Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים מספר שיטות פשוטות להערכת הכדאיות והמוות ב-3D הסרטן תאים spheroids, אשר לחקות את פיזיקאלית-כימיים מעברי הצבע של גידולים vivo הרבה יותר טוב מאשר תרבות דו-ממדית. מודל ספרואיד, לכן, מאפשר הערכה של יעילות התרופה לסרטן עם תרגום משופר בתנאים vivo.

Abstract

Spheroids תלת מימדי של תאים סרטניים הם כלים חשובים עבור שני מסכי תרופה לסרטן, לקבלת תובנה מכניסטית לביולוגיה תא סרטן. הכוח של הכנה זה טמון ביכולתה לחקות היבטים רבים של התנאים vivo של גידולים תוך להיות מהיר, זול, תכליתי מספיק כדי לאפשר יחסית הקרנת תפוקה גבוהה. תנאי התרבות הספרואיד יכולים ללכוד את מעברי הצבע הפיזיקאלית-כימיים בגידול, כולל חומציות החילוץ ההולכת וגוברת, מוגברת לקטט, והפחתת הגלוקוז וזמינות החמצן, מהפריפריה הספרואיד עד ליבה. כמו כן, תכונות מכניות ואינטראקציות תא התא של גידולים vivo הם חלק מחקה על ידי מודל זה. המאפיינים הספציפיים וכתוצאה מכך את תנאי הצמיחה האופטימלי, של spheroids 3D, שונים באופן נרחב בין סוגים שונים של תאים סרטניים. יתר על כן, הערכת הכדאיות של תאים ומוות ב-spheroids 3D דורש שיטות שונות בחלק מאלה מועסקים עבור תרבויות דו-ממדיות. כאן אנו מתארים מספר פרוטוקולים להכנת spheroids תלת-ממד של תאים סרטניים, ועל שימוש בתרבויות כאלה כדי להעריך את הכדאיות התאים ואת המוות בהקשר של הערכת היעילות של תרופות נגד סרטן.

Introduction

השימוש במודלים ספרואידים בביולוגיה של סרטן הוא מספר עשורים בן1,2, אבל צבר מומנטום משמעותי בשנים האחרונות. בחלק הגדול, זה משקף את המודעות הגוברת של כמה חזק הפנוטיפ של תאים סרטניים תלוי המיקרוסביבה שלהם ותנאי גדילה ספציפיים. המיקרואקולוגיה בגידולים מוצקים שונה ביסודה מזה ברקמות הנורמלי המקביל. זה כולל מצבים פיזיקאלית-כימיים כגון pH, מתח חמצן, כמו גם הלחץ ביניים, ריכוז מעברי הצבע של גורמים מסיסים כגון חומרים מזינים, פסולת מוצרים, מופרש תרכובות איתות (גורמי גדילה, ציטוקינים). יתרה מזאת, היא כוללת את הארגון של מטריצה החילוץ (ecm), אינטראקציות תא תא ו איתות התרבות, והיבטים אחרים של הארכיטקטורה תלת ממדית מסוימת (3d) של הגידול3,4, 5,6. התנאים המיקרוסביבתיים הספציפיים שבהם תאים סרטניים קיימים, משפיעים עמוקות על פרופיל הביטוי הגנטי שלהם ועל תכונות הפונקציונליות שלהם, וברור כי בהשוואה לאלה של תאים שגדלו ב-2D, הפנוטיפ של הספרואידים תלת-ממדיים הרבה יותר מחקה מקרוב זה של בvivo גידולים7,8,9,10,11. 2D מודלים, גם אם הם מעסיקים היפוקסיה, חומציות חומצי, וריכוזים גבוהים לקטט לחקות היבטים ידועים של מיקרוסביבה הגידול, עדיין להיכשל ללכוד את מעברי הצבע של הפרמטרים פיזיקאלית-כימיים הנובעים בתוך גידולים, כמו גם גידול תלת-ממד שלהם אדריכלות. מאידך, מודלים בעלי חיים יקרים, איטיים ובעייתיים באופן מבחינה מוסרית, ובדרך כלל גם יש חסרונות ביכולתם ללכוד את מצבם של הגידול האנושי. אפוא, 3d spheroids הוחלו כמודל מורכבות ביניים במחקרים של מגוון רחב של מאפיינים של סרטן מוצק ביותר9,11,12,13, 14,15,16,17.

שימוש נרחב בשימוש בspheroids 3d הוא בהקרנה בחני של טיפול אנטי סרטן יעילות9,18,19,20. תגובות הטיפול רגישות במיוחד מיקרוסביבה הגידול, המשקף הן את ההשפעה של tortuosity, דיפוזיה מוגבלת, לחץ ביניים גבוהה, ו-pH הסביבה חומצי על משלוח תרופות, ואת ההשפעה של היפוקסיה ועוד היבטים של המיקרו-סביבה על תגובת מוות בתא9,17. בגלל הסביבה בתוך spheroids 3d מפתחת באופן מיסודו את כל המאפיינים הללו7,8,9,10,11, העסקת תרבויות 3d תאים יכול ל לשפר באופן משמעותי את התרגום של תוצאות בתנאים vivo, ועם זאת לאפשר הקרנת תפוקה גבוהה יעילה ובמחיר סביר של הצמיחה נטו. עם זאת, הרוב הגדול של המחקרים על תגובת התרופה של תאים סרטניים עדיין מתבצעות תחת תנאים 2D. זה כנראה משקף כי, בעוד כמה בחני יכול בקלות להיות מיושם עבור תרבויות תא תלת-ממד, רבים, כגון הכדאיות, כתמים מערביים, וניתוח immunofluorescence, הם הרבה יותר נוח לעשות ב-2d מאשר 3d.

מטרת העבודה הנוכחית היא לספק בקלות הקלה מענה ופרוטוקולים מדויקים עבור ניתוחים של השפעת הטיפול עם תרופות נגד סרטן על הכדאיות של תאים סרטניים והישרדות בקביעת הגידול תלת ממדי מחקה. באופן ספציפי, אנו מספקים ולהשוות שלוש שיטות שונות עבור היווצרות כספרואיד, ואחריו שיטות לניתוח איכותי וכמותי של צמיחה, הכדאיות ותגובת התרופה.

Protocol

1. הדור של הספרואידים

  1. הכנת השעיות של תאים עבור היווצרות הספרואיד
    הערה:     לקווי תאים שונים יש מאפייני הדבקה שונים מאוד והפרוטוקול המתאים ביותר של היווצרות הספרואיד חייב להיות מבוסס בכל מקרה. מצאנו כי MCF-7 ו-BxPC-3 תאים מתאימים היווצרות ספרואיד ספונטנית, בעוד מד א-MB-231, SKBr-3, Panc-1 ו-MiaPaCa דורשים תוספת של קרום מרתף מחדש לטופס בהצלחה spheroids. רק מד א-MB-231 ו BxPC-3 תאים שהיו מועסקים עבור פרוטוקול ירידה תלויה, עם זאת קווי תאים אחרים בהחלט ישים.
    1. הגדל תאים כמונאולייר עד 70-80% השטף.
    2. לשטוף תאים עם תמיסת מלח מאגור פוספט (1x PBS, 5 מ"ל עבור 25 ס מ2 או 10 מ"ל עבור 75 ס מ2 בקבוקון), להוסיף את האנזים הדיסוציאציה של התא (0.5 mL עבור 25 ס"מ או 1 מ"ל עבור 75 ס מ2 בקבוקון) ו מודרת תאים עבור 2-5 דקות ב 37 ° c ב 5% CO2 ו 95% לחות.
    3. בדוק את התנתקות התא תחת מיקרוסקופ ולנטרל את האנזים הדיסוציאציה של התא על ידי הוספת בינונית צמיחה (6-10% סרום בהתאם לקו התא) לנפח הכולל של 5 מ"ל ב 25 ס מ2 או 10 מ ל עבור 75 ס מ2 בקבוקון.
    4. השתמש בחדר בורקר כדי לספור תאים ולספור 8 ריבועים בחדר לכל ההכנה לתא כדי לקבל מהווה מהווה מהווה בגודל של הספרואידים.
      הערה: שלושה פרוטוקולים כל אחד מתאר שיטה שונה עבור היווצרות כספרואיד מוצגים להלן. פרוטוקול 1.2 ו 1.3 יכול לשמש עבור כל הפרוטוקולים האנליטיים הבאים הציג, בעוד פרוטוקול 1.4 הוא המתאים ביותר להטבעה ולאחר ההכנות. בהתאם לקו התא, היווצרות ספרואיד לוקח 2-4 ימים, ללא קשר לשיטה שבשימוש.
  2. מבנה ספרואיד ספונטני
    1. בצע את השלבים 1.1.1-1.1.4.
    2. לדלל את ההשעיה התא בצינור 15 מ ל כדי להשיג 0.5-2 x 104 תאים/mL (צפיפות התא אופטימלית צריך להיקבע עבור כל קו תא) (איור 1א (ii)).
    3. ממלאים את הטבעת החיצונית של בארות עם 1x PBS או בינוני גדילה כדי להפחית אידוי מבארות שנותרו. להעביר את ההשעיה התא כדי מאגר סטרילי, באמצעות הצנרת רב-ערוצי, לוותר 200 μL/גם לתוך הקובץ המצורף אולטרה נמוך 96-היטב לוחות התחתונה עגול (איור 1a).
    4. מודקת את הצלחת בחממה ב 37 ° c עם 5% CO2, 95% לחות.
    5. כל 2-3 ימים רוכשים תמונות מיקרוסקופיים קלות של הספרואידים.
      הערה: התמונות בנייר זה נלקחים בהגדלה 11.5 x, אשר מתאים ביותר spheroids שהוכנו באמצעות פרוטוקולים אלה.
    6. כל 2-3 ימים (לאחר רכישת תמונות) להחליף 100 μL של בינוני (להסיר 100 μL של בינוני בילו ולהחליף עם 100 μL של מדיום טרי.
      הערה: כדי למנוע הסרת spheroids בעת החלפת בינוני, מומלץ להטות את הצלחת קצת באיטיות הסרת המדיום ולבדוק את המדיום משומת בטיפים לראות spheroids לפני להשליך אותו.
  3. מבנה מרתף ממברנה-תיווך ספרואיד.
    הערה:     הנגיף לקטוז דהידרוגנאז וירוס (ldev)-גורם הצמיחה מופחת ללא שימוש קרום המרתף (rbm) שימש. rBM הוא רגיש לטמפרטורה ויש לשמור תמיד על קרח, כפי שהוא יהיה לקריש אם הוא מגיע 15 ° c. הפשרת rBM על הקרח או לילה ב 4 ° צ' או 2-4 h בטמפרטורת החדר (RT) לפני ציפוי.
    1. הפשרת rBM על הקרח (ראה טבלת חומרים).
    2. לשמור על הצלחות ומאגרים (אם עטוף בנפרד) על הקרח לפני השימוש.
    3. בצע את השלבים 1.1.1-1.1.4.
    4. ממלאים את הטבעת החיצונית של בארות עם 1x PBS או בינוני גדילה כדי להפחית אידוי מבארות שנותרו. לדלל את ההשעיה התא בצינור 15 מ ל כדי להשיג 0.5-2 x 104 תאים/mL (צפיפות התא אופטימלית צריך להיקבע עבור כל קו תא) (איור 1א (ii)).
    5. מניחים את השפופרת 15 מ"ל המכילה את ההשעיה התא מדולל על קרח (למשל, בגביע הזכוכית) (איור 1א (iia)).
    6. להעביר את הצלחות מקורר ומאגרים למכסה המנוע. לשטוף מכולות פלסטיק, למלא אותם בקרח ולהעביר אותם לתוך המכסה כדי לאפשר את הצלחות ומאגרים להיות ממוקם על הקרח במהלך ההליך כולו.
    7. השהה מחדש את rBM בעדינות כדי להבטיח ג'ל הומוגנית.
    8. הוסף 1-2% rBM (הריכוז האופטימלי צריך להיקבע עבור כל קו תא) להשעיות התא הצוננים (איור 1א (iib)).
    9. היפוך שפופרת 15 mL כדי להבטיח ערבוב נכון של rBM וההשעיה התא לפני לחלק את ההשעיה לתוך הצלחת.
    10. להעביר את rBM מכיל תא הבולם למאגר סטרילי ולוותר 200 μL/גם לתוך מכיל מצורף אולטרה נמוך המצורף 96-היטב צלחות באמצעות פיפטה רב-ערוצי (איור 1a).
      הערה: אם עבודה עם מספר השעיות תא (למשל, יותר מקו תא אחד), זה חיוני לוותר על כל השעיה התא מיד לאחר rBM בנוסף כדי למנוע הגלינג מוקדמת.
    11. צנטריפוגה את הצלחת עבור 15 דקות ב 750 x g באמצעות ' הגון רך '/לא בלימה (אם אפשר, צנטריפוגה ב 4 ° צ' כדי לשמור את הנוזל rbm יותר, אבל לא דרישה עבור היווצרות ספרואיד מוצלחת), כדי להבטיח כי התאים מקובצים יחד כאשר rbm מתקשה, להקל על היווצרות של ספרואיד אחד בודד.
    12. מודקת את הצלחת באינקובטור (37 ° c, 5% CO2, 95% לחות).
    13. כל 2-3 ימים לרכוש תמונות מיקרוסקופיים אור להערכה של צמיחה ספרואיד.
    14. כל 2-3 ימים להחליף 100 μL של בינוני (להסיר 100 μL ולהחליף עם 100 μL של בינוני טרי).
  4. . לתלות מספרי משחרר
    1. בצע את השלבים 1.1.1-1.1.4.
    2. מדלל תאים כדי להשיג דילול מתאים. דילול מעשי הוא 50,000 תאים/mL.
    3. הסר את המכסה של צלחת 10 ס מ2 תרבות התא ומניחים אותו כך שהוא פונה כלפי מעלה. הוסף 6 מ ל של 1x PBS למנה (איור 1B (i)).
    4. יוצקים את ההשעיה התא לתוך מאגר סטרילי ובזהירות מקום עד 30 טיפות של 40 μL של ההשעיה של התא על המכסה של הצלחת תרבות התא באמצעות פיפטה רב ערוצי (איור 1B (ii)), וכתוצאה מכך ריכוז של 2,000 תאים/טיפה. להימנע מהנחת הטיפות קרוב מדי לקצה המכסה כמו טיפות אלה נוטים יותר לאבד מתח פני השטח בעת היפוך המכסה בשלב הבא.
    5. היפוך המכסה בתנועה מהירה אך מבוקרת ומניחים אותו על גבי המנה המכילה את ה-1x המכיל את תרבות התא (איור 1B (iii)).
    6. מניחים את הצלחת בחממה ב 37 ° c עם 5% CO2 ו 95% לחות מבלי להפריע את הטיפות ולהשאיר אותם לגדול עבור 4-6 ימים.
    7. אם לשמש ליסביטים חלבון או להטביע, spheroids הבריכה על ידי הסרת המכסה ולהטות אותו, כדי לשטוף את הטיפות עם 1 מ ל של מדיום מחומם. העבר את המדיום המתקבל המכיל spheroids לצינור 1.5 mL ולאפשר להם להתיישב בתחתית הצינור. המשך כפי שמתואר ב 4.4 ו 6.2.2 לחלבונים חלבון והטבעה, בהתאמה.

2. טיפול תרופתי בספרואידים

הערה: טיפול תרופתי לטווח ארוך יכול להיות מיושם על הספרואידים כדי להקרין השפעות של סם התעניינות. לפני התחלת טיפול תרופתי, מומלץ לבצע ניסוי היענות למינון של התרופה (ים), כדי למצוא מנה מתאימה לטיפול הניסיוני. המינון צריך להיות מבוסס על הקבוע IC50/ki של התרופה וטווח של כ 0.2 x-10x של ערך זה.

  1. הגדרת 6-12 spheroids לפי התנאי הרצוי כמתואר ב 1.2 או 1.3 ומקום בחממה (37 ° c, 5% CO2, 95% לחות) עבור יומיים.
  2. ביום השני, קחו תמונות מיקרוסקופיים קלות של הספרואידים.
  3. הכינו את מנות הטיפול הראשונות (לאחר שרכשו תמונות).
    הערה: ריכוז הטיפול הראשון חייב להיות פעמיים את הריכוז הסופי הרצוי כמו הפתרון יהיה מדולל 1:2 על בנוסף היטב המכיל 100 μL מדיום. מרווחי הטיפול בסמים מוצעים (יהיה תלוי בחצי חיים של התרופה): יום 2, 4 ו -7.
  4. באמצעות הצנרת רב-ערוצי, להסיר בעדינות 100 μL של בינוני ולהחליף אותו עם 100 μL של התרופה המכילה בינוני.
  5. מניחים את הצלחת 96-באר חזרה בחממה ב 37 ° צ' עם 5% CO2 ו 95% לחות ולחזור על 2.3 ו 2.4 בימים הנבחרים של הטיפול אבל עכשיו בלי להכפיל את המינון כדי להשיג את המינון הסופי הנכון.
  6. ביום האחרון של לוח הזמנים לפרוטוקול/טיפול, ניתן לבצע אחת או כמה מהפעולות הבאות.

3. שיטת הכדאיות התאית לספרואידים

  1. הגדר 4-6 spheroids לפי התנאי הרצוי כמתואר ב 1.2 או 1.3 ומקום בחממה ב 37 ° c עם 5% CO2 ו-95% לחות.
    הערה: במקרה זה, שיטת הכדאיות התאית בוצעה ביום 7 או 9, לאחר הגידול המנוכל 2-3 ימים על ידי מיקרוסקופ אור כפי שמתואר לעיל (נקודה 1.2.5 ו 1.3.13).
  2. הפשרת שיטת הכדאיות הכימית (ראה טבלת חומרים) והרשה לה להיות מעורפלת לפני השימוש.
  3. מערבבים בעדינות על-ידי היפוך כדי לקבל פתרון הומוגניות.
  4. לפני ביצוע העיבוד, להסיר 50% של מדיום התרבות מן spheroids (100 μL).
  5. הוספת יכולת הכדאיות של תא לכל באר ביחס 1:3 לכמות המדיום בבאר (איור 2a)עבור צלחת 96-באר, להוסיף 50 μl של מגיב ל100 μl של בינונית.
  6. מערבבים את התוכן במרץ עבור 5 דקות כדי לגרום לפירוק התא (איור 2A).
  7. דגירה עבור 25 דקות ב-RT כדי לייצב את האות זורח (איור 2א (iii)).
  8. הקלט את האות הזורח (איור 2א).

4. הכנת ליקוטים חלבון לכתמים מערביים מתרביות ספרואיד תלת-ממדית

הערה: בעת איסוף הספרואידים, מומלץ להשתמש בפיפטה P200 ולחתוך את קצה הקצה כדי לאפשר פתיחה גדולה יותר ומכאן לכידה קלה יותר של הספרואידים מבלי להפריע למבנה שלהם.

  1. עבור כל תנאי, הבריכה מינימום של 12, באופן אידיאלי 18-24 spheroids (בהתאם לגודל ספרואיד) בצינור 1.5 mL (להימנע 2 שפופרות mL, כמו השלבים הבאים יהפכו קשה יותר עקב התחתון מחודד פחות שלהם).
    הערה: אם כמות המדיום עולה 1.5 mL לפני איסוף כל spheroids, לאפשר spheroids שנאספו להתיישב בתחתית (קורה מהר מאוד, צנטריפוגה לא נחוץ) ולמחוק חצי נפח של הצינור לפני שתמשיך איסוף ה הספרואידים שנותרו.
  2. הניחו שפופרות על הקרח והניחו לספרואידים להתיישב בתחתית צינור ה1.5 mL.
  3. מעבר ממעבדת התא הסטרילי למעבדה הרגילה.
  4. שטוף את הרואידים פעמיים ב 1 מ ל של קרח קר 1x PBS. תן לספרואידים להתיישב לפני הסרת ה-PBS 1x בין כל צעד כביסה.
  5. מתיז כמו PBS 1 x ככל האפשר מבלי להפריע או להסיר את הספרואידים.
  6. הוסף 5 μL של מאגר לפירוק מחומם (LB) עם פוספספטאז-ו מעכבי פרוטאז, לכל ספרואיד (למשל, 10 spheroids = 50 μL).
  7. חזור על מרווחי המערבולת ואחריו ספין למטה עד התפרקה. לבצע מחזור של vortexing עבור 30 s ואחריו צנטריפוגה (מהדורה מהירה באמצעות צנטריפוגה שולחן מספיק) עבור 10 עבור כ. 5-10 דקות בהתאם לגודל ואת הקומפקטיות של spheroids.
    הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. לשמור על lysates ב-20 ° צ' עד שתמשיך עם sonication, המגון וקביעת חלבון כמו בפרוטוקול ליפוסט סטנדרטי חלבון 2D, ואחריו הכתמים המערביים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים.

5. Propidium יודיד (PI) צביעת הספרואידים

  1. הגדרת 3-6 spheroids לפי המצב הרצוי כמתואר ב 1.2 או 1.3 ומקום בחממה ב 37 ° c עם 5% CO2 ו-95% לחות.
  2. , במעבדת התרבות הסלולרית הסטרילית. מחממים 1 x PBS ל 37 ° c
  3. לעשות פתרון PI של 4 μM על ידי דילול פתרון מניות 1x PBS: לדלל 1 mg/mL מלאי מימית של PI 1:350 ב 1x PBS.
    הערה: ריכוז זה יהיה הרבה יותר מלאה עם תוספת של הפתרון לבארות מתן ריכוז סופי של 2 μM. 100 μL של פתרון זה נדרש עבור כל היטב המכיל ספרואיד.
    זהירות: Propidium יודיד (PI) צריך להיות מטופל בתוך מכסה וללבוש כפפות. PI הוא רגיש לאור. הגנה מפני אור בעת הטיפול.
  4. הסר 100 μL של המדיום מכל באר בצלחת 96-היטב מבלי להסיר את הspheroids.
  5. לשטוף את המדיום הנותרים על ידי הוספת 100 μL של מחומם 1x PBS לכל הבארות ואחריו הסרת 100 μL של הנוזל בבארות. חזור על שלב זה כביסה 3 פעמים.
  6. הוסף 100 μL של פתרון PI לכל טוב, לכסות את הצלחת ברדיד אלומיניום ולמקם אותו בחממה ב 37 ° צ' עם 5% CO2 ו 95% לחות עבור 10-15 min.
  7. חזור על 3 שלבי הכביסה המתוארים ב-4.5 כדי לשטוף את פתרון PI, כדי לצמצם את אות הרקע בעת הדמיה.
  8. השתמש במיקרוסקופ אפיפלואורסצלי. כדי לצלם את הספרואידים כדי להעריך את הכדאיות של תאים בליבת ספרואיד לקחת z-ערימות כדי לקבל תמונות עם מעמקי שונות של הספרואיד.
    הערה: גודל צעד סביב 18-35 יקרומטר בין כל פרוסה בהתאם לגודל ספרואיד מומלץ, ונותן כ-11-18 ערימות לכל ספרואיד. את ה-z-ערימות ניתן לעבד ב-ImageJ באמצעות פונקציית ה-z-הקרנה, אשר יכולה לשלב את כל הערימות z לתמונה אחרונה אחת, נותן סקירה של הצביעת ברחבי הספרואיד (לקבלת הנחיות נוספות על השימוש ImageJ למטרה זו, ראה (https://imagej.net/Z-functions).

6. הטבעה של הספרואידים תלת-ממדיים

  1. הכן את ג'ל ה-agheroשאליו מוטבעים הספרואידים (בפעם הראשונה הנדרשת ביצוע הפרוטוקול).
    1. מערבבים 1 גר' באקטואגר ב 50 מ ל של ddH2O.
    2. החום לאט במיקרוגל עד שבאקנטונאגר הומס והוא יצר ג'ל הומוגנית. אל תאפשר הג'ל לרתוח.
    3. המשיכו לחמם את הבאקנאגר באמבט מים ב-60 ° c.
    4. שמרו על 4 ° c בין ניסויים.
  2. . הטבעה של הספרואידים
    1. ביום 1, עבור כל תנאי, מאגר מינימום של 12 הספרואידים בצינור 1.5 mL.
    2. שטוף פעם אחת עם 1 מ ל של קרח קר 1x PBS.
    3. כדי לתקן את הספרואידים, להוסיף 1 mL של 4% פאראמפורמלדהיד.
      הערה: טיפול בפאראמפורמלדהיד צריך להתבצע בתוך מכסה.
    4. תן להם לעבור את הדגירה 24 שעות ב RT.
    5. ביום 2, החום ג'ל בקפידה על ידי הצבת אותו בגביע מלא מים במיקרוגל. ודא כי ג'ל לא לרתוח! המשיכו להתחמם בצלחת החימום של הספסל, בשעה 60 ° צ' עד השימוש.
    6. שטוף את הרואידים פעמיים עם 1 מ ל של קרח קר 1x PBS.
    7. מתיז רוב הPBS 1x (עוזב כ 100 μL בשלב זה הוא מעשי לטיפול spheroids).
    8. הכינו את הפיפטה 20 μL על ידי חיתוך קצה הפיפטה בשיפוע כדי לקבל טיפ מחודד עם חור גדול יותר (ראה איור).
      הערה: החלק הבא צריך להיעשות במהירות כדי להבטיח העברת ספרואיד אופטימלית כדי למנוע מיצוק של ג'ל טיפה. אם אין בלוק חימום זמין, מומלץ תחילה לתפוס את spheroids ולאחר מכן לעשות את הירידה agarose (כלומר, מיתוג את הסדר של נקודות 6.2.9 ו 6.2.10).
    9. לעשות טיפה ג'ל העלה על שקופית המיקרוסקופ. מניחים את השקופית על בלוק חימום חם כדי למנוע את הצמח מתוך מיצוק.
    10. באמצעות העצה בצנרת ששונתה (ראה 6.2.8), לתפוס כמו spheroids רבים ככל האפשר בנפח של 15-20 μL.
    11. בזהירות להזריק 15-20 μL ספרואיד המכיל 1x PBS למרכז טיפה ג'ל agarose מבלי לגעת בשקופית המיקרוסקופ.
      הערה: . זו נקודה קצת קשה הרורואידים יאבדו אם טיפ הפיפטה ייגע במגלכי המיקרוסקופ בעת הזרקת הספרואידים לתוך טיפת הג'ל. מומלץ לתרגל את כל התהליך של ביצוע הירידה והזרקת הספרואידים על ידי הזרקת נוזל צבעוני לתוך הירידה. זה יאפשר ויזואליזציה של חדירה פוטנציאלית דרך הירידה, כמו נוזל צבעוני יהיה דולף החוצה אל השקופית.
    12. אפשר agarose ג'ל טיפה הרדן על ידי הדגירה עבור 5-10 דקות ב RT או ב 4 ° c. לאחר שטיפת ג'ל התחזק במקצת (אבל הוא עדיין רך למדי), בזהירות לדחוף את טיפת ג'ל מן המיקרוסקופ מחליק לתוך קלטת רקמת פלסטיק עם אזמל.
    13. כסו את קלטות רקמת הפלסטיק ב-70% אתנול.
      הערה: בשלב זה ניתן להשתמש בspheroids באופן ישיר או מאוחסן במשך חודשים.
    14. להטביע את agarose-מוטבע ספרואיד ב פרפין, קטע לתוך 2-3 יקרומטר שכבה עבה שקופיות כתם עם המטאוקסילין ו אאוזין או בכפוף להכתמים היסטולוגית.

תוצאות

הצמיחה ספרואיד המבוססת על פרוטוקול היווצרות ספרואיד מומחש באיור 1A ו איור 1B, שימשו נקודת התחלה לניתוח של ההשפעות של תרופות נגד סרטן בגידול תלת מימד הגדרה מחקה. הקלות שבה נוצרות הספרואידים היא קו התאים הספציפי, וקווי תאים מסוימים דורשים תו?...

Discussion

השימוש של הסרטן 3D spheroids הוכיחה כלי רב ערך רב-תכליתי לא רק לסינון תרופות נגד סרטן, אלא גם לקבלת תובנה מכניסטית לתוך הרגולציה של מוות תא סרטן הכדאיות בתנאים לחקות את אלה בגידול מיקרואקולוגיה. זה חיוני במיוחד כמו נגישות, ספיגת הסלולר, תופעות תאיים של תרופות כימותרפיות מושפעים עמוקות על ידי התנ...

Disclosures

המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים

Acknowledgements

אנו אסירי תודה לקאטרין פרנקלין מארק ואנט ברלטלין לקבלת סיוע טכני מעולה, וכדי לבצע את הניסויים באיור 1D. העבודה הזאת ממומנת על ידי קרן איינר וילומסן, קרן נובו נורדיסק ופונפה ג'צ'אם (כולם לבית הSFP).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI)Invitrogen# C10595 For staining nuclei
5-Fluorouracil (5-FU)Sigma-Aldrich#F6627Component in chemotherapeutic treatment
5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA)Life Technologies#E3111Inhibitor of NHE1
Antibody against PARP and cPARPCell signaling#9542Used in western blotting
Antibody against Ki-67Cell signaling#9449Used for IHC
Antibody against p53Cell Signaling #2524 Used for IHC
Antibody against β-actinSigma A5441Used in western blotting
BactoagarBD Bioscience#214010Used for agarose gel preparation
Benchmark protein ladderInvitrogen#10747-012Used for SDS-PAGE
Bio-Rad DC Protein Assay kitBio-Rad Laboratories#500-0113, #500-0114, #500-0115  Used for protein determination from lysates
Bürker chamberMarienfeld610311For cell counting 
BX63 epifluoresence microscopeOlympusUsed for fluorescent imaging
CellTiter-Glo 3D Cell Viability AssayPromega#G9681Used for the cell viability assay
CisplatinSigma-Aldrich#P4394 Component in chemotherapeutic treatment
Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom,  Ultra-low attachment, With lid, SterileCorning#4520Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point
Corning 96 well, clear round bottom,  Ultra-low attachment microplate, With lid, SterileCorning#7007Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point
Criterion TGX Precast GelsBio-Rad5671025Used for SDS-PAGE
DoxorubicinAbcam#120629Component in chemotherapeutic treatment
FLUOStar Optima Microplate readerBMG LabtechUsed for recording luminescence 
Formaldehyde VWR Chemicals #9713.1000 Used for cell fixation
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixGibco#A1413202Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol.
Heat-inactivated FBSSigma#F9665Serum for growth media
ImageJNIHScientific Image analysis
Medim Uni-safe casetteMedim Histotechnologie10-0114Used for storage of embedded spheroids
Mini protease inhibitor cocktail tabletsRoche Diagnostics GmBH # 11836153001Used for lysis buffer preparation
MZ16 microscopeLeicaUsed for light microscopic images
NuPAGE LDS 4x Sample Buffer Invitrogen#NP0007Used for western blotting
Pierce ECL Western blotting substrateThermo scientific#32106Used for western blotting
Ponceau SSigma-Aldrich#P7170-1LUsed for protein band staining
Prism 6.0GraphpadScientific graphing and statistical software
Propidium iodide (1mg/ml solution in water)Invitrogen P3566Light sensitive 
Sterile reservoirs, multichannelSPL lifesciences21002Used for seeding cells for spheroid formation
Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide Menzel-Gläser#J3800AMNZMicroscope glass slide used for embedding
TamoxifenSigma-Aldrich#T5648Used as chemotherapeutic treatment
Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranesBio-Rad#170-4159Used for western blotting
Tris/Glycine/SDS running buffer Bio-Rad #161 0732Used for SDS-PAGE
Trypsin-EDTA solutionSigma#T4174 Cell dissociation enzyme

References

  1. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
  2. Mueller-Klieser, W., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Influence of glucose and oxygen supply conditions on the oxygenation of multicellular spheroids. British Journal of Cancer. 53 (3), 345-353 (1986).
  3. Gaedtke, L., Thoenes, L., Culmsee, C., Mayer, B., Wagner, E. Proteomic analysis reveals differences in protein expression in spheroid versus monolayer cultures of low-passage colon carcinoma cells. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4111-4118 (2007).
  4. Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS Genetics. 4 (12), 1000293 (2008).
  5. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  6. Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30 (3), 247-255 (2003).
  7. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews in Molecular and Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  8. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  9. Jacobi, N., et al. Organotypic three-dimensional cancer cell cultures mirror drug responses in vivo: lessons learned from the inhibition of EGFR signaling. Oncotarget. 8 (64), 107423-107440 (2017).
  10. Rodriguez-Enriquez, S., et al. Energy metabolism transition in multi-cellular human tumor spheroids. Journal of Cell Physiology. 216 (1), 189-197 (2008).
  11. Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: intermediates between monolayer culture and in vivo tumor. Cell Biology International. 23 (3), 157-161 (1999).
  12. Andersen, A. P., et al. Roles of acid-extruding ion transporters in regulation of breast cancer cell growth in a 3-dimensional microenvironment. Molecular Cancer. 15 (1), 45 (2016).
  13. Swietach, P., Patiar, S., Supuran, C. T., Harris, A. L., Vaughan-Jones, R. D. The role of carbonic anhydrase 9 in regulating extracellular and intracellular ph in three-dimensional tumor cell growths. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20299-20310 (2009).
  14. Walenta, S., Doetsch, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Metabolic imaging in multicellular spheroids of oncogene-transfected fibroblasts. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (4), 509-522 (2000).
  15. Kunz-Schughart, L. A., Groebe, K., Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell culture induces novel proliferative and metabolic alterations associated with oncogenic transformation. International Journal of Cancer. 66 (4), 578-586 (1996).
  16. Feng, H., et al. Homogeneous pancreatic cancer spheroids mimic growth pattern of circulating tumor cell clusters and macrometastases: displaying heterogeneity and crater-like structure on inner layer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 143 (9), 1771-1786 (2017).
  17. Santini, M. T., Rainaldi, G., Indovina, P. L. Apoptosis, cell adhesion and the extracellular matrix in the three-dimensional growth of multicellular tumor spheroids. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36 (2-3), 75-87 (2000).
  18. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
  19. Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
  20. Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy. Journal of Visual Experiments. (66), e4218 (2012).
  21. Friedrich, J., et al. A reliable tool to determine cell viability in complex 3-d culture: the acid phosphatase assay. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 925-937 (2007).
  22. Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. International Journal of Oncology. 31 (6), 1403-1413 (2007).
  23. Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
  24. Andersen, A. P., et al. The net acid extruders NHE1, NBCn1 and MCT4 promote mammary tumor growth through distinct but overlapping mechanisms. International Journal of Cancer. , (2018).
  25. Vaupel, P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology. Seminars in Radiation Oncology. 14 (3), 198-206 (2004).
  26. Vaupel, P. W., Frinak, S., Bicher, H. I. Heterogeneous oxygen partial pressure and pH distribution in C3H mouse mammary adenocarcinoma. Cancer Research. 41 (5), 2008-2013 (1981).
  27. Helmlinger, G., Yuan, F., Dellian, M., Jain, R. K. Interstitial pH and pO2 gradients in solid tumors in vivo: high-resolution measurements reveal a lack of correlation. Nature Medicine. 3 (2), 177-182 (1997).
  28. Zhang, X., Lin, Y., Gillies, R. J. Tumor pH and its measurement. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1167-1170 (2010).
  29. Gillies, R. J., Raghunand, N., Karczmar, G. S., Bhujwalla, Z. M. MRI of the tumor microenvironment. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 16 (4), 430-450 (2002).
  30. Vukovic, V., Tannock, I. F. Influence of low pH on cytotoxicity of paclitaxel, mitoxantrone and topotecan. British Journal of Cancer. 75 (8), 1167-1172 (1997).
  31. Song, C. W., Griffin, R., Park, H. J., Teicher, B. A. . Cancer Drug Resistance. , 21-42 (2006).
  32. Lotz, C., et al. Role of the tumor microenvironment in the activity and expression of the p-glycoprotein in human colon carcinoma cells. Oncology Reports. 17 (1), 239-244 (2007).
  33. Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
  34. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular Oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
  35. Kuen, J., Darowski, D., Kluge, T., Majety, M. Pancreatic cancer cell/fibroblast co-culture induces M2 like macrophages that influence therapeutic response in a 3D model. PLoS One. 12 (7), 0182039 (2017).
  36. Bochet, L., et al. Adipocyte-derived fibroblasts promote tumor progression and contribute to the desmoplastic reaction in breast cancer. Cancer Research. 73 (18), 5657-5668 (2013).
  37. Amann, A., et al. Development of a 3D angiogenesis model to study tumour - endothelial cell interactions and the effects of anti-angiogenic drugs. Scientific Reports. 7 (1), 2963 (2017).
  38. LaBonia, G. J., Ludwig, K. R., Mousseau, C. B., Hummon, A. B. iTRAQ Quantitative Proteomic Profiling and MALDI-MSI of Colon Cancer Spheroids Treated with Combination Chemotherapies in a 3D Printed Fluidic Device. Analytical Chemistry. 90 (2), 1423-1430 (2018).
  39. Hulikova, A., Vaughan-Jones, R. D., Swietach, P. Dual role of CO2/HCO3(-) formula buffer in the regulation of intracellular pH of three-dimensional tumor growths. Journal of Biological Chemistry. 286 (16), 13815-13826 (2011).
  40. Wallace, D. I., Guo, X. Properties of tumor spheroid growth exhibited by simple mathematical models. Frontiers in Oncology. 3, 51 (2013).
  41. Michel, T., et al. Mathematical modeling of the proliferation gradient in multicellular tumor spheroids. Journal of Theoretical Biology. 458, 133-147 (2018).
  42. Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

148Spheroids3Dpropidium

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved