癌細胞の3Dスフェロイド培養における細胞生存率と死の評価

要約

ここでは、生体内腫瘍の物理化学勾配を2D培養よりもはるかに優れた3D癌細胞スフェロイドで生存率と死亡を評価するためのいくつかの簡単な方法を紹介する。したがって、スフェロイドモデルは、生体内条件への翻訳を改善した癌薬効の評価を可能にする。

要約

がん細胞の三次元スフェロイドは、がんの薬物スクリーンとがん細胞生物学に対する機械的な洞察を得るための重要なツールです。この調製の力は、比較的高スループットスクリーニングを可能にするのに十分な速く、安価で汎用性がある一方で、腫瘍の生体内状態の多くの側面を模倣する能力にあります。スフェロイド培養条件は、細胞外の酸性度の増加、乳酸の増加、グルコースおよび酸素の利用可能性の低下を含む腫瘍内の物理化学勾配を、スフェロイド周辺からその中心まで要約することができる。また、生体内腫瘍の機械的特性および細胞間相互作用は、このモデルによって部分的に模倣される。3Dスフェロイドの特定の特性と結果的に最適な増殖条件は、異なるタイプの癌細胞間で大きく異なります。さらに、3Dスフェロイドにおける細胞の生存率と死亡の評価には、2D培養に用いられるものとは部分的に異なる方法が必要です。ここでは、がん細胞の3Dスフェロイドを準備するためのいくつかのプロトコルを説明し、そのような培養物を使用して、抗癌剤の有効性を評価する文脈で細胞の生存率と死亡を評価する。

概要

がん生物学における多細胞スフェロイドモデルの使用は数十年前^の1、2であるが、近年かなりの勢いを得た。大部分は、がん細胞の表現型が微小環境と特定の成長条件にどれだけ強く依存しているかの認識の増加を反映しています。固形腫瘍の微小環境は、対応する正常組織の微小環境とは根本的に異なる。これには、pH、酸素張力、間質圧、栄養素、廃棄物、分泌シグナル伝達化合物(成長因子、サイトカイン)などの可溶性因子の濃度勾配が含まれます。さらに、細胞外マトリックス(ECM)の組織、細胞間相互作用および細胞間シグナル伝達、および腫瘍3、4の特定の3次元(3D)アーキテクチャの他の態様を含む。 ^5,6.がん細胞が存在する特定の微小環境条件は、遺伝子発現プロファイルと機能性に大きく影響し、2Dで増殖した細胞の表現型と比較して、3Dスフェロイドの表現型がはるかに密接に模倣していることは明らかである。生体内腫瘍7、8、9、10、11のそれ。2Dモデルは、低酸素症、酸性pH、高乳酸濃度を用いて腫瘍微小環境の既知の側面を模倣しても、腫瘍内で生じる物理化学的パラメータの勾配や3D腫瘍を捕捉できない。アーキテクチャ。一方、動物モデルは高価で、遅く、倫理的に問題があり、一般的に、ヒト腫瘍の状態を要約する能力にも欠点があります。その結果、3Dスフェロイドは、ほとんどの固形癌9、11、12、13、^{および幅広い特性の研究において中間複雑性モデルとして適用されている。14,15,16,17}.

3Dスフェロイドの広く採用されている使用は、抗癌治療の有効性9、18、19、20のスクリーニングアッセイにあります。治療応答は、薬物送達に対する拷問、制限拡散、高い間質圧、酸性環境pHの薬物送達への影響、低酸素症および他の影響の両方を反映して、腫瘍微小環境に特に敏感である。細胞死応答9,17に関する微小環境^の態様。3Dスフェロイド内の環境は、これらの特性のすべてが本質的に発達^{するので、3D}細胞培養物を採用し、結果を生体内条件に大幅に改善し、同時に、正味成長の効率的で手頃な価格のハイスループットスクリーニングを可能にします。しかし、癌細胞の薬物応答に関する研究の大半は、依然として2D条件下で行われている。これは、一部のアッセイが3D細胞培養に比較的容易に実装できる一方で、生存率アッセイ、ウェスタンブロッティング、免疫蛍光分析などの多くが、3Dよりも2Dではるかに便利に行われていることを反映している可能性があります。

本研究の目的は、抗癌剤による治療が癌細胞の生存率および生存に及ぼす効果を3D腫瘍模倣設定で容易に分析するための容易なアッセイと正確なプロトコルを提供することである。具体的には、スフェロイド形成に関する3つの異なる方法を提供し、比較し、続いて成長、生存率、薬物応答の定性的および定量的分析の方法を提供し、比較する。

プロトコル

1. スフェロイドの生成

1. スフェロイド形成のための細胞懸濁液の準備
   注:異なる細胞株は非常に異なる接着特性を有し、最も適切なスフェロイド形成プロトコルは、それぞれのケースで確立されなければならない。MCF-7およびBxPC-3細胞は自発的なスフェロイド形成に適していることが分かっていますが、MDA-MB-231、SKBr-3、Panc-1およびMiaPaCaは、スフェロイドを正常に形成するために再構成された地下膜を添加する必要があります。ぶら下がり降下プロトコルにはMDA-MB-231とBxPC-3セルのみが採用されていますが、他の細胞株は確かに適用可能です。
   1. 70-80%の合流まで単層として細胞を成長させる。
   2. リン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄(1x PBS、25 cm²または75cm²フラスコの場合は10mL)、細胞解離酵素(25cm 2または75cm2フラスコの場合は1mL)を追加し、37°Cで2〜5分の細胞をインキュベートします。5%のCO₂および95%の湿度で。
   3. 顕微鏡下で細胞剥離を確認し、成長培地(細胞株に応じて6~10%血清)を25cm2または75cm2フラスコの10mLで5mLの総体積に加えて細胞解離酵素を中和します。
   4. 球を数え、セル調製物ごとにチャンバー内の8つの正方形を数え、スフェロイドの大きさの高い再現性を得るために、Bürkerチャンバーを使用してください。
      注:スフェロイド形成のための異なる方法を記述する3つのプロトコルを以下に示す。プロトコル 1.2 および 1.3 は、提示される後続のすべての分析プロトコルに使用できますが、プロトコル 1.4 は埋め込みおよび溶解準備に最適です。細胞株に応じて、使用する方法にかかわらず、スフェロイド形成には2〜4日かかります。
2. 自発的なスフェロイド形成
   1. 手順 1.1.1-1.1.4 を実行します。
   2. 15 mLチューブで細胞懸濁液を希釈し、0.5-2 x 10⁴細胞/mL(細胞株ごとに最適な細胞密度を決定する必要がある)を得る(図1A(ii)))
   3. 残りのウェルからの蒸発を減らすために1x PBSまたは成長媒体で井戸の外輪を埋めます。細胞懸濁液を無菌貯留槽に移し、マルチチャンネルピペットを使用して、200 μL/ウェルを超低アタッチメント96ウェル丸底板に分配する(図1A(iii)))。
   4. 5%CO 2、95%の湿度で37°Cでプレートをインキュベーターでインキュベートします。
   5. 2~3日ごとに、スフェロイドの光顕微鏡画像を取得します。
      注:このホワイトペーパーの画像は11.5倍の倍率で撮影されており、これらのプロトコルを使用して調製されたほとんどのスフェロイドに適しています。
   6. 2~3日ごとに(画像を取得した後)、100 μLの培地を交換します(使用済み培地の100μLを取り除き、100μLの新鮮な培地に置き換えます)。
      注:媒体を交換する際にスフェロイドを取り除くことを避けるために、培地をゆっくりと取り外しながらプレートを少し傾け、それを廃棄する前に、目に見えるスフェロイドの先端にある吸引媒体を検査することをお勧めします。
3. 再構成された地下膜媒介性スフェロイド形成。
   注:ラクトース脱水素酵素上昇ウイルス(LDEV)フリー還元増殖因子再構成基系基体膜(rBM)を用いていた。rBMは温度に敏感であり、それが15 °Cに達した場合に凝固するように、常に氷の上に保つ必要があります。メッキの前に室温(RT)で一晩4°Cまたは2-4hで氷の上のrBMを解凍します。
   1. 氷上でrBMを解凍する(材料の表を参照)。
   2. 使用前にプレートと貯水池(個別に包んだ場合)を氷の上に保管してください。
   3. 手順 1.1.1-1.1.4 を実行します。
   4. 残りのウェルからの蒸発を減らすために1x PBSまたは成長媒体で井戸の外輪を埋めます。15 mLチューブで細胞懸濁液を希釈し、0.5-2 x 10⁴細胞/mL(細胞株ごとに最適な細胞密度を決定する必要がある)を得る(図1A(ii)))
   5. 希釈した細胞懸濁液を含む15mLチューブを氷上に置く(例えば、ガラスビーカー)(図1A(iia)))。
   6. 冷蔵プレートと貯水池をフードに移します。プラスチック容器をすすいで、氷で満たし、フードに移し、手順全体の間にプレートと貯水池を氷の上に置くことを可能にします。
   7. rBMを穏やかに再中断し、均質なゲルを確保します。
   8. チルド細胞懸濁液に1-2%rBM(各細胞株に最適な濃度を決定する必要がある)を加える(図1A(iib)))。
   9. 15 mLチューブを反転して、サスペンションをプレートに分配する前に、rBMとセルサスペンションの適切な混合を確認します。
   10. rBM含有細胞懸濁液を無菌貯留槽に移し、マルチチャンネルピペットを使用して200 μL/ウェルをチルド超低アタッチメント96ウェルプレートに分配する(図1A(iii)))
       注:複数の細胞懸濁液(例えば、複数の細胞株)で作業する場合、早期ゲル化を防ぐためにrBM添加直後に各細胞懸濁液を分配することが不可欠である。
   11. 「ソフトまともな」/ノーブレーキ(可能であれば、rBM流体を長く保つために4°Cで遠心分離機を使用するが、スフェロイド形成を成功させるための要件ではない)を使用して、750 x gで15分間プレートを遠心分離し、rBMの際に細胞が一緒にクラスター化されることを保証する。硬化し、単一のスフェロイドの形成を容易にする。
   12. インキュベーター(37°C、5%CO 2、湿度95%)でプレートをインキュベートします。
   13. 2~3日ごとに、スフェロイド成長の評価のために光顕微鏡画像を取得します。
   14. 2~3日ごとに100μLの培地を交換してください(100 μLを取り外し、100μLの新鮮な培地に置き換えます)。
4. ぶら下がりドロップスフェロイド。
   1. ステップ 1.1.1-1.1.4 を実行します。
   2. 細胞を希釈して、適切な希釈を得る。実用的な希釈は50,000細胞/mLである。
   3. 10cm²細胞培養皿の蓋を取り外し、上向きに置きます。皿に1x PBSの6 mLを加える(図1B(i)))。
   4. 細胞懸濁液を無菌貯留槽に注ぎ、マルチチャンネルピペット(図1B(ii))を用いて細胞培養皿の蓋に40μLの細胞懸濁液を30滴まで慎重に置き、2,000セル/ドロップの濃度を得る。これらの滴は、次のステップで蓋を反転する際に表面張力を失う可能性が高いため、滴を蓋の端に近づけないようにしてください。
   5. 蓋を素早く制御した動きで反転させ、1x PBS含有細胞培養皿の上に置きます(図1B(iii)))。
   6. 落としを妨げることなく、5%CO2と95%の湿度で37°Cのインキュベーターに皿を置き、4-6日間成長させるためにそれらを残します。
   7. タンパク質の分解物または埋め込みに使用する場合は、蓋を取り外して傾けてプールスフェロイドを、加熱媒体の1mLで滴を洗い流すために。得られたスフェロイドを含む培地を1.5mLチューブに移し、チューブの底部に落ち着きます。タンパク質のライサットおよび埋め込みに関しては、4.4 および 6.2.2 で説明されているように進みます。

2. スフェロイドの薬物治療

注:長期薬物治療は、目的の薬物の効果をスクリーニングするためにスフェロイドに適用することができる。薬物治療を開始する前に、実験治療のための適切な用量を見つけるために、薬物の用量応答実験を行うことをお勧めします。用量は、薬物の決定されたIC₅₀/K_iに基づいており、この値の約0.2x-10倍の範囲である必要があります。

1. 1.2または1.3に記載されているように所望の条件ごとに6-12の回転楕円体を設定し、インキュベーター(37°C、5%CO2、95%湿度)に2日間置きます。
2. 2日目に、スフェロイドの光顕微鏡画像を撮ります。
3. 最初の治療用量を準備する(画像を取得した後)。
   注:第1の処理濃度は、溶液が100μL培地を含むウェルに加えて1:2に希釈されるので、所望の最終濃度の2倍でなければならない。推奨薬物治療間隔(薬物半減期に依存する):2日目、4日目、7日目。
4. マルチチャンネルピペットを使用して、100 μLの培地を静かに取り出し、100μLの薬剤含有培地に置き換えます。
5. 96ウェルプレートを5%のCO2および95%の湿度で37°Cのインキュベーターに戻し、選択した治療日に2.3と2.4を繰り返しますが、現在は正しい最終用量を得るために用量を倍増することなく行います。
6. プロトコル/治療スケジュールの最終日に、以下のアッセイの1つまたは複数を行うことができる。

3. スフェロイドの細胞生存率アッセイ

1. 1.2または1.3に記載されているように所望の条件ごとに4-6のスフェロイドを設定し、5%のCO₂および95%の湿度で37 °Cでインキュベーターに置きます。
   注:この場合、細胞生存率アッセイは、上記のように光顕微鏡検査により2〜3日ごとにスフェロイド増殖をモニタリングした後、7日目または9日目に行った(ポイント1.2.5および1.3.13)。
2. 生存率アッセイ試薬(材料の表を参照)を解凍し、使用前にRTに平衡させます。
3. 反転して穏やかに混合し、均質な溶液を得る。
4. アッセイを行う前に、スフェロイド(100μL)から培養培地の50%を取り出します。
5. ウェル内に存在する培地の量に対して1:3の比率で各ウェルに細胞生存率試薬を添加する(図2A(i))96ウェルプレートの場合は、50μLの試薬を100μLの培地に添加する。
6. 細胞リシスを誘発するために5分間内容物を激しく混合する(図2A(ii))。
7. RTで25分間インキュベートして発光信号を安定させる(図2A(iii)))。
8. 発光信号を記録します(図2A(iv)))

4. 3Dスフェロイド培養物からの西洋ブロッティング用タンパク質リサテスの準備

注:スフェロイドを収集するときは、P200ピペットを使用し、より大きな開口部を可能にするために先端の端をカットし、したがって、その構造を妨げることなく、スフェロイドの簡単なキャプチャを行うことをお勧めします。

1. 各条件について、1.5 mLチューブ内の最低12、理想的には18〜24個のスフェロイド(スフェロイドサイズに応じて)をプールします(次のステップは、その尖った底が少ないため、次のステップがより困難になるので、2 mLチューブを避けてください)。
   注:培地の量がすべてのスフェロイドを収集する前に1.5 mLを超える場合は、収集したスフェロイドが底部に落ち着くことを可能にし(非常に迅速に起こり、遠心分離は必要ない)、収集を続ける前にチューブの体積を廃棄する残りのスフェロイド。
2. 氷の上にチューブを置き、スフェロイドが1.5 mLチューブの底部に落ち着くようにします。
3. 無菌細胞実験室から通常の実験室に移動します。
4. 氷冷1x PBSの1 mLで2回スフェロイドを洗浄します。各洗浄ステップの間に1x PBSを除去する前に、スフェロイドを落ち着かせてください。
5. スフェロイドを邪魔したり取り除いたりすることなく、可能な限り多くの1x PBSを吸引します。
6. スフェロイド当たりホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を使用して5μLの加熱リシスバッファー(LB)を追加します(例えば、10スフェロイド=50 μL LB)。
7. 渦の間隔を繰り返し、スフェロイドが溶解するまでスピンダウンします。30sのボルテックスのサイクルを実行し、その後、遠心分離(卓上遠心分離機を使用したクイックスピンで十分です)を約5〜10分間、回転体の大きさとコンパクトさに応じて約10sの間で行います。
   注:プロトコルはここで一時停止できます。標準的な2Dタンパク質リサートプロトコルのように超音波処理、均質化およびタンパク質決定を進めるまで-20°Cでライサテを保ち、その後標準プロトコルを使用してウェスタンブロッティングを行います。

5. ヨウ化プロピジウム(PI)スフェロイド染色

1. 1.2または1.3に記載されているように、所望の条件ごとに3-6のスフェロイドを設定し、5%のCO₂および95%の湿度で37 °Cでインキュベーターに置きます。
2. 無菌細胞培養ラボでは、1x PBSを37°Cに加熱します。
3. 1x PBSでストック溶液を希釈することにより4 μMのPI溶液を作る:1x PBSでPI 1:350の1mg/mL水性ストックを希釈する。
   注:この濃度は、この溶液の最終濃度2μM.100μLを与えるウェルに溶液を添加するとさらに半減され、スフェロイドを含む各ウェルに必要となる。
   注意:ヨウ化プロピジウム(PI)は、ヒュームフードで処理し、手袋を着用する必要があります。PI は光に敏感です。取り扱い時は光から保護します。
4. スフェロイドを取り除かずに、96ウェルプレートの各ウェルから100μLの培地を取り除きます。
5. すべてのウェルに100 μLの加熱された1x PBSを加え、その後、ウェル内の液体の100 μLを除去することにより、残りの培地を洗い流します。この洗浄工程を3回繰り返します。
6. 各井戸にPI溶液の100 μLを追加し、アルミ箔でプレートを覆い、5%CO₂と95%の湿度で37°Cのインキュベーターに10〜15分間置きます。
7. 4.5に記載の3回の洗浄手順を繰り返してPI溶液を洗い流し、イメージング時のバックグラウンド信号を減少させる。
8. エピ蛍光顕微鏡を使用して、スフェロイドを画像化します。スフェロイドコア内の細胞の生存率を評価するには、Zスタックを取り、スフェロイドの様々な深さの画像を取得します。
   注:スフェロイドサイズに応じて各スライス間の18〜35 μmの周りのステップサイズは、スフェロイドあたり約11〜18スタックを与えることをお勧めします。Z スタックは、すべての Z スタックを 1 つの最終的な画像に結合できる Z 投影関数を使用して ImageJ で処理でき、スフェロイド全体の染色の概要を説明します (この目的での ImageJ の使用に関するさらなるガイドラインについては、(https://imagej.net/Z-functions)を参照してください)。

6. 3Dスフェロイドの埋め込み

1. スフェロイドが埋め込まれているアガロースゲルを準備します(プロトコルを初めて実行する必要があります)。
   1. ddH₂Oの50 mLにバクトーアガルの1gを混ぜます。
   2. バクトーガーが溶けて均質なゲルが形成されるまで、電子レンジでゆっくりと加熱します。ゲルを沸騰させないようにしてください。
   3. バクトーアガルは60°Cの水浴で暖かく保ちます。
   4. 実験の間に4 °Cに保つ。
2. スフェロイドの埋め込み。
   1. 1日目には、各条件について、1.5 mLチューブに最低12個のスフェロイドをプールします。
   2. 1mLの氷冷1x PBSで1回洗います。
   3. スフェロイドを固定するには、4%パラホルムアルデヒドの1 mLを追加します。
      注:パラホルムアルデヒドの取り扱いは、ヒュームフードで行う必要があります。
   4. RTで24時間インキュベートさせてください。
   5. 2日目は、アガロースゲルを電子レンジで水で満たしたビーカーに入れ、注意深く加熱します。ゲルが沸騰しないことを確認してください!使用するまで60°Cでベンチトップ加熱プレートで暖かく保ちます。
   6. 1 mLの氷冷1x PBSでスフェロイドを2回洗います。
   7. 1x PBSのほとんどを吸引する(この時点で約100μLを残すことは、スフェロイドを扱う実用的である)。
   8. 20 μL ピペットを傾斜で切り取り、より大きな穴を持つ先端を得ます(図を参照)。
      注:次の部分は、最適なスフェロイド転写を確保し、ゲルドロップの固化を避けるために迅速に行う必要があります。加熱ブロックがない場合は、まずスフェロイドをキャッチしてからアガロースドロップ(ポイント6.2.9と6.2.10の順序を切り替える)を行うことをお勧めします。
   9. 顕微鏡スライドにアガロースゲルを落とします。アガロースが固化するのを防ぐために、暖かい加熱ブロックにスライドを置きます。
   10. 修正されたピペット先端(6.2.8を参照)を使用して、15-20 μLの体積でできるだけ多くのスフェロイドをキャッチします。
   11. 顕微鏡スライドに触れることなく、15-20 μLスフェロイド含有1x PBSをアガロースゲルドロップの中心に慎重に注入します。
       注:これは少し難しい点です。スピペットの先端がゲルドロップにスフェロイドを注入する際に顕微鏡スライドに触れると、スフェロイドは失われます。アガロースドロップを作り、ドロップに着色された液体を注入することによって、スフェロイドを注入する全体のプロセスを練習することをお勧めします。これは、着色された液体がスライドに漏れ出すように、ドロップを介して潜在的な浸透の視覚化を可能にします。
   12. アガロースゲルドロップは、RTまたは4°Cで5〜10分間インキュベートすることによって硬化させます。ゲル滴がいくらか固まったら(しかしまだかなり柔らかい)、慎重にメスでプラスチックティッシュカセットに顕微鏡スライドからゲルドロップをプッシュします。
   13. 70%エタノールでプラスチック組織カセットをカバーします。
       注:この時点で、スフェロイドは直接使用することも、数ヶ月間保存することもできます。
   14. パラフィンにアガロース埋め込みスフェロイドを埋め込み、2-3 μmの厚い層スライドにセクションを埋め込み、ヘマトキシリンとエオシンで染色するか、または免疫組織染色の対象となる。

結果

図1A及び図1Bに概略的に示したスフェロイド形成プロトコルに基づくスフェロイド成長アッセイは、3D腫瘍における抗癌剤治療の効果を分析するための出発点として用いた。模倣設定。スフェロイドが形成される容易さは細胞株特異的であり、一部の細胞株は一貫性のあるスフェ^ロイド22を形成するためにr...

ディスカッション

3D癌細胞スフェロイドの使用は、抗癌剤スクリーニングのためだけでなく、腫瘍内のものを模倣する条件下で癌細胞死と生存率の調節に機械的な洞察を得るための貴重で汎用性の高いツールを証明しています。マイクロ環境。これは、化学療法薬のアクセシビリティ、細胞取り込み、および細胞内効果が、pH、酸素張力、拷問性、および物理的および物理的および腫瘍内の物理化学的状態によ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI)	Invitrogen	# C10595	For staining nuclei
5-Fluorouracil (5-FU)	Sigma-Aldrich	#F6627	Component in chemotherapeutic treatment
5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA)	Life Technologies	#E3111	Inhibitor of NHE1
Antibody against PARP and cPARP	Cell signaling	#9542	Used in western blotting
Antibody against Ki-67	Cell signaling	#9449	Used for IHC
Antibody against p53	Cell Signaling	#2524	Used for IHC
Antibody against β-actin	Sigma	A5441	Used in western blotting
Bactoagar	BD Bioscience	#214010	Used for agarose gel preparation
Benchmark protein ladder	Invitrogen	#10747-012	Used for SDS-PAGE
Bio-Rad DC Protein Assay kit	Bio-Rad Laboratories	#500-0113, #500-0114, #500-0115	Used for protein determination from lysates
Bürker chamber	Marienfeld	610311	For cell counting
BX63 epifluoresence microscope	Olympus		Used for fluorescent imaging
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	#G9681	Used for the cell viability assay
Cisplatin	Sigma-Aldrich	#P4394	Component in chemotherapeutic treatment
Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom,  Ultra-low attachment, With lid, Sterile	Corning	#4520	Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point
Corning 96 well, clear round bottom,  Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile	Corning	#7007	Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point
Criterion TGX Precast Gels	Bio-Rad	5671025	Used for SDS-PAGE
Doxorubicin	Abcam	#120629	Component in chemotherapeutic treatment
FLUOStar Optima Microplate reader	BMG Labtech		Used for recording luminescence
Formaldehyde	VWR Chemicals	#9713.1000	Used for cell fixation
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	Gibco	#A1413202	Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol.
Heat-inactivated FBS	Sigma	#F9665	Serum for growth media
ImageJ	NIH		Scientific Image analysis
Medim Uni-safe casette	Medim Histotechnologie	10-0114	Used for storage of embedded spheroids
Mini protease inhibitor cocktail tablets	Roche Diagnostics GmBH	# 11836153001	Used for lysis buffer preparation
MZ16 microscope	Leica		Used for light microscopic images
NuPAGE LDS 4x Sample Buffer	Invitrogen	#NP0007	Used for western blotting
Pierce ECL Western blotting substrate	Thermo scientific	#32106	Used for western blotting
Ponceau S	Sigma-Aldrich	#P7170-1L	Used for protein band staining
Prism 6.0	Graphpad		Scientific graphing and statistical software
Propidium iodide (1mg/ml solution in water)	Invitrogen	P3566	Light sensitive
Sterile reservoirs, multichannel	SPL lifesciences	21002	Used for seeding cells for spheroid formation
Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide	Menzel-Gläser	#J3800AMNZ	Microscope glass slide used for embedding
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	#T5648	Used as chemotherapeutic treatment
Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes	Bio-Rad	#170-4159	Used for western blotting
Tris/Glycine/SDS running buffer	Bio-Rad	#161 0732	Used for SDS-PAGE
Trypsin-EDTA solution	Sigma	#T4174	Cell dissociation enzyme