JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول إنشاء نموذج ماوس يحمل الورم لمراقبة تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية في الوقت الحقيقي عن طريق التصوير الغمر الحيوي المزدوج.

Abstract

تكوين الأوعية الدموية، كعملية حاسمة من تطور الورم، أصبح نقطة ساخنة البحوث وهدفا للعلاج المضادة للورم. ومع ذلك، لا يوجد نموذج موثوق به لتتبع تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية في وقت واحد بطريقة بصرية وحساسة. يعرض التصوير الإنارة الحيوية تفوقها الفريد في التصوير الحي بسبب مزاياه من الحساسية العالية، والخصوصية القوية، والقياس الدقيق. يقدم هنا بروتوكول لإنشاء نموذج الماوس الحاملة للورم عن طريق حقن رينلا لوسيفيراز المسمى خط خلية سرطان الثدي مورين 4T1 في الماوس المعدلة وراثيا مع الأوعية الدموية الناجمة عن التعبير اليراعة لوسيفيراز. يوفر نموذج الماوس هذا أداة قيمة لمراقبة تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية في الوقت الحقيقي عن طريق التصوير ثنائي الإضاءة الحيوية في ماوس واحد. ويمكن تطبيق هذا النموذج على نطاق واسع في فحص الأدوية المضادة للورم وبحوث الأورام.

Introduction

تكوين الأوعية هو عملية أساسية في تطور السرطان من الأورام الصغيرة المترجمة إلى أكبر، يحتمل أن تكون الأورام النقيلية1،2. يصبح الارتباط بين نمو الورم وتكوين الأوعية الدموية إحدى نقاط التركيز في مجال أبحاث الأورام. ومع ذلك، تفشل الطرق التقليدية لقياس التغيرات المورفولوجية في رصد تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية في وقت واحد في الحيوانات الحية باستخدام نهج مرئي.

التصوير الإنارة الحيوية (BLI) من الخلايا السرطانية هو طريقة تجريبية مناسبة بشكل خاص لرصدنمو الورم بسبب عدم الغازية، والحساسية، والخصوصية 3،4،5،6 . وتستند تكنولوجيا BLI على مبدأ أن لوسيفيراز يمكن أن تحفز أكسدة الركيزة محددة في حين تنبعث منها الإنارة الحيوية. وluciferase أعرب في الخلايا السرطانية المزروعة يتفاعل مع الركيزة حقن، والتي يمكن الكشف عنها من قبل نظام التصوير الحي، وإشارات تعكس بشكل غير مباشر التغيرات في عدد الخلايا أو توطين الخلايا في الجسم الحي6،7.

باستثناء نمو الورم، يمكن أيضا تصور تكوين الأوعية الدموية الورم (الخطوة الحرجة في تطور السرطان) من خلال تكنولوجيا BLI باستخدام Vegfr2-Fluc-KI الفئران المعدلة وراثيا8،9،10. عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (Vegf) مستقبلات 2 (Vegfr2)، وهو نوع واحد من مستقبلات Vegf، وأعرب في الغالب في الخلايا البطانية الوعائية من الفئران الكبار11. في Vegfr2-Fluc-KI الفئران المعدلة وراثيا، يتم ضرب تسلسل الحمض النووي من لوسيفيراز اليراع (Fluc) في الطارد الأول من تسلسل Vegfr2 الذاتية. ونتيجة لذلك، يتم التعبير عن المداخن (التي تظهر كإشارات BLI) بطريقة مطابقة لمستوى تكوين الأوعية الدموية في الفئران. لتنمو أكثر من بضعة ملليمترات في الحجم، والورم يجند الأوعية الدموية الجديدة من الأوعية الدموية القائمة، والتي تعبر بشكل كبير عن Vegfr2 الناجمة عن عوامل النمو من الخلايا السرطانية1. وهذا يفتح إمكانية استخدام الفئران المعدلة وراثيا Vegfr2-Fluc-KI لمراقبة غير الغازية تكوين الأوعية الدموية الورم من قبل BLI.

في هذا البروتوكول، يتم إنشاء نموذج الماوس الحاملة للورم لرصد تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية في ماوس واحد من خلال التصوير اليراعة لوسيفيراز (Fluc) ورينيلا لوسيفيراز (Rluc)، على التوالي (الشكل 1). يتم إنشاء خط خلية 4T1 (4T1-RR) الذي يعبر بشكل كبير عن بروتين الفلورسنت الأحمر وRluc (RFP) لتتبع نمو الخلايا عن طريق التصوير Rluc. لمزيد من التحقيق في التغيرات الديناميكية في تكوين الأوعية الدموية في تطور وتراجع الورم، يتم إنشاء خط خلية 4T1 آخر (4T1-RRT) الذي يعبر عن الانتحار الجينات الهربس البسيط فيروس اقتطاع كيناز الثيميدين (HSV-ttk)، Rluc، وRFP. بإدارة غانسيكلوفير (GCV)، يتم إلغاء الخلايا التعبير ية HSV-ttk بشكل انتقائي. استنادا ً إلى خطوط الخلايا هذه، تم بناء نموذج يحمل الورم في فئران Vegfr2-Fluc-KI التي تعمل كنموذج تجريبي لسد تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية الورم في الجسم الحي.

Protocol

ويجب أن تمتثل التجارب للوائح الوطنية والمؤسسية المتعلقة باستخدام الحيوانات لأغراض البحث. يجب الحصول على أذونات لإجراء التجارب. وتلتزم معالجة الحيوانات والإجراءات التجريبية للدراسة بالمبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة نانكاي التي تتوافق مع المبادئ التوجيهية لرعاية الحيوانات التي أقرتها المعاهد الوطنية للصحة.

1. LV-Rluc-RFP (RR) و LV-Rluc-RFP-HSV-ttk (RRT) تغليف وإنتاج المعضد

ملاحظة: يحمل pLV-RR التسلسلات الجينية لـ Renilla luciferase (Rluc) وبروتين الفلورسنت الأحمر (RFP) تحت المروج EF1α، في حين أن pLV-RRT يحمل تسلسل الجينات الترميز Rluc، RFP، وفيروس الهربس البسيط اقتطاع كيناز الثيميدين (HSV-ttk) ( الشكل2).

  1. البذور 1 × 106 من الخلايا 293T في بئر في 6 لوحة جيدا والثقافة بين عشية وضحاها في حاضنة مرطبة مع 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية مع دولبكو تعديل النسر المتوسطة (DMEM) تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS).
  2. إعداد تعليق liposome: مزيج 7.5 درجة مئوية من liposome و 0.25 مل من الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية (MEM) في أنبوب 1.5 مل بعد الحضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) لتفريق liposomes على قدم المساواة.
  3. إعداد محلول السلطات الوطنية المعينة (DNAs-RR): بشكل منفصل، أضف متجه pLV-RR وباللازميدات المساعدة إلى 0.25 مل من MEM في أنبوب 1.5 مل كما هو موضح في الجدول 1.
  4. الحصول على مركب liposome / DNAs-RR: إضافة بلطف الحل DNAs-RR في إعداد قطرة تعليق liposome قطرة وحضانة لمدة 20 دقيقة في RT حتى روابط الحمض النووي إلى غشاء الدهون.
  5. استبدال وسط الخلايا 293T مع 1 مل من DMEM تحتوي على 10٪ FBS وإضافة مركب liposome / DNAs-RR إلى وسط الخلايا 293T بلطف.
  6. بعد الحضانة في حاضنة رطبة مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2 في 37 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة، استبدال مركب liposome / DNAs-RR التي تحتوي على وسط الخلايا 293T مع 1 مل من DMEM تحتوي على 10٪ FBS و 100 U /mL البنسلين −ستربيتوميسين.
  7. الاستمرار في زراعة الخلايا 293T في حاضنة رطبة لمدة 48 ساعة بعد التغوط. ثم، وجمع supernatant من الخلايا 293T والطرد المركزي المتوسطة في 300 × ز لمدة 5 دقائق لبيليه الخلايا 293T. نقل لينتيفيروس-RR (LV-RR) التي تحتوي على supernatant في أنابيب تخزين البولي بروبلين المعقمة 1.5 مل وتخزينها في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يلزم إنشاء مرفق للسلامة الأحيائية من المستوى 2 (BSL-2) من أجل العمل مع فيروس العدس المؤتلف.
  8. كرر الخطوات 1.1-1.7 واستخدم متجه pLV-RRT بدلاً من متجه pLV-RR في الخطوة 1.3 للحصول على لينتيفيروس-RRT (LV-RRT). تخزين LV-RRT في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: قد تمنع مخزون اللينفيروسيفيروسي غير النقي نمو الخلايا في بعض الحالات. قد تحتاج إلى تنقية مخزون لينتيفيروسي. وينبغي تقسيم المخزونات الفيروسية التي تحتوي على جسيمات LV-RR أو LV-RRT إلى أنابيب سعة 1.5 مل (1 مل لكل أنبوب) للتخزين لتجنب دورات ذوبان حرة متعددة.

2. LV-RR و LV-RRT انتقال الفيروسية لتعبير الجينات في الخلايا 4T1

  1. بذور 4T1 الخلايا في لوحة 6 جيدا (5 × 105 خلايا / جيدا) والثقافة مع معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 المتوسطة التي تحتوي على 10٪ FBS بين عشية وضحاها في حاضنة رطبة مع 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية.
  2. إزالة المتوسطة من لوحة الثقافة واستبدالها مع 1 مل الطازجة RPMI 1640 المتوسطة وكذلك 1 مل من الأسهم اللينفيروسي (LV-RR أو LV-RRT) إلى كل بئر. إضافة 8 ميكروغرام / مل بوليبرين ومزيج بلطف المتوسطة التي تحتوي على جزيئات لينتيفيروسي عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.
    ملاحظة: يرجى أن تكون على علم بأن المتوسط يحتوي على جزيئات لينتيفيروسية، والتي يمكن أن تنتقل الخلايا البشرية.
  3. تدور حل التحويل في جهاز طرد مركزي في 1000 × ز لمدة 60 دقيقة في RT للمساعدة في زيادة كفاءة التحويل. بعد الطرد المركزي، والثقافة 4T1 الخلايا لمدة 4-12 ساعة والحفاظ عليها في حاضنة رطبة مع 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: بالنسبة لبعض خطوط الخلايا، قد تكون البوليبرين سامة للثقافة طويلة الأجل. لذلك، قد يكون وقت الحضانة لنقل خلايا مختلفة قابلة للتغيير. تحقق من حالة الخلية عدة مرات للعثور على وقت الحضانة المناسب.
  4. تحديث وسط الخلايا 4T1 المستحثة مع 2 مل من RPMI 1640 المتوسطة التي تحتوي على 10٪ FBS و 100 U / مل البنسلين −العقديات لإزالة الجسيمات الفيروسية والبوليبرين.

3- فحص المخدرات وتحديد الخلايا المستحثة من 4T1 LV-RR وLV-RRT

  1. حدد الخلايا المستحثة مع المتوسطة التي تحتوي على blasticidin (BSD) وفقا لجين مقاومة BSD التي يحملها LV-RR أو LV-RRT كما هو موضح الخطوات التالية.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، يمكن اختيار الخلايا المستحثة التي تكون إيجابية RFP عن طريق قياس التدفق بمقدار السيتومترية وفقاً لجين RFP الذي يحمله LV-RR أو LV-RRT.
  2. 48 ساعة بعد الانكل، مرور خلايا 4T1 بنسبة 1:3 إلى 1:4 مع مجموعة متوسطة (RPMI 1640 المتوسطة التي تحتوي على 10٪ FBS، 100 U / مل البنسلين - العقديات، و 5 ميكروغرام / مل BSD). تغيير المتوسطة كل 2 أو 3 أيام.
    ملاحظة: قد يختلف تركيز BSD الأمثل من خط الخلية إلى خط الخلية. ولذلك، ينبغي إجراء تجربة تجريبية لمنحنى القتل لتحديد التركيز الأمثل لـ BSD قبل التجربة الأولية.
  3. 7 أيام بعد فحص المخدرات، ومراقبة الخلايا 4T1 المستحثة LV-RR (4T1-RR) وLV-RRT المستحثة الخلايا 4T1 (4T1-RRT) تحت المجهر المقلوب للمرحلة المقلوبة. عد عدد خلايا RFP+ 4T1 وجميع الخلايا 4T1 في ثلاثة مجالات للرؤية لتقدير نسبة RFP الإيجابية، على التوالي (الشكل2).
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، يمكن تحديد نسبة RFP الإيجابية للخلايا 4T1 المستحثة عن طريق قياس التدفق.
  4. قياس إشارات رينيلا من خلايا 4T1-RR وخلايا 4T1-RRT باستخدام نظام التصوير الحي للكشف عنالعلاقة الخطية بين أرقام الخلايا وإشارات رينيلا (الشكل 3).
  5. قم بتوسيع خلايا 4T1-RR و4T1-RRT التي تم فحصها BSD مع وسيط التحديد عند نسب الانقسام بين 1:3 و1:4 وتخزين مخزون خط الخلية في النيتروجين السائل.

4. Vegfr2-Fluc-KI الفئران ونموذج الماوس الحاملة للورم

ملاحظة: تستخدم الفئران النباتية المعدلة وراثيا-Fluc-KI، 6-8 أسابيع من العمر والإناث، في هذه التجربة لرصد تكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي من قبل BLI.

  1. ثقافة 4T1-RR الخلايا وخلايا 4T1-RRT في أطباق بيتري 60 ملم في حاضنة رطبة مع 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية، على التوالي. عندما تكون الخلايا عند التقاء 80٪، قم بإزالة المتوسط واشطفه بمحلول ملحي مُسحّن بالفوسفات (PBS).
  2. إزالة PBS وإضافة إضافية 2 مل من 0.25% trypsin-0.53 mM EDTA الحل على التوالي. يُحفظ الطبق في RT (أو عند 37 درجة مئوية) حتى تنفصل الخلايا.
  3. إضافة 5-10 مل من المتوسطة الطازجة التي تحتوي على 10٪ FBS، ثم يستنشق والاستغناء عن الخلايا لإعادة تعليق خلايا 4T1-RR و 4T1-RRT في أنابيب الطرد المركزي 15 مل، على التوالي. عد نوعين من الخلايا 4T1 باستخدام غرفة العد وإعداد تعليق الخلية بتركيز 1 × 106 لكل 100 ميكرولتر في RPMI 1640 المتوسطة.
  4. تخدير الفئران Vegfr2-Fluc-KI مع 1٪-3٪ isoflurane في الأكسجين 100٪ في غرفة التخدير التعريفي مع معدل تدفق 1 L / دقيقة. مراقبة استجابة قرصة اصبع القدم من الماوس لتأكيد حالة التخدير. ثم، وتطبيق مرهم العيون على عيون الماوس لمنع الجفاف.
  5. إزالة الماوس من الغرفة والموقف في أنفكوني. إزالة تماما شعر الكتف من الماوس باستخدام حلاقة كهربائية وكريم إزالة الشعر، والتي يمكن أن توفر وجهة نظر جيدة من المجال الجراحي وتجنب حجب إشارات BLI في متابعة التجارب.
  6. حقن خلايا 4T1-RR بنقص في الجلد (1 × 106 خلايا بحجم إجمالي 100 ميكرولتر) وخلايا 4T1-RRT (1 × 106 خلايا بحجم إجمالي 100 يورو) في الكتفين الأيسر والأيمن لكل فأر، على التوالي (سجل اليوم 0). وضع الفئران في منطقة الانتعاش مع الدعم الحراري حتى تعافى تماما.
  7. بعد زرع خلايا 4T1-RR و 4T1-RRT، المس كتل الورم للتحقق من أن الفئران تحمل الورم كل يوم (الشكلS1). في اليوم 7 بعد الزرع، حقن داخل اقفارية 50 ملغ / كغ غانسيكلوفير (GCV) للفئران الحاملة للورم مرتين في اليوم حتى نهاية التجربة.
    ملاحظة: قبل هذه التجربة، يجب الكشف عن السامة للخلايا GCV على خلايا 4T1-RRT. ويمكن تقييم كفاءة القتل من GCV عن طريق فحص عد الخلايا مع تركيز مختلف من GCV (الشكلS2).
  8. في اليوم 0، 3، 7، 14، و 21 بعد زرع 4T1، ورصد نمو الورم وتكوين الأوعية الدمويةمن الفئران الحاملة للورم وتقييم من قبل كل من Rluc وFluc التصوير (الشكل 4).

5. التصوير الإنارة الحيوية المزدوجة للورم (Rluc) وتكوين الأوعية الدموية (Fluc)

  1. افتح نظام التصوير الحي، وتهيئة برنامج التصوير الحي، ثم قم بتهيئة النظام.
    ملاحظة: سوف يستغرق تهيئة النظام بضع دقائق لتبريد كاميرا الجهاز المقترن ة (CCD) إلى -90 درجة مئوية قبل أن تتمكن من بدء التصوير. سوف تتحول درجة الحرارة الخضراء عندما يتم تبريد كاميرا CCD.
  2. استخدم إعدادات الكاميرا التالية:
    تحقق من الإنارة والصورة الفوتوغرافية.
    تحقق من تراكب.
    إعدادات الإضاءة:
    وقت التعرض يحدد AUTO في الظروف العادية.
    [بينّينغ] مجموعة إلى 8.
    F / إيقاف مجموعات إلى 1.
    تعيين تصفية الانبعاثات مفتوح.
    إعدادات الصورة الفوتوغرافية:
    مجموعات Binning إلى المتوسطة.
    F / إيقاف مجموعات إلى 8.
    إعدادات نظام IVIS:
    مجال العرض: عرض الماوس C= 1، عرض الماوس D = 5.
    يحدد ارتفاع الموضوع 1.5 سم.
  3. وزن وتسجيل الفئران وحساب حجم الكويلينتيرازين (CTZ؛ 2.5 ملغ /كغ) وD-لوسيفيرين (150 ملغ /كغ) اللازمة.
  4. تخدير الفأر الحامل للورم بنسبة 1٪-3٪ isoflurane في الأكسجين 100٪ في غرفة التخدير التعريفي مع معدل تدفق 1 L / دقيقة. مراقبة استجابة قرصة اصبع القدم من الماوس لتأكيد حالة التخدير. ثم، الاستغناء عن قطرة من مرهم العين تشحيم على كلتا العينين لتجنب تلف القرنية.
  5. حقن 2.5 ملغ CTZ (3.33 ملغ / مل) لكل كيلوغرام من وزن الجسم في الرجعية من الماوس (على سبيل المثال، ل20 غرام الماوس، حقن 15 درجة مئوية لتقديم 50 ميكروغرام من CTZ) باستخدام إبرة حقنة الأنسولين.
  6. نقل الماوس الحاملة للورم في غرفة الكاميرا مع أنفه في مخروط التخدير بلطف والحصول على عدة صور من الظهرية الماوس على الفور للحصول على إشارات Rluc من الخلايا 4T1 حتى إشارات BLI تتلاشى.
    ملاحظة: نصف عمر CTZ قصيرة جدا وإشارات Rluc انخفاض بسرعة ~ 30 s. لضمان تبديد أي إشارة Rluc المتبقية والفاصل الزمني بين Rluc وFluc التصوير يجب أن يكون أكثر من 10 دقيقة.
  7. حقن داخل اقابي1 150 ملغ /كغ D-لوسيفيرين (30 ملغ / مل) باستخدام إبرة حقنة الأنسولين (على سبيل المثال، ل20 غرام من الماوس، حقن 100 ميكرولتر لتقديم 3 ملغ من D-لوسيفيرين). احتفظ بالماوس في RT لمدة 10 دقائق قبل تصوير المداخن.
  8. حرك هذا الفأر إلى غرفة الكاميرا مع أنفه في مخروط التخدير مرة أخرى والحصول على عدة صور للماوس الظهري للحصول على إشارات المداخن من تكوين الأوعية الدموية.
    ملاحظة: يجب إجراء جهاز العرض الحركي Fluc لكل ماوس حتى تصل الإشارات إلى الحد الأقصى ثم تتلاشى.
  9. كرر خطوات الإجراءات 5.4-5.8 لكل ماوس.
  10. بعد التصوير، والحفاظ على الفئران في بيئة دافئة حتى تستيقظ الحيوانات.
  11. عند النقطة الزمنية المطلوبة (اليوم 3 و7 و14 و21)، كرر الإجراءات المذكورة أعلاه (الخطوة 5.3-5.10) للكشف عن تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية الورممع مرور الوقت.
  12. تحليل بيانات إشارات Rluc وFluc للتحقيق في العلاقة بين نمو الورم وتكوين الأوعية الدموية في تطور الورم.
    ملاحظة: يتم استخدام المناطق ذات الأهمية (ROI) التي تغطي موقع إشارة BLI لتحليل البيانات. قياس التألق الكلي (الفوتونات) من عائد الاستثمار في وحدة الفوتونات / ثانية / سم2/ steradian (ع / ق / سم2/ ريال) لكل نقطة زمنية.
  13. تحليل إشارات Rluc وFluc من عائدالاستثمار باستخدام برامج الرسومات (الشكل 4).

النتائج

في هذه التجربة، تم إنشاء نموذج الماوس سرطان الثدي باستخدام خلايا 4T1 للتحقيق في العلاقة بين نمو الورم وتكوين الأوعية الدموية الورم (الشكل 1). أولاً، تم تعبئة فيروسين من فيروس اللانتي، يحملان تسلسلات جينية تعبر عن Rluc/RFP (LV-RR) وRluc/RFP/HSV-ttk (LV-RRT)، على التوالي، كما أ...

Discussion

في هذا البروتوكول، يتم وصف نهج BLI المزدوج غير الغازية لرصد تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية. تم تطوير نظام مراسل BLI لأول مرة، الذي يحتوي على جين الانتحار HSV-ttk/GCV لتتبع تطور الورم والانحدار في الجسم الحي عن طريق التصوير Rluc. وفي الوقت نفسه، يتم تقييم تكوين الأوعية الدموية الورم باستخدام الفئ?...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا البحث من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2017YFA0103200)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81671734)، والمشاريع الرئيسية لبرنامج تيانجين لدعم العلوم والتكنولوجيا (18YFZCSY00010)، وصناديق البحوث الأساسية ل الجامعات المركزية (63191155). نحن نعترف بمراجعات غلوريا نانس، التي كانت قيمة في تحسين نوعية مخطوطتنا.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-0.53 mM EDTAGibco25200072
1.5 mL TubesAxygen ScientificMCT-105-C-S
15 mL TubesCorning Glass Works601052-50
293TATCCCRL-3216
4T1ATCCCRL-2539
60 mm DishCorning Glass Works430166
6-well PlateCorning Glass Works3516
Biosafety CabinetShanghai Lishen ScientificHfsafe-900LC
Blasticidine S Hydrochloride (BSD)Sigma-Aldrich15205
Cell Counting Kit-8MedChem ExpressHY-K0301
CO2 Tegulated IncubatorThermo Fisher Scientific4111
Coelenterazine (CTZ)NanoLight Technology479474
D-luciferin Potassium SaltCaliper Life Sciences119222
DMEM MediumGibcoC11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS)BIOIND04-001-1A
Fluorescence MicroscopeNikonTi-E/U/S
Ganciclovir (GCV)Sigma-AldrichY0001129
Graphics SoftwareGraphPad SoftwareGraphpad Prism 6
Insulin Syringe NeedlesBecton Dickinson328421
IsofluraneBaxter691477H
Lentiviral Packaging SystemBiosettiacDNA-pLV03
LiposomeInvitrogen11668019
Living Imaging SoftwareCaliper Life SciencesLiving Imaging Software 4.2
Living Imaging SystemCaliper Life SciencesIVIS Lumina II
MEM MediumInvitrogen31985-070
Penicillin-StreptomycinInvitrogen15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)Corning Glass WorksR21031399
PolybreneSigma-AldrichH9268-1G
RPMI1640 MediumGibcoC11875500BT
SORVALL ST 16R CentrifugeThermo Fisher ScientificThermo Sorvall ST 16 ST16R
Ultra-low Temperature RefrigeratorHaierDW-86L338
XGI-8 Gas Anesthesia SystemXENOGEN Corporation7293

References

  1. Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. The New England Journal of Medicine. 285, 1182-1186 (1971).
  2. Kerbel, R. S. Tumor angiogenesis. The New England Journal of Medicine. 358, 2039-2049 (2008).
  3. Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68, 1167-1182 (2011).
  4. Nakatsu, T., et al. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 440, 372-376 (2006).
  5. McMillin, D. W., et al. Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity. Nature Medicine. 16, 483-489 (2010).
  6. Madero-Visbal, R. A., Hernandez, I. C., Myers, J. N., Baker, C. H., Shellenberger, T. D. In situ bioluminescent imaging of xenograft progression in an orthotopic mouse model of HNSCC. Journal of Clinical Oncology. 26, 17006 (2008).
  7. Wang, R., et al. Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis and Therapeutic Effects with Dual Bioluminescence. Current Pharmaceutical Biotechnology. 18, 422-428 (2017).
  8. Rivera, L. B., Cancer Bergers, G. Tumor angiogenesis, from foe to friend. Science. 349, 694-695 (2015).
  9. Zhang, K., et al. Enhanced therapeutic effects of mesenchymal stem cell-derived exosomes with an injectable hydrogel for hindlimb ischemia treatment. ACS Applied Materials & Interfaces. 10, 30081-30091 (2018).
  10. Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. , 70-81 (2017).
  11. Lee, S., et al. Autocrine VEGF signaling is required for vascular homeostasis. Cell. 130, 691-703 (2007).
  12. Dewhirst, M. W., Cao, Y., Moeller, B. Cycling hypoxia and free radicals regulate angiogenesis and radiotherapy response. Nature Reviews. Cancer. 8, 425-437 (2008).
  13. Wigerup, C., Pahlman, S., Bexell, D. Therapeutic targeting of hypoxia and hypoxia-inducible factors in cancer. Pharmacology & Therapeutics. 164, 152-169 (2016).
  14. Wong, P. P., et al. Dual-action combination therapy enhances angiogenesis while reducing tumor growth and spread. Cancer Cell. 27, 123-137 (2015).
  15. Mezzanotte, L., van 't Root, M., Karatas, H., Goun, E. A., Lowik, C. In vivo Molecular Bioluminescence Imaging: New Tools and Applications. Trends in Biotechnology. 35, 640-652 (2017).
  16. Du, W., Tao, H., Zhao, S., He, Z. X., Li, Z. Translational applications of molecular imaging in cardiovascular disease and stem cell therapy. Biochimie. 116, 43-51 (2015).
  17. Liu, J., et al. Synthesis, biodistribution, and imaging of PEGylated-acetylated polyamidoamine dendrimers. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 14, 3305-3312 (2014).
  18. Branchini, B. R., et al. Red-emitting chimeric firefly luciferase for in vivo imaging in low ATP cellular environments. Analytical Biochemistry. 534, 36-39 (2017).
  19. McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing "red-shifted" luciferase. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7, e2571 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

150HSV ttk

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved