Imagen de bioluminiscencia dual de la progresión tumoral y la angiogénesis

Resumen

Este protocolo describe el establecimiento de un modelo de ratón con tumores para monitorear la progresión tumoral y la angiogénesis en tiempo real mediante imágenes de bioluminiscencia dual.

Resumen

La angiogénesis, como un proceso crucial de progresión tumoral, se ha convertido en un punto crítico de investigación y objetivo de la terapia antitumoral. Sin embargo, no existe un modelo fiable para rastrear la progresión tumoral y la angiogénesis simultáneamente de una manera visual y sensible. Las imágenes de bioluminiscencia muestran su superioridad única en las imágenes vivas debido a sus ventajas de alta sensibilidad, fuerte especificidad y medición precisa. Aquí se presenta un protocolo para establecer un modelo de ratón con tumores mediante la inyección de una línea 4T1 de células de cáncer de mama murina con etiqueta de Renilla luciferasse en el ratón transgénico con expresión de luciferasa de luciérnaga inducida por angiogénesis. Este modelo de ratón proporciona una valiosa herramienta para monitorear simultáneamente la progresión tumoral y la angiogénesis en tiempo real mediante imágenes de bioluminiscencia dual en un solo ratón. Este modelo puede aplicarse ampliamente en la detección de fármacos antitumorales y la investigación oncológica.

Introducción

La angiogénesis es un proceso esencial en la progresión del cáncer de neoplasias pequeñas y localizadas a tumores más grandes y potencialmente metastásicos^1,2. La correlación entre el crecimiento tumoral y la angiogénesis se convierte en uno de los puntos de énfasis en el campo de la investigación oncológica. Sin embargo, los métodos tradicionales para medir los cambios morfológicos no monitorean la progresión tumoral y la angiogénesis simultáneamente en animales vivos utilizando un enfoque visualizado.

La imagen de bioluminiscencia (BLI) de las células tumorales es un método experimental particularmente apropiado para controlar el crecimiento tumoral debido a su no invasividad, sensibilidad y especificidad^3,4,5,6 . La tecnología BLI se basa en el principio de que la luciferasa puede catalizar la oxidación de un sustrato específico mientras emite bioluminiscencia. La luciferasa expresada en células tumorales implantadas reacciona con el sustrato inyectado, que puede ser detectado por un sistema de imágenes vivo, y las señales reflejan indirectamente los cambios en el número de células o localización celular in vivo^6,7.

A excepción del crecimiento tumoral, la angiogénesis tumoral (el paso crítico en la progresión del cáncer) también se puede visualizar a través de la tecnología BLI utilizando ratones transgénicos Vegfr2-Fluc-KI^8,9,10. El receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (Vegf), un tipo de receptor Vegf, se expresa principalmente en las células endoteliales vasculares de ratones adultos^11. En los ratones transgénicos Vegfr2-Fluc-KI, la secuencia de ADN de La luciérnaga de luciérnaga (Fluc) se golpea en el primer exón de la secuencia endógena Vegfr2. Como resultado, el Fluc se expresa (que aparece como señales BLI) de una manera que es idéntica al nivel de angiogénesis en ratones. Para crecer más allá de unos pocos milímetros de tamaño, el tumor recluta nuevas vasculaturas de los vasos sanguíneos existentes, que expresan altamente el Vegfr2 desencadenado por factores de crecimiento de las células tumorales¹. Esto abre la posibilidad de usar ratones transgénicos Vegfr2-Fluc-KI para monitorear no invasivamente la angiogénesis tumoral por BLI.

En este protocolo, se establece un modelo de ratón con tumores para monitorear la progresión tumoral y la angiogénesis en un solo ratón a través de la luciferasa de luciérnaga (Fluc) y la imagen de Renilla luciferase (Rluc), respectivamente (Figura1). Se crea una línea celular 4T1 (4T1-RR) que expresa establemente Rluc y proteína fluorescente roja (RFP) para rastrear el crecimiento celular por imágenes Rluc. Para investigar más a fondo los cambios dinámicos de la angiogénesis en la progresión y regresión del tumor, se crea otra línea celular 4T1 (4T1-RRT) que expresa el virus del herpes simple suicida truncado por timidasquina (HSV-ttk), Rluc y RFP. Mediante la administración de ganciclovir (GCV), las células que expresan el VHS-ttk se ablan selectivamente. Basado en estas líneas celulares, se construye un modelo de portador de tumores en ratones Vegfr2-Fluc-KI que sirve como un modelo experimental que une la progresión tumoral y la angiogénesis tumoral in vivo.

Protocolo

Los experimentos deben cumplir con las regulaciones nacionales e institucionales relativas al uso de animales con fines de investigación. Se deben obtener permisos para llevar a cabo experimentos. El tratamiento de los animales y los procedimientos experimentales del estudio se adhieren a las Directrices del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Nankai que se ajustan a las Directrices para el Cuidado de los Animales aprobadas por los Institutos Nacionales de Salud (NIH).

1. Envases y producciones lentivirales LV-Rluc-RFP (RR) y LV-Rluc-RFP-HSV-ttk (RRT)

NOTA: El pLV-RR lleva las secuencias genéticas de Renilla luciferasa (Rluc) y proteína fluorescente roja (RFP) bajo el promotor EF1, mientras que el pLV-RRT lleva las secuencias genéticas que codifican Rluc, RFP y el virus del herpes simple truncada por timidas quinasa (HSV-ttk) ( Figura 2).

1. Semilla 1 x 10⁶ de 293T células por pozo en una placa de 6 pozos y cultivo durante la noche en una incubadora humidificada con 5% co₂ a 37 oC con el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS).
2. Preparar la suspensión de liposomas: mezclar 7,5 ml de liposoma y 0,25 ml de medio esencial mínimo (MEM) en un tubo de 1,5 ml después de la incubación durante 5 min a temperatura ambiente (RT) para dispersar los liposomas por igual.
3. Prepare la solución DNAs (DNAs-RR): por separado, agregue el vector pLV-RR y los plásmidos auxiliares a 0,25 ml de MEM en un tubo de 1,5 ml como se describe en la Tabla1.
4. Obtener el liposoma/ DNAs-RR compuesto: añadir suavemente la solución DNAs-RR en liposoma preparado suspensión gota a gota e incubar durante 20 minutos a RT para que el ADN se adhiera a la membrana lipídica.
5. Reemplace el medio de las células 293T por 1 ml de DMEM que contenga 10% FBS y agregue suavemente el compuesto liposoma/DNAs-RR al medio de las células 293T.
6. Después de incubar en una incubadora humidificada con 5% de CO₂ a 37oC durante 12–16 h, sustituya el compuesto liposoma/DNAs-RR que contenga un medio de las células 293T con 1 ml de DMEM que contenga 10% de FBS y 100 U/ml de penicilina-estreptomicina.
7. Continúe el cultivo de las células 293T en la incubadora humidificada durante 48 h después de la transfección. A continuación, recoger el sobrenadante de las células 293T y centrifugar el medio a 300 x g durante 5 minutos para peletizar las células 293T. Transfiera el sobrenadante que contiene el lentivirus-RR (LV-RR) en tubos de almacenamiento de polipropileno estéril de 1,5 ml y guárdelo a -80 oC.
   NOTA: Se requiere una instalación de nivel 2 de bioseguridad (BSL-2) para trabajar con lentivirus recombinante.
8. Repita los pasos 1.1–1.7 y utilice el vector pLV-RRT en lugar del vector pLV-RR en el paso 1.3 para obtener el lentivirus-RRT (LV-RRT). Conservar el LV-RRT a -80oC.
   NOTA: El stock lentiviral no purificado puede inhibir el crecimiento celular en algunos casos. Es posible que sea necesario purificar las existencias lentivirales. Las reservas lentivirales que contienen partículas LV-RR o LV-RRT deben dividirse en tubos de 1,5 ml (1 ml por tubo) para su almacenamiento con el fin de evitar múltiples ciclos de descongelación libre.

2. Transducción lentiviral LV-RR y LV-RRT para la expresión génica en células 4T1

1. Setransforme las células 4T1 en una placa de 6 pocillos (5 x 10⁵ células/pozo) y el cultivo con medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 que contenga 10% de FBS durante la noche en una incubadora humidificada con 5% de CO2 a 37 oC.
2. Retire el medio de la placa de cultivo y reemplácelo por 1 ml de rpm i/m.1 mL medio, así como 1 ml de stock lentiviral (LV-RR o LV-RRT) a cada pocto. Agregue el polibrino de 8 g/ml y mezcle suavemente el medio que contiene partículas lentivirales pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
   NOTA: Tenga en cuenta que el medio contiene partículas lentivirales, que podrían transducir las células humanas.
3. Solución de transducción de giro en una centrífuga a 1.000 g durante 60 minutos a RT para ayudar a aumentar la eficiencia de transducción. Después de la centrifugación, el cultivo de células 4T1 durante 4-12 h y mantener en una incubadora humidificada con 5% de CO₂ a 37 oC.
   NOTA: Para algunas líneas celulares, el polibrino puede ser tóxico para el cultivo a largo plazo. Por lo tanto, el tiempo de incubación para transducir diferentes células puede ser cambiante. Compruebe el estado de la celda varias veces para encontrar el tiempo de incubación adecuado.
4. Refresque el medio de las células 4T1 transducidas con 2 ml de medio RPMI 1640 que contiene 10% FBS y 100 U/ml de penicilina-estreptomicina para eliminar partículas lentivirales y polibrino.

3. Examen e identificación de drogas de células 4T1 transducidas por LV-RR y LV-RRT

1. Seleccione células transducidas con medio que contenga blasticidina (BSD) de acuerdo con el gen de resistencia BSD transportado por LV-RR o LV-RRT como se describen en los siguientes pasos.
   NOTA: Alternativamente, las células transducidas que son RFP-positivas podrían ser seleccionadas por citometría de flujo de acuerdo con el gen RFP transportado por LV-RR o LV-RRT.
2. 48 h después de la transducción, paso de células 4T1 en la proporción de 1:3 a 1:4 con medio de selección (medio RPMI 1640 que contiene 10% FBS, 100 U/ml penicilina-estreptomicina, y 5 g/ml DE BSD). Cambie el medio cada 2 o 3 días.
   NOTA: La concentración óptima de BSD puede variar de una línea de celda a una línea celular. Por lo tanto, se debe realizar un experimento piloto de curva de muerte para determinar la concentración óptima de BSD antes del experimento inicial.
3. 7 días después de la detección de fármacos, observe las células 4T1 transducidas por LV-RR (4T1-RR) y las células 4T1 transducidas por LV-RRT (4T1-RRT) bajo el microscopio de contraste de fase invertido por fluorescencia. Cuente el número de celdas RFP⁺ 4T1 y todas las celdas 4T1 en tres campos de visión para estimar la relación RFP-positiva, respectivamente (Figura2).
   NOTA: Alternativamente, la relación RFP-positiva de las células 4T1 transducidas podría identificarse mediante citometría de flujo.
4. Mida las señales de renilla de las células 4T1-RR y las células 4T1-RRT utilizando un sistema de imágenes vivo para detectar la relación lineal entre los números de celda y las señales de renilla (Figura3).
5. Expanda las células 4T1-RR y 4T1-RRT con pantalla BSD 4T1-RR y 4T1-RRT con medio de selección en relaciones de división entre 1:3 y 1:4 y almacene las existencias de línea celular en nitrógeno líquido.

4. Ratones Vegfr2-Fluc-KI y modelo de ratón con tumores

NOTA: Los ratones transgénicos Vegfr2-Fluc-KI, de 6 a 8 semanas de edad y hembras, se utilizan en este experimento para monitorear no invasivamente la angiogénesis in vivo por BLI.

1. Células 4T1-RR de cultivo y células 4T1-RRT en platos Petri de 60 mm en una incubadora humidificada con 5% de_CO2 a 37oC, respectivamente. Cuando las células estén al 80% de confluencia, retire el medio y enjuague con solución salina tamponada de fosfato (PBS).
2. Retire el PBS y agregue 2 mL adicionales de 0.25% trypsin-0.53 mM EDTA solución respectivamente. Mantenga el plato a RT (o a 37 oC) hasta que las células se sequen.
3. Agregue 5-10 ml de medio fresco que contenga 10% FBS, luego aspire y dispensará células para resuspender las células 4T1-RR y 4T1-RRT en tubos centrífugos de 15 ml, respectivamente. Cuente dos tipos de células 4T1 usando una cámara de conteo y prepare las suspensiones celulares a una concentración de 1 x 10⁶ por 100 l en medio RPMI 1640.
4. Anestetizar los ratones Vegfr2-Fluc-KI con 1%-3% de isoflurano en oxígeno 100% en la cámara de inducción de anestesia con un caudal de 1 L/min. Monitorear la respuesta de pellizcar del dedo del pie del ratón para confirmar el estado de la anestesia. Luego, aplica pomada oftálmica a los ojos del ratón para prevenir la deshidratación.
5. Retire el ratón de la cámara y la posición en nosecone. Retire por completo el pelo del hombro del ratón mediante el uso de la afeitadora eléctrica y la crema de depilación, lo que podría proporcionar una buena vista del campo quirúrgico y evitar bloquear las señales BLI en los experimentos de seguimiento.
6. Inyecte subcutáneamente células 4T1-RR (1 x 10⁶ células a un volumen total de 100 ol) y células 4T1-RRT (1 x 10⁶ celdas a un volumen total de 100 l) en los hombros izquierdo y derecho de cada ratón, respectivamente (registro como día 0). Coloque los ratones en el área de recuperación con soporte térmico hasta que estén completamente recuperados.
7. Después de la implantación de las células 4T1-RR y 4T1-RRT, toque las masas tumorales para comprobar que los ratones son portadores de tumores todos los días (FiguraS1). En el día 7 después de la implantación, inyectar por vía intraperitoneal 50 mg/kg de ganciclovir (GCV) a los ratones portadores de tumores dos veces al día hasta el final del experimento.
   NOTA: Antes de este experimento, se debe detectar el citotóxico de GCV en células 4T1-RRT. La eficiencia de matanza de GCV podría evaluarse mediante el ensayo de recuento celular con diferente concentración de GCV (FiguraS2).
8. En los días 0, 3, 7, 14 y 21 después de la implantación 4T1, controlar el crecimiento tumoral y la angiogénesis de ratones portadores de tumores y evaluar por imágenes Rluc y Fluc (Figura4).

5. Imagen de bioluminiscencia dual del tumor (Rluc) y la angiogénesis (Fluc)

1. Abra el sistema de imágenes vivas, inicialice el software de imágenes vivo y, a continuación, inicialice el sistema.
   NOTA: La inicialización del sistema tardará unos minutos en enfriar la cámara del dispositivo acoplado a carga (CCD) a -90 oC antes de poder iniciar la creación de imágenes. La temperatura se volverá verde cuando se enfríe la cámara CCD.
2. Utilice los siguientes ajustes de cámara:
   Compruebe la Luminiscencia y fotografía.
   Compruebe Superposición.
   Ajustes de luminiscencia:
   El tiempo de exposición establece AUTO en condiciones normales.
   Binning se establece en 8.
   F/Stop se establece en 1.
   Conjuntos de filtros de emisión Abiertos.
   Ajustes de fotografía:
   Binning se establece en medio.
   F/Stop se establece en 8.
   Configuración del sistema IVIS:
   Campo de visión: Vista del ratón C-1, Vista de ratones D-5.
   La altura del sujeto establece 1,5 cm.
3. Pesar y registrar los ratones y calcular el volumen de coelenterazina (CTZ; 2,5 mg/kg) y D-luciferina (150 mg/kg) necesarios.
4. Anestetiza el ratón portador de tumores en 1%–3% de isoflurano en oxígeno 100% en la cámara de inducción de anestesia con un caudal de 1 L/min. Monitoree la respuesta de pellizcar del dedo del pie del ratón para confirmar el estado de la anestesia. Luego, dispensar una gota de pomada lubrial en ambos ojos para evitar daños corneales.
5. Inyectar 2,5 mg de CTZ (3,33 mg/ml) por kilogramo de peso corporal en el retrobulbar del ratón (por ejemplo, para un ratón de 20 g, inyectar 15 ml para administrar 50 g de CTZ) utilizando una aguja de jeringa de insulina.
6. Mueva el ratón portador de tumores a la cámara de la cámara con su nariz en el cono de anestesia suavemente y adquiera varias imágenes de la dorsal del ratón inmediatamente para obtener las señales Rluc de las células 4T1 hasta que las señales BLI se desvanezcan.
   NOTA: La vida media de CTZ es muy corta y las señales de Rluc caen precipitadamente 30 s. Para garantizar que cualquier señal Rluc residual se haya disipado y que el intervalo entre las imágenes Rluc y Fluc sea superior a 10 minutos.
7. Inyecte por vía intraperitoneal 150 mg/kg de D-luciferina (30 mg/ml) utilizando una aguja de jeringa de insulina (por ejemplo, para un ratón de 20 g, inyecte 100 ml para administrar 3 mg de D-luciferina). Mantenga el ratón en RT durante 10 minutos antes de la toma de imágenes de Fluc.
8. Mueva este ratón a la cámara de la cámara con la nariz en el cono de anestesia de nuevo y adquiera varias imágenes de la dorsal del ratón para obtener las señales Fluc de la angiogénesis.
   NOTA: El monitor cinético Fluc debe realizarse para cada ratón hasta que las señales alcancen el máximo y luego se desvanezcan.
9. Repita los procedimientos 5.4–5.8 para cada ratón.
10. Después de la toma de imágenes, mantenga a los ratones en un ambiente cálido hasta que los animales despierten.
11. En el punto de tiempo deseado (día 3, 7, 14 y 21), repita los procedimientos anteriores (paso 5.3–5.10) para detectar la progresión tumoral y la angiogénesis tumoral con el tiempo.
12. Analizar los datos de señales Rluc y Fluc para investigar la relación entre el crecimiento tumoral y la angiogénesis en la progresión tumoral.
    NOTA: Las regiones de interés (ROI) que cubren el sitio de la señal BLI se utilizan para analizar los datos. Mida el resplandor total (fotones) del ROI en la unidad de fotones/segundos/cm²/steradian (p/s/cm²/sr) para cada punto de tiempo.
13. Analice las señales Rluc y Fluc del ROI utilizando el software gráfico (Figura4).

Resultados

En este experimento, se estableció un modelo de ratón de cáncer de mama utilizando células 4T1 para investigar la relación entre el crecimiento tumoral y la angiogénesis tumoral (Figura 1). En primer lugar, se empaquetaron dos lentivirus, que llevaban secuencias genéticas que expresaban Rluc/RFP (LV-RR) y Rluc/RFP/HSV-ttk (LV-RRT), respectivamente, como se informó anteriormente^7. Luego, dos líneas celulares 4T1 diferentes, lla...

Discusión

En este protocolo, se describe un enfoque de BLI dual no invasivo para monitorear el desarrollo tumoral y la angiogénesis. El sistema de reporteros bli se desarrolla por primera vez, que contiene el gen suicida HSV-ttk/GCV para rastrear la progresión del tumor y la regresión in vivo por imágenes Rluc. Mientras tanto, la angiogénesis tumoral se evalúa utilizando ratones Vegfr2-Fluc-KI a través de imágenes de Fluc. Este modelo de ratón con tumores es capaz de proporcionar una plataforma práctica para el desarroll...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA	Gibco	25200072
1.5 mL Tubes	Axygen Scientific	MCT-105-C-S
15 mL Tubes	Corning Glass Works	601052-50
293T	ATCC	CRL-3216
4T1	ATCC	CRL-2539
60 mm Dish	Corning Glass Works	430166
6-well Plate	Corning Glass Works	3516
Biosafety Cabinet	Shanghai Lishen Scientific	Hfsafe-900LC
Blasticidine S Hydrochloride (BSD)	Sigma-Aldrich	15205
Cell Counting Kit-8	MedChem Express	HY-K0301
CO2 Tegulated Incubator	Thermo Fisher Scientific	4111
Coelenterazine (CTZ)	NanoLight Technology	479474
D-luciferin Potassium Salt	Caliper Life Sciences	119222
DMEM Medium	Gibco	C11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS)	BIOIND	04-001-1A
Fluorescence Microscope	Nikon	Ti-E/U/S
Ganciclovir (GCV)	Sigma-Aldrich	Y0001129
Graphics Software	GraphPad Software	Graphpad Prism 6
Insulin Syringe Needles	Becton Dickinson	328421
Isoflurane	Baxter	691477H
Lentiviral Packaging System	Biosettia	cDNA-pLV03
Liposome	Invitrogen	11668019
Living Imaging Software	Caliper Life Sciences	Living Imaging Software 4.2
Living Imaging System	Caliper Life Sciences	IVIS Lumina II
MEM Medium	Invitrogen	31985-070
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning Glass Works	R21031399
Polybrene	Sigma-Aldrich	H9268-1G
RPMI1640 Medium	Gibco	C11875500BT
SORVALL ST 16R Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	Thermo Sorvall ST 16 ST16R
Ultra-low Temperature Refrigerator	Haier	DW-86L338
XGI-8 Gas Anesthesia System	XENOGEN Corporation	7293