评估癌细胞3D球形培养中的细胞活力和死亡

摘要

在这里,我们提出了几种简单的方法来评估3D癌细胞球体的生存能力和死亡,它模仿体内肿瘤的物理化学梯度比2D培养要好得多。因此,球形模型允许评估癌症药物疗效,并改进对体内条件的翻译。

摘要

癌细胞的三维球体是癌症药物屏幕和获得对癌细胞生物学的机械洞察力的重要工具。这种制剂的力量在于它能够模仿肿瘤体内状况的许多方面,同时快速、廉价和通用,足以允许相对较高的通量筛查。球体培养条件可以重述肿瘤中的物理化学梯度,包括细胞外酸度增加、乳酸增加、葡萄糖和氧气供应减少,从球体边缘到其核心。此外,该模型部分模拟了体内肿瘤的机械特性和细胞-细胞相互作用。3D球体的具体性质和最佳生长条件在不同类型的癌细胞之间差别很大。此外,评估3D球体的细胞活力和死亡需要部分不同于2D培养方法的方法。在这里,我们描述了几种协议,用于制备癌细胞的3D球体,并在评估抗癌药物疗效的背景下利用这些培养物评估细胞的生存能力和死亡。

引言

在癌症生物学中使用多细胞球体模型已有几十年的历史,但近年来却获得了巨大的发展势头。这在很大程度上反映了人们对于癌细胞表型对其微环境和特定生长条件的依赖程度的日益提高的认识。实体肿瘤的微观环境与相应的正常组织有着根本的不同。这包括物理化学条件,如pH、氧张力,以及间质压力、可溶性因子(如营养物质、废物产品和分泌信号化合物)的浓度梯度(生长因子、细胞因子)。此外,它包括组织细胞外基质(ECM),细胞-细胞相互作用和细胞间信令,以及肿瘤的特定的三维(3D)结构的其他方面3, ^5,6.癌细胞存在的特定微环境条件深刻地影响其基因表达特征和功能特性,很明显,与在二维中生长的细胞相比,3D球体的表型更接近于模仿体内肿瘤7,8,9,10,11。2D模型,即使它们采用缺氧、酸性pH值和高乳酸浓度来模拟肿瘤微环境的已知方面,仍然无法捕获肿瘤内产生的物理化学参数及其3D肿瘤的梯度建筑。另一方面,动物模型是昂贵,缓慢,道德问题,一般来说,也有缺陷,在能力,以重新报告人类肿瘤条件。因此,3D球体已作为中间复杂性模型应用于大多数固体癌症的多种特性的研究9,11,12,13, ^14,15,16,17.

一种广泛使用的3D球体是筛选癌症治疗疗效9,18,19,20的筛选方法。治疗反应对肿瘤微环境特别敏感,既反映了肿瘤的侵权性、扩散受限、间隙压力高、酸性环境pH值对药物输送的影响,也反映了缺氧等的影响。微环境方面对细胞死亡反应9,17。因为3D球形内的环境本身发展了所有这些属性7,8,9,10,11,使用3D细胞培养可以大幅度提高结果在体内条件的转化,同时允许对净增长进行高效且经济实惠的高通量筛选。然而,绝大多数关于癌细胞药物反应的研究仍在二维条件下进行。这可能反映了,虽然一些检测可以相对容易地用于 3D 细胞培养,但许多,如可行性测定,西方印迹和免疫荧光分析,在 2D 比在 3D 中更容易完成。

本工作的目的是提供易于接受的测定和精确的方案,用于分析抗癌药物治疗对3D肿瘤模拟环境中癌细胞活力和存活率的影响。具体来说,我们提供和比较三种不同的球形形成方法,然后是对生长、活力和药物反应进行定性和定量分析的方法。

研究方案

1. 飞球体的生成

1. 为球形形成准备细胞悬浮液
   注:不同的细胞系具有非常不同的附着力,必须在每种情况下建立最合适的球形形成协议。我们发现MCF-7和BxPC-3细胞适合自发球体形成,而MDA-MB-231、SKBr-3、Panc-1和MiaPaCa需要添加重组的基体膜才能成功形成球体。只有MDA-MB-231和BxPC-3细胞用于挂降协议,但其他细胞系当然适用。
   1. 将细胞生长为单层,直到70-80%的汇合。
   2. 用磷酸盐缓冲盐水清洗细胞(1x PBS,5 mL,用于 25 厘米²或 10 mL,用于 75 厘米²烧瓶),添加细胞分离酶(25 厘米²或 1 mL 的细胞,用于 75 厘米²瓶),并在 37°C 下孵育细胞 2-5 分钟在 5% CO₂和 95% 湿度。
   3. 在显微镜下检查细胞分离,通过在 75 cm²烧瓶中将生长培养基(6-10% 血清取决于细胞系)添加到 5 mL 的总体积中,中和细胞分离酶。
   4. 使用 Bürker 室对每个细胞制剂的细胞计数和在腔室中计数 8 个方块,以获得球体大小的高重现性。
      注:下面给出了三个协议,分别描述了球形形成的不同方法。协议 1.2 和 1.3 可用于介绍的所有后续分析协议,而协议 1.4 最适合嵌入和莱沙处理制剂。根据细胞系的不同,球形形成需要2-4天,无论使用何种方法。
2. 自发球形形成
   1. 执行步骤 1.1.1-1.1.4。
   2. 在15 mL管中稀释细胞悬浮液,以获得0.5-2 x 10⁴细胞/mL(需要为每个细胞系确定最佳细胞密度)(图1A(ii))。
   3. 用1x PBS或生长介质填充井外环,以减少剩余井的蒸发。将电池悬架转移到无菌储液罐,并使用多通道移液器将 200 μL/孔分配到超低附件 96 孔圆形底板中(图 1A (iii))。
   4. 在37°C的培养箱中孵育板,CO₂为5%,湿度为95%。
   5. 每2-3天获得球体的光微观图像。
      注:本文中的图像以11.5倍的放大倍率拍摄,适用于使用这些协议制备的大多数球体。
   6. 每 2-3 天(获取图像后)更换 100 μL 的介质(去除已用介质的 100 μL,用 100 μL 的新鲜介质替换)。
      注:为了避免在更换介质时去除球体,建议在缓慢去除介质时稍微倾斜板,并检查吸头中的吸气介质有有可见球体,然后再丢弃。
3. 重组基底膜介导球形形成。
   注:使用乳糖脱氢酶提升病毒(LDEV)无生长因子重组基底膜(rBM)。rBM 对温度敏感,应始终保存在冰上,因为如果达到 15°C,就会凝固。电镀前,在室温 (RT) 下,在 4 °C 或 2-4 h 下在冰上解冻 rBM。
   1. 在冰上解冻 rBM(参见材料表)。
   2. 使用前,将板和储液罐(如果单独包裹)放在冰上。
   3. 执行步骤 1.1.1-1.1.4。
   4. 用1x PBS或生长介质填充井外环,以减少剩余井的蒸发。在15 mL管中稀释细胞悬浮液,以获得0.5-2 x 10⁴细胞/mL(需要为每个细胞系确定最佳细胞密度)(图1A(ii))。
   5. 将含有稀释细胞悬浮液的15 mL管放在冰上(例如,在玻璃烧杯中)(图1A(iia))。
   6. 将冷藏板和储液罐转移到发动机罩上。冲洗塑料容器,将其填充冰,并将其转移到发动机罩,使板和储液罐在整个过程中放在冰上。
   7. 轻轻重新悬浮 rBM,以确保凝胶均匀。
   8. 在冷冻细胞悬浮液中加入1-2%的rBM(需要为每个细胞系确定最佳浓度)(图1A(iib)。)。
   9. 倒置 15 mL 管,以确保在将悬浮液放入板之前正确混合 rBM 和电池悬架。
   10. 使用多通道移液器将含rBM的电池悬浮液转移到无菌储液罐中,并将200μL/孔分配到冷冻超低附件96孔板中(图1A(iii)。
       注:如果使用多个细胞悬浮液(例如,多个细胞系),在添加 rBM 后立即分配每个细胞悬浮液,以防止过早凝胶化。
   11. 使用"柔软体面"/无制动(如果可能,在 4°C 下离心,使 rBM 流体保持更长时间,但不要求成功形成球体),在 750 x g下将板离心 15 分钟,以确保在 rBM 时将细胞聚集在一起硬化,促进形成一个单一的球体。
   12. 在培养箱中孵育板(37°C,5% CO2,95%湿度)。
   13. 每2-3天获取一次光显微图像,用于评估球体生长。
   14. 每 2-3 天更换 100 μL 的介质(取出 100 μL,用 100 μL 的新鲜介质替换)。
4. 悬挂滴球体。
   1. 执行步骤 1.1.1-1.1.4。
   2. 稀释细胞以获得适当的稀释。实际稀释是50,000个细胞/mL。
   3. 取下 10 厘米²细胞培养盘的盖子,将其放置,使其朝上。在盘中加入 6 mL 的 1x PBS (图 1B (i))。
   4. 将细胞悬浮液倒入无菌储液罐中,用多通道移液器(图1B(ii)小心地将多达30滴40μL的细胞悬浮液放在细胞培养盘的盖子上(图1B(ii),从而产生2000个细胞/滴的浓度。避免将跌落太靠近盖子边缘,因为在以下步骤中反转盖子时,这些跌落更有可能失去表面张力。
   5. 以快速但可控的运动反转盖子,并将其放在包含 1x PBS 的细胞培养盘的顶部(图 1B (iii))。
   6. 将盘子置于37°C的培养箱中,其CO2和95%湿度不干扰滴液,使其生长4-6天。
   7. 如果用于蛋白质分解或嵌入,池球体通过取下盖子并倾斜,以便用1 mL的加热介质冲洗滴。将含有球体的培养基转移到1.5 mL管中,并使它们稳定在管的底部。分别按照4.4和6.2.2中所述进行蛋白质酸理和嵌入。

2. 类球体的药物治疗

注:长期药物治疗可应用于球体,以筛选感兴趣的药物的效果。在开始药物治疗之前,建议对药物进行剂量反应实验,以找到适合实验治疗的剂量。剂量应基于药物的确定 IC₅₀/K i,范围约为此值的 0.2x-10x。

1. 根据 1.2 或 1.3 中所述的所需条件设置 6-12 球形,并放置在培养箱中(37 °C,5% CO_2,95% 湿度)2 天。
2. 在第2天,拍摄球体的光微观图像。
3. 准备第一个治疗剂量(获取图像后)。
   注:第一次处理浓度必须达到所需最终浓度的两倍,因为当溶液在含有100μL培养基的井中后,溶液将被稀释1:2。建议的药物治疗间隔(取决于药物的半寿命):第2、4和7天。
4. 使用多通道移液器,轻轻去除100μL的介质,并用含有介质的100μL药物替换。
5. 将96孔板放回培养箱中,温度为37°C,具有5%的CO₂和95%的湿度,并在选定的治疗日重复2.3和2.4,但现在没有加倍剂量以获得正确的最终剂量。
6. 在协议/治疗计划的最后一天,可以进行以下一项或多项检测。

3. 类球体的细胞活力测定

1. 按照 1.2 或 1.3 中所述的所需条件设置 4-6 球形,并在 37°C 的培养箱中放置,CO₂和湿度为 95%。
   注:在这种情况下,细胞活力测定在第7天或第9天进行,通过上述光显微镜监测球体生长每2-3天(点1.2.5和1.3.13)。
2. 解冻可行性测定试剂(见材料表),并在使用前将其与RT平衡。
3. 通过反转轻轻混合以获得均匀的溶液。
4. 在进行测定之前,从球体(100 μL)中取出50%的培养基。
5. 以1:3的比例将细胞活力试剂与井中存在的介质量(图2A(i))的比例添加到每口孔中(图2A(i)),对于96孔板,将50μL试剂添加到100μL的介质中。
6. 大力混合内容物5分钟,诱导细胞分莱(图2A(ii))。
7. 在RT孵育25分钟以稳定发光信号(图2A(iii))。
8. 记录发光信号 (图 2A (iv))。

4. 从 3D 球形培养物制备蛋白质乳酸物,用于西方印迹

注:在收集球形时,建议使用 P200 移液器并切割尖端的末端,以允许更大的开口,从而在不干扰其结构的情况下更轻松地捕获球形。

1. 对于每种情况,在 1.5 mL 管中至少汇集 12 个球体(取决于球形大小)(避免 2 mL 管,因为后续步骤由于底部不太尖度,因此将变得更加困难)。
   注:如果介质量超过 1.5 mL,然后再收集所有球体,允许收集的球体在底部沉降(发生非常快,不需要离心),并在继续收集之前丢弃管的一半体积。剩余的球体。
2. 将管子放在冰上,让球体在 1.5 mL 管的底部沉降。
3. 从无菌细胞实验室移动到常规实验室。
4. 在 1 mL 的冰冷 1x PBS 中洗涤球体两次。让球体稳定,然后在每个洗涤步骤之间去除1xPBS。
5. 尽可能多吸1x PBS,而不干扰或去除球体。
6. 每球体(例如,10个球体 = 50 μL LB)加入5μL加热解液缓冲液(LB),加入磷酸酶和蛋白酶抑制剂。
7. 重复旋涡间隔,然后向下旋转,直到球体溶解。根据球体的尺寸和紧凑性,对 30 秒进行涡旋循环,然后离心(使用桌面离心机快速旋转就足够了)10 秒,约 5-10 分钟。
   注:可以在此处暂停该协议。使分酶保持在-20°C,直到按照标准2D蛋白质莱酸协议进行声波、均质化和蛋白质测定,然后使用标准协议进行西方印迹。

5. 碘化物 (PI) 飞球染色

1. 按照 1.2 或 1.3 中所述,在所需的条件下设置 3-6 个球体,并在 37°C 的培养箱中放置,其 CO₂和湿度为 95%。
2. 在无菌细胞培养实验室中,将 1x PBS 加热至 37°C。
3. 通过在 1x PBS 中稀释库存溶液,制作 4 μM 的 PI 溶液:在 1x PBS 中稀释 1 mg/mL 水性 PI 1:350 的库存。
   注:在井中加入溶液后,该浓度将进一步减半,每口含有球体的井需要最终浓度为2 μM. 100 μL。
   警告:碘化钠 (PI) 必须在烟罩中处理,并戴上手套。PI 是光敏的。处理时防光。
4. 从 96 孔板中的每个孔中取出 100 μL 的介质,而不去除球形。
5. 将 100 μL 的加热 1x PBS 加入所有井中,然后清除井中 100 μL 的液体,从而洗净剩余的介质。重复此洗涤步骤 3 次。
6. 在每个孔中加入100μL的PI溶液,用铝箔覆盖板,并将其置于37°C的培养箱中,温度为5%,CO₂和95%湿度为10-15分钟。
7. 重复 4.5 中描述的 3 个洗涤步骤以洗掉 PI 溶液,以便在成像时减少背景信号。
8. 使用荧光显微镜对球体进行成像。要评估球形核心中细胞的生存能力,需要 z 堆栈来获取球体深度不同的图像。
   注:建议根据球形大小,在每个切片之间增加大约 18-35 μm 的步长,每个球体大约提供 11-18 个堆栈。Z 堆栈可以使用 z 投影函数在 ImageJ 中进行处理,该函数可以将所有 z 堆栈合并为一个最终图片,从而概述整个球形的染色(有关为此目的使用 ImageJ 的进一步指南,请参阅(https://imagej.net/Z-functions)。

6. 嵌入 3D 球形

1. 准备将球体嵌入的胶质凝胶(仅第一次执行协议所必需的)。
   1. 将 1 克细菌混合在 50 mL 的 ddH₂O 中。
   2. 在微波炉中缓慢加热,直到细菌溶解并形成同质凝胶。不要让凝胶沸腾。
   3. 在60°C的水浴中保持细菌温暖。
   4. 实验之间保持4°C。
2. 嵌入球体。
   1. 在第 1 天,对于每种情况,在 1.5 mL 管中至少汇集 12 个球体。
   2. 用 1 mL 的冰冷 1x PBS 洗涤一次。
   3. 要修复球体,添加 1 mL 的 4% 甲醛。
      注:甲醛的处理应在烟罩中进行。
   4. 让他们在RT孵育24小时。
   5. 第 2 天,将甘蔗凝胶放入微波炉中装满水的烧杯中,仔细加热。确保凝胶不沸腾!在台式加热板中保持温暖,温度在60°C,直到使用。
   6. 用 1 mL 的冰冷 1x PBS 洗涤球形。
   7. 吸气大部分 1x PBS(此时保留约 100 μL,适用于处理球体)。
   8. 通过在斜坡处切割移液器尖端,获得具有较大孔的尖头,准备 20 μL 移液器(见图)。
      注:下一部分必须迅速完成,以确保最佳的球体转移,并避免凝胶滴的凝固。如果没有可用的加热块,建议首先捕捉球形,然后使胶糖下降(即切换点 6.2.9 和 6.2.10 的顺序)。
   9. 在显微镜幻灯片上使甘蔗胶滴。将滑轨放在暖加热块上,以防止甘蔗凝固。
   10. 使用经过修改的移液器尖端(参见 6.2.8),在 15-20 μL 的体积中捕获尽可能多的球形。
   11. 在不接触显微镜滑块的情况下,小心地将含有 1x PBS 的 15-20 μL 球体注射到角糖凝胶滴的中心。
       注:这是一个稍微困难的问题。如果将球形注射到凝胶滴中时,如果移液器尖端接触显微镜滑块,球形将丢失。建议通过将彩色液体注入滴中来练习使胶质滴和注入球体的整个过程。这将允许通过液滴的潜在穿透的可视化,因为彩色液体将泄漏到幻灯片上。
   12. 通过在RT或4°C孵育5-10分钟,让角胶凝胶滴硬化。一旦凝胶滴有些凝固(但仍相当柔软),小心地将凝胶滴从显微镜滑入带手术刀的塑料纸巾盒中。
   13. 用70%乙醇盖住塑料纸巾盒。
       注:此时,球体可以直接使用或储存数月。
   14. 将甘蔗嵌入的球体嵌入石蜡中,截面至2-3 μm厚的层幻灯片中,并沾有血氧素和欧辛染色,或受免疫组织染色。

结果

基于球形形成方案的球形生长测定图1A和图1B,作为分析3D肿瘤抗癌药物治疗效果的起点模仿设置。球形的形成容易是细胞系特定的,一些细胞系需要补充rBM才能形成相干球^体22。添加的rBM浓度对球体的形态有深刻的影响。如图1C和图1D所示,在0?...

讨论

使用3D癌细胞球体已被证明是一个有价值的和多功能的工具,不仅用于抗癌药物筛选,而且获得机械洞察力,在模拟肿瘤条件下的癌细胞死亡和生存能力的调节微。这一点尤其重要,因为化疗药物的可及性、细胞接受性和细胞内效应受到肿瘤物理化学条件(包括pH、氧张力、曲解性、物理和物理和化学细胞-细胞相互作用9,17。例如,在许多实体肿瘤25、26?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI)	Invitrogen	# C10595	For staining nuclei
5-Fluorouracil (5-FU)	Sigma-Aldrich	#F6627	Component in chemotherapeutic treatment
5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA)	Life Technologies	#E3111	Inhibitor of NHE1
Antibody against PARP and cPARP	Cell signaling	#9542	Used in western blotting
Antibody against Ki-67	Cell signaling	#9449	Used for IHC
Antibody against p53	Cell Signaling	#2524	Used for IHC
Antibody against β-actin	Sigma	A5441	Used in western blotting
Bactoagar	BD Bioscience	#214010	Used for agarose gel preparation
Benchmark protein ladder	Invitrogen	#10747-012	Used for SDS-PAGE
Bio-Rad DC Protein Assay kit	Bio-Rad Laboratories	#500-0113, #500-0114, #500-0115	Used for protein determination from lysates
Bürker chamber	Marienfeld	610311	For cell counting
BX63 epifluoresence microscope	Olympus		Used for fluorescent imaging
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	#G9681	Used for the cell viability assay
Cisplatin	Sigma-Aldrich	#P4394	Component in chemotherapeutic treatment
Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom,  Ultra-low attachment, With lid, Sterile	Corning	#4520	Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point
Corning 96 well, clear round bottom,  Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile	Corning	#7007	Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point
Criterion TGX Precast Gels	Bio-Rad	5671025	Used for SDS-PAGE
Doxorubicin	Abcam	#120629	Component in chemotherapeutic treatment
FLUOStar Optima Microplate reader	BMG Labtech		Used for recording luminescence
Formaldehyde	VWR Chemicals	#9713.1000	Used for cell fixation
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	Gibco	#A1413202	Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol.
Heat-inactivated FBS	Sigma	#F9665	Serum for growth media
ImageJ	NIH		Scientific Image analysis
Medim Uni-safe casette	Medim Histotechnologie	10-0114	Used for storage of embedded spheroids
Mini protease inhibitor cocktail tablets	Roche Diagnostics GmBH	# 11836153001	Used for lysis buffer preparation
MZ16 microscope	Leica		Used for light microscopic images
NuPAGE LDS 4x Sample Buffer	Invitrogen	#NP0007	Used for western blotting
Pierce ECL Western blotting substrate	Thermo scientific	#32106	Used for western blotting
Ponceau S	Sigma-Aldrich	#P7170-1L	Used for protein band staining
Prism 6.0	Graphpad		Scientific graphing and statistical software
Propidium iodide (1mg/ml solution in water)	Invitrogen	P3566	Light sensitive
Sterile reservoirs, multichannel	SPL lifesciences	21002	Used for seeding cells for spheroid formation
Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide	Menzel-Gläser	#J3800AMNZ	Microscope glass slide used for embedding
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	#T5648	Used as chemotherapeutic treatment
Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes	Bio-Rad	#170-4159	Used for western blotting
Tris/Glycine/SDS running buffer	Bio-Rad	#161 0732	Used for SDS-PAGE
Trypsin-EDTA solution	Sigma	#T4174	Cell dissociation enzyme