي النمو. ومع ذلك، لا تزال الغالبية العظمى من الدراسات على استجابة المخدرات من الخلايا السرطانية تجري في ظل ظروف 2D. وهذا يعكس على الأرجح أنه، في حين أن بعض الاختبارات يمكن تنفيذها بسهولة نسبيا لثقافات الخلايا 3D، وكثير، مثل اختبارات البقاء، والنشاف الغربية، وتحليل الفلور المناعي، يتم القيام به بشكل مريح أكثر بكثير في 2D مما كانت عليه في 3D.

والهدف من العمل الحالي هو توفير الفحوصات والبروتوكولات الدقيقة سهلة الملاءمة لتحليل تأثير العلاج بالأدوية المضادة للسرطان على قدرة الخلايا السرطانية على البقاء على قيد الحياة في بيئة محاكاة للورم ثلاثي الأبعاد. وعلى وجه التحديد، نقدم ونقارن ثلاث طرق مختلفة لتشكيل كروي، تليها طرق للتحليلات النوعية والكمية للنمو، والقدرة على البقاء، والاستجابة للمخدرات.

Protocol

1. جيل من الكرويدات

  1. إعداد تعليق الخلية لتشكيل كروي
    ملاحظة:     خطوط الخلايا المختلفة لها خصائص التصاق مختلفة جداويجب أن يتم تأسيس بروتوكول تشكيل كروية مناسبة في كل حالة. لقد وجدنا أن خلايا MCF-7 و BxPC-3 مناسبة لتشكيل كرويتلقائي، في حين أن MDA-MB-231، SKBr-3، Panc-1 و MiaPaCa تتطلب إضافة غشاء الطابق السفلي المعاد تشكيله لتشكيل كروية بنجاح. فقط MDA-MB-231 وBxPC-3 الخلايا قد استخدمت لبروتوكول إسقاط شنقا، ولكن خطوط الخلايا الأخرى تنطبق بالتأكيد.
    1. تنمو الخلايا كطبقة واحدة حتى 70-80% confluency.
    2. الخلايا المزودة بمحلول ملحي من الفوسفات (1× PBS، 5 مل ل25 سم2 أو 10 مل لقارورة 75 سم2)، إضافة انزيم فصل الخلية (0.5 مل ل 25 سم2 أو 1 مل ل75 سم2 قارورة) واحتضان الخلايا لمدة 2-5 دقيقة في 37 درجة مئوية في 5% ثاني2 و 95% رطوبة.
    3. تحقق من مفرزة الخلية تحت المجهر وتحييد انزيم الخلايا المنفصلة عن طريق إضافة متوسط النمو (6-10٪ مصل اعتمادا على خط الخلية) إلى حجم إجمالي 5 مل في 25 سم2 أو 10 مل ل75 سم2 قارورة.
    4. استخدام غرفة Bürker لحساب الخلايا وحساب 8 مربعات في غرفة لكل إعداد الخلية للحصول على استنساخ عالية من حجم الكرويات.
      ملاحظة: وترد أدناه ثلاثة بروتوكولات تصف كل طريقة مختلفة لتشكيل كروية. ويمكن استخدام البروتوكولين 1-2 و1-3 في جميع البروتوكولات التحليلية اللاحقة المقدمة، في حين أن البروتوكول 1-4 هو الأنسب لتضمين الاستعدادات والتجهيز. اعتمادا على خط الخلية، وتشكيل كروي ة يستغرق 2-4 أيام، بغض النظر عن الطريقة المستخدمة.
  2. تشكيل كروي تلقائي
    1. تنفيذ الخطوات 1.1.1-1.1.4.
    2. تمييع تعليق الخلية في أنبوب 15 مل للحصول على 0.5-2 X 104 خلايا / مل (الكثافة المثلى للخلايا يجب أن تحدد لكل خط خلية) (الشكل1ألف '2').
    3. ملء الحلقة الخارجية من الآبار مع 1X PBS أو متوسط النمو للحد من التبخر من الآبار المتبقية. نقل تعليق الخلية إلى خزان معقم، وباستخدام ماصة متعددة القنوات، اغنى 200 ميكرولتر/بئر إلى لوحات سفلية مستديرة ذات 96 بئر مرفقة منخفضة للغاية (الشكل1ألف '3').
    4. احتضان لوحة في حاضنة في 37 درجة مئويةمع 5٪ ثاني 2، 95٪ الرطوبة.
    5. كل 2-3 أيام الحصول على الصور المجهرية الخفيفة من كروية.
      ملاحظة: يتم التقاط الصور في هذه الورقة في التكبير 11.5x، وهو مناسب لمعظم كروية أعدت باستخدام هذه البروتوكولات.
    6. كل 2-3 أيام (بعد الحصول على الصور) استبدال 100 μL المتوسطة (إزالة 100 μL من المتوسط قضى واستبدال مع 100 ميكرولتر من المتوسطة الطازجة.
      ملاحظة: لتجنب إزالة الكرويات عند استبدال المتوسطة، فإنه من المستحسن لإمالة لوحة قليلا ً في حين إزالة ببطء المتوسطة وفحص المتوسطة يستنشق في نصائح لكرويدات مرئية قبل التخلص منها.
  3. إعادة تشكيل غشاء القبو بوساطة تشكيل كروي.
    ملاحظة:     تم استخدام اللاكتوز dehydrogenase ارتفاع فيروس (LDEV) خالية من انخفاض معامل النمو غشاء الطابق السفلي (rBM). rBM حساسة لدرجة الحرارة، وينبغي أن تبقى دائما على الجليد، كما أنها سوف تتخثر إذا وصلت إلى 15 درجة مئوية. قم بذوبان rBM على الجليد إما بين عشية وضحاها عند درجة حرارة الغرفة أو 2-4 ساعات في درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الطلاء.
    1. ثوّم [ربم] على جليد (رأيت طاولة ال [متريلس]).
    2. احتفظ بالألواح والخزانات (إذا كانت ملفوفة بشكل فردي) على الجليد قبل الاستخدام.
    3. تنفيذ الخطوات 1.1.1-1.1.4.
    4. ملء الحلقة الخارجية من الآبار مع 1X PBS أو متوسط النمو للحد من التبخر من الآبار المتبقية. تمييع تعليق الخلية في أنبوب 15 مل للحصول على 0.5-2 X 104 خلايا / مل (الكثافة المثلى للخلايا يجب أن تحدد لكل خط خلية) (الشكل1ألف '2').
    5. ضع أنبوب 15 مل الذي يحتوي على تعليق الخلية المخفف على الجليد (على سبيل المثال، في كوب زجاجي) (الشكل1A (iia)).
    6. نقل الألواح المبردة والخزانات إلى غطاء محرك السيارة. شطف الحاويات البلاستيكية، وملء لهم مع الجليد ونقلها إلى غطاء محرك السيارة للسماح لوحات والخزانات لوضعها على الجليد خلال العملية بأكملها.
    7. إعادة تعليق rBM بلطف لضمان هلام متجانسة.
    8. إضافة 1-2٪ rBM (التركيز الأمثل يحتاج إلى تحديد لكل خط خلية) إلى تعليق الخلية المبردة (الشكل1ألف (iib)).
    9. عكس أنبوب 15 مل لضمان الخلط السليم من rBM وتعليق الخلية قبل الاستغناء عن تعليق في لوحة.
    10. نقل تعليق الخلية التي تحتوي على rBM إلى خزان معقم وصرف 200 ميكرولتر/بئر إلى لوحات مبردة منخفضة جداً 96 بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات (الشكل1ألف '3').
      ملاحظة: إذا كان العمل مع تعليق الخلية عدة (على سبيل المثال، أكثر من خط خلية)، فمن الضروري الاستغناء عن كل تعليق الخلية مباشرة بعد إضافة rBM لمنع التبلور المبكر.
    11. جهاز طرد مركزي لوحة لمدة 15 دقيقة في 750 x ز باستخدام 'لينة لائق'/ لا الكبح (إذا كان ذلك ممكنا، والطرد المركزي في 4 درجة مئوية للحفاظ على السائل rBM أطول ولكن ليس شرطا لتشكيل كروية ناجحة)، لضمان أن يتم تجميع الخلايا معا عندما rBM تصلب ، وتسهيل تشكيل كروية واحدة واحدة.
    12. احتضان لوحة في حاضنة (37 درجة مئوية،5٪ ثاني 2، 95٪ الرطوبة).
    13. كل 2-3 أيام الحصول على الصور المجهرية الخفيفة لتقييم النمو كروي.
    14. كل 2-3 أيام استبدال 100 μL المتوسطة (إزالة 100 ميكرولتر واستبدل مع 100 ميكرولتر من المتوسطة الطازجة).
  4. تعليق قطرة كروية.
    1. تنفيذ الخطوة 1.1.1-1.1.4.
    2. خلايا مخففة للحصول على تخفيف مناسب. والتخفيف العملي هو 50،000 خلية / مل.
    3. إزالة غطاء طبق ثقافة خلية 10 سم2 ووضعها حتى أنه يواجه صعودا. أضف 6 مل من 1x PBS إلى الطبق (الشكل 1B (ط)).
    4. صب تعليق الخلية في خزان معقم ووضع بعناية تصل إلى 30 قطرات من 40 ميكرولتر من تعليق الخلية على غطاء طبق ثقافة الخلية باستخدام ماصة متعددة القنوات (الشكل1B '2))،مما أدى إلى تركيز 2،000 خلية / قطرة. تجنب وضع قطرات قريبة جدا من حافة الغطاء وهذه قطرات هي أكثر عرضة لتفقد التوتر السطحي عند عكس الغطاء في الخطوة التالية.
    5. عكس الغطاء في حركة سريعة ولكن تسيطر عليها ووضعها على رأس 1X PBS التي تحتوي على طبق الخلية الثقافة (الشكل 1B '3').
    6. ضع الطبق في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5% ثاني أكسيد الكربون2 و95% الرطوبة دون إزعاج قطرات وتركها تنمو لمدة 4-6 أيام.
    7. إذا كان لاستخدامها لlysates البروتين أو التضمين، تجمع كروية عن طريق إزالة الغطاء وإمالة ذلك، من أجل غسل قطرات مع 1 مل من المتوسطة ساخنة. نقل المتوسط الناتج ة تحتوي على كروية إلى أنبوب 1.5 مل والسماح لهم ليستقر إلى أسفل الأنبوب. المضي قدما كما هو موضح في 4.4 و 6.2.2 لlysates البروتين وتضمينها، على التوالي.

2. علاج الزبة

ملاحظة: ويمكن تطبيق العلاج الطويل الأجل للمخدرات على الكروية من أجل فحص آثار المخدرات ذات الأهمية. قبل البدء في العلاج بالعقاقير ، من المستحسن إجراء تجربة استجابة الجرعة للدواء (الأدوية) ، من أجل العثور على جرعة مناسبة للعلاج التجريبي. يجب أن تستند الجرعات علىIC 50 /Ki المحددة من المخدرات وتتراوح من حوالي 0.2x-10x من هذه القيمة.

  1. إعداد 6-12 كروية لكل حالة المطلوب كما هو موضح في 1.2 أو 1.3 ومكان في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ ثاني2،95٪ الرطوبة) لمدة 2 أيام.
  2. في اليوم الثاني، خذ صورًا مجهرية خفيفة للكرويدات.
  3. إعداد جرعات العلاج الأولى (بعد الحصول على الصور).
    ملاحظة: يجب أن يكون تركيز العلاج الأول ضعف التركيز النهائي المطلوب حيث سيتم تخفيف المحلول 1:2 عند إضافة إلى وسط 100 ميكرولتر الذي يحتوي على البئر. الفترات المقترحة لعلاج المخدرات (سوف تعتمد على نصف عمر المخدرات): اليوم 2 و 4 و 7.
  4. باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بإزالة 100 ميكرولتر من المتوسط واستبدالها بـ 100 ميكرولتر من الأدوية التي تحتوي على متوسط.
  5. ضع لوحة 96 بئر مرة أخرى في الحاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني2 و 95٪ الرطوبة وتكرار 2.3 و 2.4 في الأيام المختارة من العلاج ولكن الآن دون مضاعفة الجرعة للحصول على الجرعة النهائية الصحيحة.
  6. في اليوم الأخير من الجدول الزمني للبروتوكول / العلاج، واحد أو عدة من الاختبارات التالية يمكن إجراء.

3. خلية قابلية الثبات للكرويرويدات

  1. إعداد 4-6 كروية لكل حالة المطلوب كما هو موضح في 1.2 أو 1.3 ووضع في الحاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني2 و 95٪ الرطوبة.
    ملاحظة: وفي هذه الحالة، تم إجراء فحص مدى بقاء الخلية في اليوم 7 أو 9، بعد رصد نمو كروي كل يومين إلى ثلاثة أيام بواسطة المجهر الضوئي كما هو موضح أعلاه (النقطة 1-2-5 و1-3-13).
  2. قم بذوبان الكاشف القابلة للبقاء (انظر جدولالمواد) والسماح لها بالتوازن إلى RT قبل الاستخدام.
  3. اخلطي بلطف عن طريق المقلوب للحصول على حل متجانس.
  4. قبل إجراء الإنقازات، قم بإزالة 50% من الوسط الثقافي من الكرويات (100 ميكرولتر).
  5. إضافة الكاشف خلية قابلية البقاء لكل بئر بنسبة 1:3 إلى كمية من المتوسط الحاضر في البئر (الشكل 2A '1') للوحة 96 جيدا، إضافة 50 ميكرولتر من الكاشف إلى 100 μL من المتوسطة.
  6. اخلط المحتويات بقوة لمدة 5 دقائق للحث على تَرَكُس الخلايا (الشكل 2أ (2)).
  7. احتضان لمدة 25 دقيقة في RT لتحقيق الاستقرار في إشارة الانارة (الشكل 2ألف '3').
  8. تسجيل الإشارة الانارة (الشكل 2أ (4)).

4. إعداد الليسات البروتين لبقع الغربية من الثقافات كروية 3D

ملاحظة: عند جمع الكرويات، فإنه من المستحسن استخدام ماصة P200 وقطع نهاية الطرف للسماح بفتح أكبر وبالتالي التقاط أسهل من كرويرويدس دون إزعاج هيكلها.

  1. لكل حالة، تجمع ما لا يقل عن 12، من الناحية المثالية 18-24 كروية (اعتمادا على حجم كروي) في أنبوب 1.5 مل (تجنب 2 أنابيب مل، كما الخطوات التالية سوف تصبح أكثر صعوبة بسبب أسفل مدبب أقل).
    ملاحظة: إذا كان مقدار متوسط يتجاوز 1.5 مل قبل بعد أن جمعت جميع كروية، والسماح للكرويدات التي تم جمعها لتسوية في الجزء السفلي (يحدث بسرعة كبيرة، الطرد المركزي غير ضروري) وتجاهل نصف حجم الأنبوب قبل الاستمرار في جمع الكرويات المتبقية.
  2. وضع أنابيب على الجليد والسماح للكروية ليستقر في الجزء السفلي من أنبوب 1.5 مل.
  3. الانتقال من مختبر الخلية المعقمة إلى المختبر العادي.
  4. غسل كروية مرتين في 1 مل من الجليد الباردة 1X PBS. السماح كرويرويدس تسوية قبل إزالة 1X PBS بين كل خطوة الغسيل.
  5. استنشق أكبر عدد ممكن من 1X PBS دون إزعاج أو إزالة الكرويات.
  6. إضافة 5 μL من العازلة lysis ساخنة (LB) مع مثبطات الفوسفاتيز والبروتياز، لكل كروية (على سبيل المثال، 10 كروية = 50 ميكرولتر LB).
  7. كرر فترات الدوامة تليها تدور إلى أسفل حتى يتم حل كروية. أداء دورة من الدوامة لمدة 30 s تليها التمركز (تدور سريعة باستخدام جهاز طرد مركزي الطاولة كافية) لمدة 10 ق لحوالي 5-10 دقيقة اعتمادا على حجم والحجم والحجم من كروية.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا. حافظ على الليسات عند -20 درجة مئوية حتى يتم تنفيذ هاونشن، تجانس، وتحديد البروتين كما هو الحال في بروتوكول lysate البروتين 2D القياسية، تليها النشاف الغربية باستخدام البروتوكولات القياسية.

5. الببوبيديوم يوديد (PI) تلطيخ من كروية

  1. إعداد 3-6 كروية لكل حالة المطلوب كما هو موضح في 1.2 أو 1.3 ووضع في الحاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني2 و 95٪ الرطوبة.
  2. في مختبر معقم لزراعة الخلايا، قم بتسخين 1x PBS إلى 37 درجة مئوية.
  3. جعل حل PI من 4 ميكرومتر عن طريق تمييع حل الأسهم في 1X PBS: تمييع 1 مغ / مل مخزون مائي من PI 1:350 في 1X PBS.
    ملاحظة: وسيتم تخفيض هذا التركيز إلى النصف عند إضافة الحل إلى الآبار مع التركيز النهائي من 2 ميكرومتر.
    تحذير: يجب التعامل مع اليود (PI) في غطاء الدخان وارتداء القفازات. PI حساسة للضوء. حماية من الضوء عند التعامل معها.
  4. إزالة 100 ميكرولتر من المتوسط من كل بئر في لوحة 96 جيدا دون إزالة الكرويات.
  5. اغسل الوسيط المتبقي بإضافة 100 ميكرولتر من 1x PBS ساخنة لجميع الآبار تليها إزالة 100 ميكرولتر من السائل في الآبار. كرر هذه الخطوة الغسيل 3 مرات.
  6. إضافة 100 ميكرولتر من حل PI لكل بئر، وتغطية لوحة في رقائق الألومنيوم ووضعها في حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني2 و الرطوبة 95٪ لمدة 10-15 دقيقة.
  7. كرر 3 خطوات الغسيل الموصوفة في 4.5 لغسل حل PI، من أجل تقليل إشارة الخلفية عند التصوير.
  8. استخدام المجهر الفلوري لتصوير كروية. لتقييم قابلية بقاء الخلايا في جوهر كروي تأخذ z-stacks للحصول على الصور مع أعماق متفاوتة من كروي.
    ملاحظة: من المستحسن أن يكون حجم الخطوة حوالي 18-35 ميكرومتر بين كل شريحة اعتمادا على حجم كروي، وإعطاء ما يقرب من 11-18 مداخن لكل كروية. يمكن معالجة Z-stacks في ImageJ باستخدام وظيفة الإسقاط z، والتي يمكن أن تجمع بين جميع z-stacks في صورة نهائية واحدة، وإعطاء لمحة عامة عن تلطيخ في جميع أنحاء كروي (لمزيد من المبادئ التوجيهية حول استخدام ImageJ لهذا الغرض، انظر (https://imagej.net/Z-functions).

