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Résumé

Ici, nous présentons plusieurs méthodes simples pour évaluer la viabilité et la mort dans les sphéroïdes 3D de cellules cancéreuses, qui imitent les gradients physico-chimiques des tumeurs in vivo beaucoup mieux que la culture 2D. Le modèle sphéroïde permet donc d'évaluer l'efficacité du médicament contre le cancer avec une meilleure traduction aux conditions in vivo.

Résumé

Les sphéroïdes tridimensionnels des cellules cancéreuses sont des outils importants pour les deux dépistages de médicaments anticancéreux et pour obtenir un aperçu mécaniste de la biologie des cellules cancéreuses. La puissance de cette préparation réside dans sa capacité à imiter de nombreux aspects des conditions in vivo des tumeurs tout en étant rapide, bon marché, et assez polyvalent pour permettre un dépistage relativement à haut débit. Les conditions de culture sphéroïde peuvent récapituler les gradients physico-chimiques dans une tumeur, y compris l'acidité extracellulaire croissante, le lactate accru, et la disponibilité décroissante de glucose et d'oxygène, de la périphérie sphéroïde à son noyau. En outre, les propriétés mécaniques et les interactions cellule-cellule des tumeurs in vivo sont en partie imitées par ce modèle. Les propriétés spécifiques et par conséquent les conditions optimales de croissance, des sphéroïdes 3D, diffèrent considérablement entre les différents types de cellules cancéreuses. En outre, l'évaluation de la viabilité cellulaire et de la mort chez les sphéroïdes 3D nécessite des méthodes qui diffèrent en partie de celles employées pour les cultures 2D. Ici nous décrivons plusieurs protocoles pour préparer les sphéroïdes 3D des cellules cancéreuses, et pour l'utilisation de telles cultures pour évaluer la viabilité et la mort de cellules dans le contexte d'évaluer l'efficacité des drogues anticancéreuses.

Introduction

L'utilisation de modèles sphéroïdes multicellulaires en biologie du cancer est de plusieurs décennies1,2, mais a gagné un élan substantiel ces dernières années. Cela reflète en grande partie une prise de conscience accrue de la façon dont le phénotype des cellules cancéreuses dépend fortement de leur microenvironnement et de leurs conditions de croissance spécifiques. Le microenvironnement dans les tumeurs pleines est fondamentalement différent de celui dans les tissus normaux correspondants. Cela comprend les conditions physico-chimiques telles que le pH, la tension de l'oxygène, ainsi que la pression interstitielle, les gradients de concentration de facteurs solubles tels que les nutriments, les déchets et les composés de signalisation sécrétés (facteurs de croissance, cytokines). En outre, il comprend l'organisation de la matrice extracellulaire (ECM), les interactions cellulaires et la signalisation intercellulaire, et d'autres aspects de l'architecture tridimensionnelle particulière (3D) de la tumeur3,4, 5,6. Les conditions microenvironnementales spécifiques dans lesquelles les cellules cancéreuses existent, affectent profondément leur profil d'expression génique et leurs propriétés fonctionnelles, et il est clair que, par rapport à celle des cellules cultivées en 2D, le phénotype des sphéroïdes 3D imite beaucoup plus étroitement celui des tumeurs in vivo7,8,9,10,11. Les modèles 2D, même s'ils emploient l'hypoxie, le pH acide, et les concentrations élevées de lactate pour imiter des aspects connus du microenvironnement de tumeur, échouent toujours à capturer les gradients des paramètres physico-chimiques surgissant dans des tumeurs, aussi bien que leur tumeur 3D architecture. D'autre part, les modèles animaux sont coûteux, lents, et éthiquement problématiques, et généralement, ont également des lacunes dans leur capacité à récapituler les conditions tumorales humaines. Par conséquent, les sphéroïdes 3D ont été appliqués comme un modèle de complexité intermédiaire dans les études d'un large éventail de propriétés de la plupart des cancers solides9,11,12,13, 14,15,16,17.

Une utilisation largement employée des sphéroïdes 3D est dans les essais de criblage de l'efficacité de thérapie anticancéreuse9,18,19,20. Les réponses de traitement sont particulièrement sensibles au microenvironnement de tumeur, reflétant à la fois l'impact de la tortuosité, de la diffusion restreinte, de la pression interstitielle élevée, et du pH environnemental acide sur la livraison de drogue, et de l'impact de l'hypoxie et d'autres aspects du microenvironnement sur la réponse de mort cellulaire9,17. Parce que l'environnement au sein des sphéroïdes 3D développe intrinsèquement toutes ces propriétés7,8,9,10,11, en utilisant des cultures cellulaires 3D peut améliorer considérablement la traduction des résultats vers des conditions in vivo, tout en permettant un dépistage efficace et abordable de la croissance nette. Cependant, la grande majorité des études sur la réponse médicamenteuse des cellules cancéreuses sont toujours menées dans des conditions 2D. Ceci reflète probablement que, tandis que quelques essais peuvent relativement facilement être mis en œuvre pour des cultures de cellules 3D, beaucoup, tels que des essais de viabilité, le ballonnement occidental, et l'analyse d'immunofluorescence, sont beaucoup plus commodement faits en 2D qu'en 3D.

Le but du travail actuel est de fournir des essais facilement favorables et des protocoles précis pour des analyses de l'effet du traitement avec des médicaments anticancéreux sur la viabilité et la survie des cellules cancéreuses dans un cadre de tumor 3D imitant. Plus précisément, nous fournissons et comparons trois méthodes différentes pour la formation de sphéroïdes, suivies de méthodes d'analyses qualitatives et quantitatives de la croissance, de la viabilité et de la réponse aux médicaments.

Protocole

1. Génération de sphéroïdes

  1. Préparation des suspensions cellulaires pour la formation de sphéroïdes
    REMARQUE :     Différentes lignées cellulaires ont des propriétés d'adhérence très différentes et le protocole de formation sphéroïde le plus approprié doit être établi dans chaque cas. Nous avons constaté que les cellules MCF-7 et BxPC-3 conviennent à la formation spontanée de sphéroïdes, tandis que MDA-MB-231, SKBr-3, Panc-1 et MiaPaCa exigent l'addition de la membrane reconstituée de sous-sol pour former avec succès des sphéroïdes. Seulement Les cellules MDA-MB-231 et BxPC-3 ont été employées pour le protocole de chute suspendue, cependant d'autres lignes de cellules sont certainement applicables.
    1. Cultivez les cellules en monocouche jusqu'à 70-80% d'afluence.
    2. Laver les cellules avec salin tamponné de phosphate (1x PBS, 5 ml pour un 25 cm2 ou 10 ml pour un flacon de 75 cm2), ajouter l'enzyme de dissociation cellulaire (0,5 ml pour un 25 cm2 ou 1 ml pour un flacon de 75 cm2) et incuber les cellules pendant 2-5 min à 37 oC 5% d'humiditéco2 et 95%.
    3. Vérifier le détachement cellulaire au microscope et neutraliser l'enzyme de dissociation cellulaire en ajoutant un milieu de croissance (6-10% de sérum selon la lignée cellulaire) à un volume total de 5 ml dans un 25 cm2 ou 10 ml pour un flacon de 75 cm2.
    4. Utilisez une chambre de B-rker pour compter les cellules et compter 8 carrés dans la chambre par préparation cellulaire pour obtenir une reproductibilité élevée de la taille des sphéroïdes.
      NOTE: Trois protocoles décrivant chacun une méthode différente pour la formation de sphéroïdes sont présentés ci-dessous. Le protocole 1.2 et 1.3 peuvent être utilisés pour tous les protocoles analytiques subséquents présentés, tandis que le protocole 1.4 est le mieux adapté pour l'intégration et les préparations de lysate. Selon la lignée cellulaire, la formation de sphéroïdes prend 2-4 jours, indépendamment de la méthode utilisée.
  2. Formation spontanée de sphéroïdes
    1. Effectuer les étapes 1.1.1-1.1.4.
    2. Diluer la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml pour obtenir 0,5-2 x 104 cellules/mL (la densité cellulaire optimale doit être déterminée pour chaque lignée cellulaire) (Figure 1A (ii)).
    3. Remplissez l'anneau extérieur des puits avec 1x PBS ou milieu de croissance pour réduire l'évaporation des puits restants. Transférer la suspension cellulaire dans un réservoir stérile et, à l'aide d'une pipette multicanal, distribuer 200 L/puits dans des plaques de fond rondes ultra-faibles de 96 puits (figure1A (iii)).
    4. Incuber la plaque dans un incubateur à 37 oC avec 5 % de CO2,95 % d'humidité.
    5. Tous les 2-3 jours, acquérez des images microscopiques légères des sphéroïdes.
      NOTE: Les images de cet article sont prises à 11,5x grossissement, ce qui est approprié pour la plupart des sphéroïdes préparés à l'aide de ces protocoles.
    6. Tous les 2-3 jours (après l'acquisition d'images) remplacez 100 L de milieu (enlevez 100 L du milieu usé et remplacez-le par 100 L de milieu frais.
      NOTE: Pour éviter d'enlever les sphéroïdes lors du remplacement du milieu, il est conseillé d'incliner un peu la plaque tout en enlevant lentement le milieu et d'inspecter le milieu aspiré dans les pointes pour les sphéroïdes visibles avant de le jeter.
  3. Formation de sphéroïde membrane-négociée reconstituée de sous-sol.
    REMARQUE :     La membrane reconstituée de membrane reconstituée de sous-sol reconstituée (rBM) de virus de croissance réduit de lactose de dehydrogenase (LDEV) a été employée. le rBM est sensible à la température et doit toujours être maintenu sur la glace, car il se remanie s'il atteint 15 oC. Décongeler le rBM sur la glace pendant la nuit à 4 oC ou 2 à 4 h à température ambiante (RT) avant de plafonner.
    1. Dégel rBM sur glace (voir Tableau des matériaux).
    2. Conserver les plaques et les réservoirs (si emballés individuellement) sur la glace avant de les utiliser.
    3. Effectuer les étapes 1.1.1-1.1.4.
    4. Remplissez l'anneau extérieur des puits avec 1x PBS ou milieu de croissance pour réduire l'évaporation des puits restants. Diluer la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml pour obtenir 0,5-2 x 104 cellules/mL (la densité cellulaire optimale doit être déterminée pour chaque lignée cellulaire) (Figure 1A (ii)).
    5. Placez le tube de 15 ml contenant la suspension de cellules diluées sur la glace (p. ex., dans un bécher en verre) (figure1A (iia)).
    6. Transférer les assiettes et les réservoirs réfrigérés dans le capot. Rincer les contenants en plastique, les remplir de glace et les transférer dans le capot pour permettre aux plaques et aux réservoirs d'être placés sur la glace pendant toute la procédure.
    7. Resuspendre le rBM doucement pour assurer un gel homogène.
    8. Ajouter 1 à 2 % de rBM (la concentration optimale doit être déterminée pour chaque lignée cellulaire) aux suspensions cellulaires réfrigérées (figure1A (iib)).
    9. Inverser le tube de 15 ml pour assurer le bon mélange de rBM et de suspension cellulaire avant de distribuer la suspension dans la plaque.
    10. Transférer la suspension cellulaire contenant du rBM dans un réservoir stérile et distribuer 200 L/puits dans des plaques de 96 puits à fixation ultra-faible réfrigérée à l'aide d'une pipette multicanal (figure1A (iii)).
      NOTE: Si vous travaillez avec plusieurs suspensions cellulaires (p. ex., plus d'une lignée cellulaire), il est essentiel de distribuer chaque suspension cellulaire immédiatement après l'ajout de rBM pour éviter les gélifications prématurées.
    11. Centrifuger la plaque pendant 15 min à 750 x g en utilisant 'soft décent' /pas de freinage (si possible, centrifugeuse à 4 oC pour maintenir le liquide rBM plus longtemps, mais pas une exigence pour la formation sphéroïde réussie), pour s'assurer que les cellules sont regroupées lorsque le rBM durcit, facilitant la formation d'un seul sphéroïde.
    12. Incuber la plaque dans un incubateur (37 oC, 5 % de CO2, 95 % d'humidité).
    13. Tous les 2-3 jours acquièrent des images microscopiques légères pour l'évaluation de la croissance sphéroïde.
    14. Tous les 2-3 jours remplacent 100 L de milieu (enlevez 100 L et remplacez-les par 100 L de milieu frais).
  4. Sphéroïdes suspendus.
    1. Effectuer l'étape 1.1.1-1.1.4.
    2. Diluer les cellules pour obtenir une dilution appropriée. Une dilution pratique est de 50 000 cellules/mL.
    3. Retirez le couvercle d'un plat de culture cellulaire de 10 cm2 et placez-le de sorte qu'il fait face vers le haut. Ajouter 6 mL de 1x PBS au plat (Figure 1B (i)).
    4. Verser la suspension cellulaire dans un réservoir stérile et placer soigneusement jusqu'à 30 gouttes de 40 L de suspension cellulaire sur le couvercle du plat de culture cellulaire à l'aide d'une pipette multicanal (figure1B (ii)), ce qui entraîne une concentration de 2 000 cellules/goutte. Évitez de placer les gouttes trop près du bord du couvercle, car ces gouttes sont plus susceptibles de perdre la tension de surface lors de l'inversion du couvercle dans l'étape suivante.
    5. Inverser le couvercle dans un mouvement rapide mais contrôlé et le placer sur le 1x PBS-contenant plat de culture cellulaire (Figure 1B (iii)).
    6. Placez le plat dans un incubateur à 37 oC avec 5 % de CO2 et 95 % d'humidité sans perturber les gouttes et laissez-les pousser pendant 4 à 6 jours.
    7. S'il doit être utilisé pour les lysates protéiques ou l'incorporation, mettre en commun les sphéroïdes en enlevant le couvercle et l'incliner, afin de laver les gouttes avec 1 ml de milieu chauffé. Transférer le milieu résultant contenant des sphéroïdes dans un tube de 1,5 ml et leur permettre de se déposer au fond du tube. Procédez comme décrit dans 4.4 et 6.2.2 pour les lysates de protéine et l'incorporation, respectivement.

2. Traitement médicamenteux des sphéroïdes

NOTE: Le traitement médicamenteux à long terme peut être appliqué aux sphéroïdes afin de dépister les effets d'un médicament d'intérêt. Avant de commencer le traitement médicamenteux, il est conseillé d'effectuer une expérience de réponse à la dose du médicament(s), afin de trouver une dose appropriée pour le traitement expérimental. Les doses doivent être basées sur l'IC50/Ki déterminé du médicament et vont d'environ 0,2x-10x de cette valeur.

  1. Mettre en place 6-12 sphéroïdes par condition désirée comme décrit dans 1.2 ou 1.3 et placer dans l'incubateur (37 'C, 5% CO2, 95% d'humidité) pendant 2 jours.
  2. Le jour 2, prenez des images microscopiques légères des sphéroïdes.
  3. Préparer les premières doses de traitement (après l'acquisition d'images).
    NOTE: La première concentration de traitement doit être deux fois la concentration finale désirée car la solution sera diluée 1:2 à l'ajout du puits contenant 100 L de milieu. Intervalles suggérés de traitement de drogue (dépendra de la demi-vie de drogue) : Jour 2, 4 et 7.
  4. À l'aide d'une pipette multicanal, retirer délicatement 100 L de moyenne et la remplacer par 100 L de drogue contenant du milieu.
  5. Remettre la plaque de 96 puits dans l'incubateur à 37 oC avec 5 % de CO2 et 95 % d'humidité et répéter 2,3 et 2,4 les jours choisis de traitement, mais maintenant sans doubler la dose pour obtenir une dose finale correcte.
  6. Le dernier jour du protocole/traitement, un ou plusieurs des essais suivants peuvent être effectués.

3. L'idée de viabilité cellulaire pour les sphéroïdes

  1. Mettre en place 4-6 sphéroïdes par condition désirée comme décrit dans 1.2 ou 1.3 et placer dans l'incubateur à 37 'C avec 5% co2 et 95% d'humidité.
    NOTE: Dans ce cas, l'analyse de viabilité de cellules a été exécutée le jour 7 ou 9, après avoir surveillé la croissance sphéroïde tous les 2-3 jours par la microscopie légère comme décrit ci-dessus (point 1.2.5 et 1.3.13).
  2. Décongeler le réactif d'analyse de viabilité (voir Tableau des matériaux) et laisser s'équilibérer à RT avant de l'utiliser.
  3. Mélanger délicatement en inversant pour obtenir une solution homogène.
  4. Avant d'effectuer l'échec, retirez 50 % du milieu de culture des sphéroïdes (100 L).
  5. Ajouter le réactif de viabilité cellulaire à chaque puits à un rapport de 1:3 par rapport à la quantité de moyenne présente dans le puits (figure 2A (i)) Pour une assiette de 96 puits, ajouter 50 L de réactif à 100 L de milieu.
  6. Mélanger vigoureusement le contenu pendant 5 min pour induire une lyse cellulaire (figure2A (ii)).
  7. Incuber pendant 25 min à RT pour stabiliser le signal luminescent (figure2A (iii)).
  8. Enregistrez le signal luminescent (figure2A (iv)).

4. Préparation de lysates protéiques pour les ballonnements occidentaux des cultures sphéroïdes 3D

NOTE: Lors de la collecte des sphéroïdes, il est conseillé d'utiliser une pipette P200 et couper l'extrémité de la pointe pour permettre une plus grande ouverture et donc une capture plus facile des sphéroïdes sans perturber leur structure.

  1. Pour chaque condition, mettre en commun un minimum de 12, idéalement 18-24 sphéroïdes (selon la taille sphéroïde) dans un tube de 1,5 ml (éviter 2 tubes ml, que les prochaines étapes deviendront plus difficiles en raison de leur fond moins pointu).
    NOTE: Si la quantité de milieu dépasse 1,5 ml avant d'avoir recueilli tous les sphéroïdes, permettre aux sphéroïdes collectés de s'installer au fond (se produit très rapidement, centrifugation pas nécessaire) et jeter la moitié du volume du tube avant de continuer à recueillir le sphéroïdes restants.
  2. Placer les tubes sur la glace et permettre aux sphéroïdes de s'installer au fond du tube de 1,5 ml.
  3. Déplacez-vous du laboratoire de cellules stériles au laboratoire régulier.
  4. Laver les sphéroïdes deux fois dans 1 mL de glace-froid 1x PBS. Laisser les sphéroïdes se déposer avant d'enlever 1x PBS entre chaque étape de lavage.
  5. Aspirer autant 1x PBS que possible sans déranger ou enlever les sphéroïdes.
  6. Ajouter 5 l de tampon de lyse chauffée (LB) avec des inhibiteurs de la phosphatase et de la protéase, par sphéroïde (p. ex., 10 sphéroïdes de 50 LB).
  7. Répétez les intervalles de vortex suivis d'une rotation vers le bas jusqu'à ce que les sphéroïdes soient dissous. Effectuer un cycle de vortex pour 30 s suivi d'une centrifugation (une rotation rapide à l'aide d'une centrifugeuse de table est suffisante) pendant 10 s pour environ 5-10 min selon la taille et la compacité des sphéroïdes.
    NOTE: Le protocole peut être mis en pause ici. Maintenez les lysates à -20 oC jusqu'à ce qu'ils procèdent à la sonication, à l'homogénéisation et à la détermination des protéines, comme dans un protocole standard de lysate protéique 2D, suivi d'un ballonnement occidental à l'aide de protocoles standard.

5. Propidium Iodide (PI) Teinture des sphéroïdes

  1. Mettre en place 3-6 sphéroïdes par condition désirée comme décrit dans 1.2 ou 1.3 et placer dans l'incubateur à 37 'C avec 5% co2 et 95% d'humidité.
  2. Dans un laboratoire de culture cellulaire stérile, chauffer 1x PBS à 37 oC.
  3. Faire une solution PI de 4 M en diluant la solution de stock en 1x PBS: Diluer un 1 mg/mL stock aqueux de PI 1:350 en 1x PBS.
    NOTE: Cette concentration sera encore réduite de moitié à l'ajout de la solution aux puits, ce qui donnera une concentration finale de 2 M. 100 L de cette solution est nécessaire pour chaque puits contenant un sphéroïde.
    ATTENTION: L'iodure de propidium (PI) doit être manipulée dans une hotte de fumée et porter des gants. PI est sensible à la lumière. Protégez-vous de la lumière lors de la manipulation.
  4. Retirez 100 L du milieu de chaque puits dans la plaque de 96 puits sans enlever les sphéroïdes.
  5. Laver le milieu restant en ajoutant 100 L de 1x PBS chauffé à tous les puits, puis en enlevant 100 l de liquide dans les puits. Répétez cette étape de lavage 3 fois.
  6. Ajoutez 100 L de la solution PI à chaque puits, couvrez la plaque dans du papier d'aluminium et placez-la dans un incubateur à 37 oC avec 5 % de CO2 et 95 % d'humidité pendant 10 à 15 min.
  7. Répétez les 3 étapes de lavage décrites dans 4.5 pour laver la solution PI, afin de diminuer le signal de fond lors de l'imagerie.
  8. Utilisez un microscope à épifluorescence pour imager les sphéroïdes. Pour évaluer la viabilité des cellules dans le noyau sphéroïde prendre z-piles pour obtenir des images avec des profondeurs variables du sphéroïde.
    NOTE: Une taille d'étape autour de 18-35 m entre chaque tranche en fonction de la taille sphéroïde est conseillé, donnant environ 11-18 piles par sphéroïde. Les piles Z peuvent être traitées dans ImageJ à l'aide de la fonction z-projection, qui peut combiner toutes les piles z en une seule image finale, donnant un aperçu de la coloration tout au long du sphéroïde (pour d'autres lignes directrices sur l'utilisation d'ImageJ à cette fin, voir (https://imagej.net/Z-functions).

6. Intégration de sphéroïdes 3D

  1. Préparer le gel d'agarose dans lequel les sphéroïdes sont incorporés (seulement nécessaire première fois l'exécution du protocole).
    1. Mélanger 1 g de bactoagar en 50 mL de ddH2O.
    2. Chauffer lentement dans le four à micro-ondes jusqu'à ce que le bactoagar soit dissous et qu'un gel homogène se forme. Ne laissez pas bouillir le gel.
    3. Garder le bactoagar au chaud dans un bain d'eau à 60 oC.
    4. Conserver à 4 oC entre les expériences.
  2. L'intégration des sphéroïdes.
    1. Le jour 1, pour chaque condition, mettre en commun un minimum de 12 sphéroïdes dans un tube de 1,5 ml.
    2. Laver une fois avec 1 mL de glace 1x PBS.
    3. Pour fixer les sphéroïdes, ajouter 1 ml de paraformaldéhyde de 4%.
      NOTE: La manipulation du paraformaldéhyde doit être effectuée dans une hotte de fumée.
    4. Laissez-les incuber pendant 24 h à RT.
    5. Le jour 2, chauffer soigneusement le gel d'agarose en le plaçant dans un bécher rempli d'eau dans un four à micro-ondes. Assurez-vous que le gel ne bout pas! Garder au chaud dans une plaque chauffante sur le banc, à 60 oC jusqu'à l'utilisation.
    6. Laver les sphéroïdes deux fois avec 1 mL de glace 1x PBS.
    7. Aspirer la plupart des 1x PBS (laisser environ 100 L à ce stade est pratique pour la manipulation des sphéroïdes).
    8. Préparer une pipette de 20 L en coupant la pointe de la pipette à une inclinaison pour obtenir une pointe plus pointu avec un trou plus grand (voir illustration).
      NOTE: La partie suivante doit être faite rapidement pour assurer le transfert sphéroïde optimal et pour éviter la solidification de la goutte de gel. Si aucun bloc chauffant n'est disponible, il est recommandé d'attraper d'abord les sphéroïdes, puis de faire tomber l'agarose (c.-à-d., changer l'ordre des points 6.2.9 et 6.2.10).
    9. Faire tomber un gel d'agarose sur une lame de microscope. Placez la glissière sur un bloc chauffant chaud pour empêcher l'agarose de se solidifier.
    10. À l'aide de la pointe de pipette modifiée (voir 6.2.8), attraper autant de sphéroïdes que possible dans un volume de 15-20 L.
    11. Injecter soigneusement le 1x PBS contenant 1x de sphéroïde de 15-20 l au centre de la goutte de gel d'agarose sans toucher la lame du microscope.
      NOTE: C'est un point un peu difficile. Les sphéroïdes seront perdus si la pointe de pipette touche la glissière du microscope lors de l'injection des sphéroïdes dans la goutte de gel. Il est conseillé de pratiquer tout le processus de faire tomber l'agarose et d'injecter les sphéroïdes en injectant un liquide coloré dans la goutte. Cela permettra de visualiser une pénétration potentielle à travers la goutte, car le liquide coloré s'échappera sur la glissière.
    12. Laisser le gel d'agarose durcir en couvant de 5 à 10 min à RT ou à 4 oC. Une fois que la goutte de gel s'est solidifiée un peu (mais est encore assez doux), poussez soigneusement la goutte de gel de la diapositive de microscope dans une cassette de tissu plastique avec un scalpel.
    13. Couvrez les cassettes de tissu plastique dans 70% d'éthanol.
      NOTE: À ce stade, les sphéroïdes peuvent être utilisés directement ou stockés pendant des mois.
    14. Incorporer le sphéroïde anéroïde dans la paraffine, section dans 2-3 diapositives de couche épaisse de 2-3 m et tache avec l'hématoxylin et l'éosine ou sujet à la coloration immuno-histologique.

Résultats

Les essais de croissance sphéroïdes basés sur le protocole de formation sphéroïde schématiquement illustré dans la figure 1A et la figure 1B, ont été utilisés comme point de départ pour l'analyse des effets des traitements anticancéreux dans une tumeur 3D imitant le réglage. La facilité avec laquelle les sphéroïdes sont formés est spécifique à la lignée cellulaire, et certaines lignées cellulaires nécessite...

Discussion

L'utilisation des sphéroïdes de cellules cancéreuses 3D s'est avérée un outil valable et polyvalent non seulement pour le criblage de drogue anticancéreux, mais également pour gagner la perspicacité mécaniste dans la régulation de la mort et de la viabilité de cellules cancéreuses dans des conditions imitant ceux dans la tumeur microenvironnement. Ceci est particulièrement crucial car l'accessibilité, l'utilisation cellulaire, et les effets intracellulaires des drogues chimiothérapeutiques sont profondéme...

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

Remerciements

Nous sommes reconnaissants à Katrine Franklin Mark et Annette Bartels pour l'excellente assistance technique et à Asbjarn N'hr-Nielsen pour l'exécution des expériences dans figure 1D. Ce travail a été financé par la Fondation Einar Willumsen, la Fondation Novo Nordisk et la Fondation Juchum (tous à SFP).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI)Invitrogen# C10595 For staining nuclei
5-Fluorouracil (5-FU)Sigma-Aldrich#F6627Component in chemotherapeutic treatment
5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA)Life Technologies#E3111Inhibitor of NHE1
Antibody against PARP and cPARPCell signaling#9542Used in western blotting
Antibody against Ki-67Cell signaling#9449Used for IHC
Antibody against p53Cell Signaling #2524 Used for IHC
Antibody against β-actinSigma A5441Used in western blotting
BactoagarBD Bioscience#214010Used for agarose gel preparation
Benchmark protein ladderInvitrogen#10747-012Used for SDS-PAGE
Bio-Rad DC Protein Assay kitBio-Rad Laboratories#500-0113, #500-0114, #500-0115  Used for protein determination from lysates
Bürker chamberMarienfeld610311For cell counting 
BX63 epifluoresence microscopeOlympusUsed for fluorescent imaging
CellTiter-Glo 3D Cell Viability AssayPromega#G9681Used for the cell viability assay
CisplatinSigma-Aldrich#P4394 Component in chemotherapeutic treatment
Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom,  Ultra-low attachment, With lid, SterileCorning#4520Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point
Corning 96 well, clear round bottom,  Ultra-low attachment microplate, With lid, SterileCorning#7007Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point
Criterion TGX Precast GelsBio-Rad5671025Used for SDS-PAGE
DoxorubicinAbcam#120629Component in chemotherapeutic treatment
FLUOStar Optima Microplate readerBMG LabtechUsed for recording luminescence 
Formaldehyde VWR Chemicals #9713.1000 Used for cell fixation
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixGibco#A1413202Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol.
Heat-inactivated FBSSigma#F9665Serum for growth media
ImageJNIHScientific Image analysis
Medim Uni-safe casetteMedim Histotechnologie10-0114Used for storage of embedded spheroids
Mini protease inhibitor cocktail tabletsRoche Diagnostics GmBH # 11836153001Used for lysis buffer preparation
MZ16 microscopeLeicaUsed for light microscopic images
NuPAGE LDS 4x Sample Buffer Invitrogen#NP0007Used for western blotting
Pierce ECL Western blotting substrateThermo scientific#32106Used for western blotting
Ponceau SSigma-Aldrich#P7170-1LUsed for protein band staining
Prism 6.0GraphpadScientific graphing and statistical software
Propidium iodide (1mg/ml solution in water)Invitrogen P3566Light sensitive 
Sterile reservoirs, multichannelSPL lifesciences21002Used for seeding cells for spheroid formation
Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide Menzel-Gläser#J3800AMNZMicroscope glass slide used for embedding
TamoxifenSigma-Aldrich#T5648Used as chemotherapeutic treatment
Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranesBio-Rad#170-4159Used for western blotting
Tris/Glycine/SDS running buffer Bio-Rad #161 0732Used for SDS-PAGE
Trypsin-EDTA solutionSigma#T4174 Cell dissociation enzyme

Références

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