6. تضمين الأغصان ثلاثية الأبعاد

  1. إعداد هلام الأجاروز التي يتم تضمين كروية (فقط أول مرة ضرورية أداء البروتوكول).
    1. اخلط 1 جم من الباكتوجار في 50 مل من ddH2O.
    2. سخني ببطء في فرن الميكروويف حتى يذوب الباكتوجار ويتشكل هلام متجانس. لا تسمح يغلى الجل.
    3. حافظ على الباكتوجار دافئاً في حمام مائي عند 60 درجة مئوية.
    4. حافظ على درجة حرارة 4 درجة مئوية بين التجارب.
  2. تضمين الأغصان.
    1. في اليوم 1، لكل حالة، تجمع ما لا يقل عن 12 كروية في أنبوب 1.5 مل.
    2. اغسل مرة واحدة مع 1 مل من الجليد الباردة 1X PBS.
    3. لإصلاح الكرويات، إضافة 1 مل من 4٪ بارافورمالديهايد.
      ملاحظة: وينبغي أن يتم التعامل مع البارافورمالديهايد في غطاء محرك الدخان.
    4. دعهم يحضنون لمدة 24 ساعة في RT.
    5. في اليوم الثاني، قم بتسخين هلام الأغاروز بعناية عن طريق وضعه في كوب مملوء بالماء في فرن ميكروويف. تأكد من أن الجل لا يغلي! يُحفظ دافئاً في طبق تسخين على سطح الطاولة، عند 60 درجة مئوية حتى يصبح للاستخدام.
    6. غسل كروية مرتين مع 1 مل من الجليد الباردة 1X PBS.
    7. يستنشق معظم 1X PBS (ترك ما يقرب من 100 ميكرولتر في هذه المرحلة هو عملي للتعامل مع كروية).
    8. إعداد ماصة 20 μL عن طريق قطع طرف ماصة في منحدر للحصول على طرف أكثر نقطة مع ثقب أكبر (انظر التوضيح).
      ملاحظة: الجزء التالي يجب القيام به بسرعة لضمان نقل كروي الأمثل وتجنب صلابة قطرة هلام. إذا لم تتوفر كتلة التدفئة، فمن المستحسن أن أول التقاط كروية ثم جعل قطرة أجاروز (أي، تبديل ترتيب النقاط 6.2.9 و 6.2.10).
    9. جعل قطرة هلام أجاروز على شريحة المجهر. ضع الشريحة على كتلة التدفئة الدافئة لمنع agarose من ترسيخ.
    10. باستخدام تلميح الماصة المعدل (انظر 6.2.8)، التقط أكبر عدد ممكن من الأغصان في حجم 15-20 ميكرولتر.
    11. حقن بعناية 15-20 ميكرونلتر كروية تحتوي على 1X PBS في وسط قطرة هلام أجاروز دون لمس الشريحة المجهر.
      ملاحظة: وهذه نقطة صعبة بعض الشيء. سيتم فقدان الكرويات إذا كان طرف الماصة يلمس شريحة المجهر عند حقن الكرويدات في قطرة هلام. فمن المستحسن ممارسة عملية كاملة من جعل قطرة الأغاروز وحقن الكروية عن طريق حقن سائل ملون في قطرة. وهذا سوف يسمح تصور اختراق محتمل من خلال قطرة، كما السائل الملونة سوف يكون تسرب إلى الشريحة.
    12. دع هلام الأغاروز يصلب باحتضان لمدة 5-10 دقيقة في RT أو عند 4 درجة مئوية. مرة واحدة وقد ترسخت قطرة هلام إلى حد ما (ولكن لا يزال لينة إلى حد ما)، ودفع بعناية قطرة هلام من الشريحة المجهر في كاسيت الأنسجة البلاستيكية مع مشرط.
    13. تغطية أشرطة الأنسجة البلاستيكية في 70٪ الإيثانول.
      ملاحظة: عند هذه النقطة يمكن استخدام كروية مباشرة أو تخزينها لعدة أشهر.
    14. قم بتضمين الكروية المدمجة بالأغروس في البارافين، والقسم إلى شرائح طبقة سميكة 2-3 ميكرومتر وصمة عار مع الهيماتوكسيلين وإيوسين أو تخضع لتلطيخ مناعية- هيستوري.

النتائج

اختبارات النمو كروية على أساس بروتوكول تشكيل كروية موضحة تخطيطيا في الشكل 1ألف والشكل 1B، واستخدمت كنقطة انطلاق لتحليل آثار العلاجات المضادة للسرطان المخدرات في ورم 3D محاكاة الإعداد. السهولة التي يتم تشكيل هاون الكروية هو خط الخلية محددة...

Discussion

وقد ثبت استخدام كرويرويدال الخلايا السرطانية 3D أداة قيمة وتنوعا ليس فقط لفحص المخدرات المضادة للسرطان، ولكن أيضا للحصول على البصيرة الميكانيكية في تنظيم موت الخلايا السرطانية والقدرة على البقاء في ظل ظروف تحاكي تلك الموجودة في الورم الصغرى البيئة. وهذا أمر حاسم بشكل خاص حيث تتأثر تأثيرا...

Disclosures

ولم يعلن أصحاب البلاغ عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

ونحن ممتنون لكاترين فرانكلين مارك وأنيت بارتلز للمساعدة التقنية الممتازة وأسبيورن نور-نيلسن لإجراء التجارب في الشكل 1D. تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة إينار ويلمسن، ومؤسسة نوفو نورديسك، ومؤسسة جوشوم (جميعها إلى SFP).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI)Invitrogen# C10595 For staining nuclei
5-Fluorouracil (5-FU)Sigma-Aldrich#F6627Component in chemotherapeutic treatment
5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA)Life Technologies#E3111Inhibitor of NHE1
Antibody against PARP and cPARPCell signaling#9542Used in western blotting
Antibody against Ki-67Cell signaling#9449Used for IHC
Antibody against p53Cell Signaling #2524 Used for IHC
Antibody against β-actinSigma A5441Used in western blotting
BactoagarBD Bioscience#214010Used for agarose gel preparation
Benchmark protein ladderInvitrogen#10747-012Used for SDS-PAGE
Bio-Rad DC Protein Assay kitBio-Rad Laboratories#500-0113, #500-0114, #500-0115  Used for protein determination from lysates
Bürker chamberMarienfeld610311For cell counting 
BX63 epifluoresence microscopeOlympusUsed for fluorescent imaging
CellTiter-Glo 3D Cell Viability AssayPromega#G9681Used for the cell viability assay
CisplatinSigma-Aldrich#P4394 Component in chemotherapeutic treatment
Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom,  Ultra-low attachment, With lid, SterileCorning#4520Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point
Corning 96 well, clear round bottom,  Ultra-low attachment microplate, With lid, SterileCorning#7007Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point
Criterion TGX Precast GelsBio-Rad5671025Used for SDS-PAGE
DoxorubicinAbcam#120629Component in chemotherapeutic treatment
FLUOStar Optima Microplate readerBMG LabtechUsed for recording luminescence 
Formaldehyde VWR Chemicals #9713.1000 Used for cell fixation
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixGibco#A1413202Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol.
Heat-inactivated FBSSigma#F9665Serum for growth media
ImageJNIHScientific Image analysis
Medim Uni-safe casetteMedim Histotechnologie10-0114Used for storage of embedded spheroids
Mini protease inhibitor cocktail tabletsRoche Diagnostics GmBH # 11836153001Used for lysis buffer preparation
MZ16 microscopeLeicaUsed for light microscopic images
NuPAGE LDS 4x Sample Buffer Invitrogen#NP0007Used for western blotting
Pierce ECL Western blotting substrateThermo scientific#32106Used for western blotting
Ponceau SSigma-Aldrich#P7170-1LUsed for protein band staining
Prism 6.0GraphpadScientific graphing and statistical software
Propidium iodide (1mg/ml solution in water)Invitrogen P3566Light sensitive 
Sterile reservoirs, multichannelSPL lifesciences21002Used for seeding cells for spheroid formation
Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide Menzel-Gläser#J3800AMNZMicroscope glass slide used for embedding
TamoxifenSigma-Aldrich#T5648Used as chemotherapeutic treatment
Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranesBio-Rad#170-4159Used for western blotting
Tris/Glycine/SDS running buffer Bio-Rad #161 0732Used for SDS-PAGE
Trypsin-EDTA solutionSigma#T4174 Cell dissociation enzyme

References

  1. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
  2. Mueller-Klieser, W., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Influence of glucose and oxygen supply conditions on the oxygenation of multicellular spheroids. British Journal of Cancer. 53 (3), 345-353 (1986).
  3. Gaedtke, L., Thoenes, L., Culmsee, C., Mayer, B., Wagner, E. Proteomic analysis reveals differences in protein expression in spheroid versus monolayer cultures of low-passage colon carcinoma cells. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4111-4118 (2007).
  4. Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS Genetics. 4 (12), 1000293 (2008).
  5. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  6. Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30 (3), 247-255 (2003).
  7. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews in Molecular and Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  8. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  9. Jacobi, N., et al. Organotypic three-dimensional cancer cell cultures mirror drug responses in vivo: lessons learned from the inhibition of EGFR signaling. Oncotarget. 8 (64), 107423-107440 (2017).
  10. Rodriguez-Enriquez, S., et al. Energy metabolism transition in multi-cellular human tumor spheroids. Journal of Cell Physiology. 216 (1), 189-197 (2008).
  11. Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: intermediates between monolayer culture and in vivo tumor. Cell Biology International. 23 (3), 157-161 (1999).
  12. Andersen, A. P., et al. Roles of acid-extruding ion transporters in regulation of breast cancer cell growth in a 3-dimensional microenvironment. Molecular Cancer. 15 (1), 45 (2016).
  13. Swietach, P., Patiar, S., Supuran, C. T., Harris, A. L., Vaughan-Jones, R. D. The role of carbonic anhydrase 9 in regulating extracellular and intracellular ph in three-dimensional tumor cell growths. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20299-20310 (2009).
  14. Walenta, S., Doetsch, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Metabolic imaging in multicellular spheroids of oncogene-transfected fibroblasts. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (4), 509-522 (2000).
  15. Kunz-Schughart, L. A., Groebe, K., Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell culture induces novel proliferative and metabolic alterations associated with oncogenic transformation. International Journal of Cancer. 66 (4), 578-586 (1996).
  16. Feng, H., et al. Homogeneous pancreatic cancer spheroids mimic growth pattern of circulating tumor cell clusters and macrometastases: displaying heterogeneity and crater-like structure on inner layer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 143 (9), 1771-1786 (2017).
  17. Santini, M. T., Rainaldi, G., Indovina, P. L. Apoptosis, cell adhesion and the extracellular matrix in the three-dimensional growth of multicellular tumor spheroids. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36 (2-3), 75-87 (2000).
  18. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
  19. Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
  20. Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy. Journal of Visual Experiments. (66), e4218 (2012).
  21. Friedrich, J., et al. A reliable tool to determine cell viability in complex 3-d culture: the acid phosphatase assay. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 925-937 (2007).
  22. Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. International Journal of Oncology. 31 (6), 1403-1413 (2007).
  23. Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
  24. Andersen, A. P., et al. The net acid extruders NHE1, NBCn1 and MCT4 promote mammary tumor growth through distinct but overlapping mechanisms. International Journal of Cancer. , (2018).
  25. Vaupel, P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology. Seminars in Radiation Oncology. 14 (3), 198-206 (2004).
  26. Vaupel, P. W., Frinak, S., Bicher, H. I. Heterogeneous oxygen partial pressure and pH distribution in C3H mouse mammary adenocarcinoma. Cancer Research. 41 (5), 2008-2013 (1981).
  27. Helmlinger, G., Yuan, F., Dellian, M., Jain, R. K. Interstitial pH and pO2 gradients in solid tumors in vivo: high-resolution measurements reveal a lack of correlation. Nature Medicine. 3 (2), 177-182 (1997).
  28. Zhang, X., Lin, Y., Gillies, R. J. Tumor pH and its measurement. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1167-1170 (2010).
  29. Gillies, R. J., Raghunand, N., Karczmar, G. S., Bhujwalla, Z. M. MRI of the tumor microenvironment. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 16 (4), 430-450 (2002).
  30. Vukovic, V., Tannock, I. F. Influence of low pH on cytotoxicity of paclitaxel, mitoxantrone and topotecan. British Journal of Cancer. 75 (8), 1167-1172 (1997).
  31. Song, C. W., Griffin, R., Park, H. J., Teicher, B. A. . Cancer Drug Resistance. , 21-42 (2006).
  32. Lotz, C., et al. Role of the tumor microenvironment in the activity and expression of the p-glycoprotein in human colon carcinoma cells. Oncology Reports. 17 (1), 239-244 (2007).
  33. Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
  34. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular Oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
  35. Kuen, J., Darowski, D., Kluge, T., Majety, M. Pancreatic cancer cell/fibroblast co-culture induces M2 like macrophages that influence therapeutic response in a 3D model. PLoS One. 12 (7), 0182039 (2017).
  36. Bochet, L., et al. Adipocyte-derived fibroblasts promote tumor progression and contribute to the desmoplastic reaction in breast cancer. Cancer Research. 73 (18), 5657-5668 (2013).
  37. Amann, A., et al. Development of a 3D angiogenesis model to study tumour - endothelial cell interactions and the effects of anti-angiogenic drugs. Scientific Reports. 7 (1), 2963 (2017).
  38. LaBonia, G. J., Ludwig, K. R., Mousseau, C. B., Hummon, A. B. iTRAQ Quantitative Proteomic Profiling and MALDI-MSI of Colon Cancer Spheroids Treated with Combination Chemotherapies in a 3D Printed Fluidic Device. Analytical Chemistry. 90 (2), 1423-1430 (2018).
  39. Hulikova, A., Vaughan-Jones, R. D., Swietach, P. Dual role of CO2/HCO3(-) formula buffer in the regulation of intracellular pH of three-dimensional tumor growths. Journal of Biological Chemistry. 286 (16), 13815-13826 (2011).
  40. Wallace, D. I., Guo, X. Properties of tumor spheroid growth exhibited by simple mathematical models. Frontiers in Oncology. 3, 51 (2013).
  41. Michel, T., et al. Mathematical modeling of the proliferation gradient in multicellular tumor spheroids. Journal of Theoretical Biology. 458, 133-147 (2018).
  42. Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

148Spheroids

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved