腫瘍進行と血管新生の二重生物発光イメージング

要約

このプロトコルは、二重生物発光イメージングによって腫瘍の進行および血管新生をリアルタイムで監視する腫瘍担持マウスモデルの確立について説明する。

要約

血管新生は、腫瘍進行の重要なプロセスとして、抗腫瘍療法の研究ホットスポットおよび標的となっている。しかし、腫瘍の進行と血管新生を視覚的かつ敏感な方法で同時に追跡するための信頼性の高いモデルはありません。生物発光イメージングは、高感度、強い特異性、正確な測定の利点により、生きたイメージングにおける独自の優位性を発用します。ここで提示されるのは、血管新生誘発ホタルルシフェラーゼ発現を有するトランスジェニックマウスにレニラ・ルシフェラーゼ標識マウス乳癌細胞株4T1を注入することによって腫瘍性マウスモデルを確立するためのプロトコルである。このマウスモデルは、単一のマウスにおける二重生物発光イメージングにより、腫瘍の進行と血管新生をリアルタイムで同時に監視する貴重なツールを提供します。このモデルは、抗腫瘍薬物スクリーニングおよび腫瘍学研究に広く適用されうる。

概要

血管新生は、小さな局所的な新生物からより大きな、潜在的に転移性腫瘍1、2への癌の進行に不可欠なプロセスである。腫瘍の増殖と血管新生との相関関係は、腫瘍学研究の分野で重点の一つとなる。しかし、形態学的変化を測定する従来の方法は、視覚化されたアプローチを使用して、生きた動物の腫瘍の進行と血管新生を同時に監視することができません。

腫瘍細胞の生物発光イメージング(BLI)は、その非侵襲性、感受性、および特異性3、4、5、6のために腫瘍の増殖を監視するための特に適切な実験方法である.BLI技術は、ルシフェラーゼが生物発光を放出しながら特定の基質の酸化を触媒することができるという原理に基づいています。移植された腫瘍細胞で発現されるルシフェラーゼは、生体イメージングシステムによって検出することができる注入された基板と反応し、シグナルは生体内6、7における細胞数または細胞局在化の変化を間接的に反映する。

腫瘍増殖を除いて、腫瘍血管新生(癌進行の重要なステップ)はまた、Vegfr2-Fluc-KIトランスジェニックマウス8、9、10を用いてBLI技術を用いて可視化することができる。血管内皮増殖因子(Vegf)受容体2(Vegfr2)は、Vegf受容体の1つのタイプであり、主に成体^マウス11の血管内皮細胞において発現される。Vegfr2-Fluc-KIトランスジェニックマウスでは、ホタルルシフェラーゼ(Fluc)のDNA配列が内因性Vegfr2配列の最初のエキソンにノックされる。その結果、Flucは、マウスの血管新生のレベルと同じ方法で(BLIシグナルとして現れる)発現する。数ミリメートルを超えて成長するために、腫瘍は、腫瘍細胞1からの成長因子によって引き起こされるVegfr2を高度に発現する既存の血管から新しい血管を新たに産生する。これにより、BlIによる腫瘍血管新生を非侵襲的に監視するためにVegfr2-Fluc-KIトランスジェニックマウスを使用する可能性が開かれる。

このプロトコルでは、ホタルルシフェラーゼ(Fluc)およびレニラ・ルシフェラーゼ(Rluc)イメージングを介して単一のマウスにおける腫瘍進行および血管新生をそれぞれモニタリングする腫瘍性マウスモデルが確立される(図1)。4T1細胞株(4T1-RR)を作成し、Rlucイメージングにより細胞増殖を追跡するためにRlucおよび赤色蛍光タンパク質(RFP)を安定的に発現させる。腫瘍の進行および回帰における血管新生の動的変化をさらに調べるため、自殺遺伝子ヘルペス単純ヘルペスを発現する別の4T1細胞株(4T1-RRT)が作成され、チミジンキナーゼ(HSV-ttk)、Rluc、およびRFPが切り捨てられた。ガンシクロビル(GCV)の投与により、HSV-ttk発現細胞は選択的にアブレーションされる。これらの細胞株に基づいて、Vegfr2-Fluc-KIマウスにおける腫瘍担持モデルは、生体内で腫瘍進行および腫瘍血管新生を橋渡しする実験モデルとして機能する。

プロトコル

実験は、研究目的での動物の使用に関する国および制度上の規制を遵守しなければなりません。実験を行うための許可を得る必要があります。動物の治療と研究の実験手順は、国立衛生研究所(NIH)が承認した動物ケアガイドラインに準拠した南海大学動物管理利用委員会ガイドラインに準拠しています。

1. LV-Rluc-RFP(RR)およびLV-Rluc-RFP-HSV-ttk(RRT)レンチウイルス包装および生産

注:pLV-RRは、プロモーターEF1αの下でレニラ・ルシフェラーゼ(Rluc)および赤色蛍光タンパク質(RFP)の遺伝子配列を運ぶのに対し、pLV-RRTはRluc、RFP、および単純ヘルペスウイルスをコードする遺伝子配列を運ぶのに対し、チミジンキナーゼ(HSV-ttk) (図2)

1. 種子1 x 10⁶の293T細胞を6ウェルプレートに一晩培養し、10%の胎児ウシ血清(FBS)を含むダルベッコの改変ワシ培地(DMEM)を用いて37°Cで5%CO2を有する加湿インキュベーターで培養した。
2. リポソーム懸濁液を調べなさい:リポソームの7.5 μLと最小必須培地(MEM)の0.25 mLを室温(RT)で5分間インキュベーションした後の1.5mLチューブに混合し、リポソームを均等に分散させます。
3. DNA溶液(DNA-RR)を調製する:別途、表1に記載の通り1.5mLチューブにMEMの0.25 mLにpLV-RRベクターおよびヘルパープラスミドを添加する。
4. リポソーム/DNA-RR化合物を得る:DNAが脂質膜に結合するように、RTで20分間ドロップしてドロップして準備されたリポソーム懸濁液滴にDNA-RR溶液を穏やかに追加します。
5. 293T細胞の培地を10%FBSを含むDMEMの1 mLに置き換え、293T細胞の培地にリポソーム/DNA-RR化合物を穏やかに添加する。
6. 加湿したインキュベーターで5%CO2を37°Cで12~16時間インキュベートした後、293T細胞の培地を含むリポソーム/DNA-RR化合物を10%FBSおよび100 U/mLペニシリン-ストレプトマイシンを含むDMEMの1mLに置き換える。
7. 加湿インキュベーター内の293T細胞をトランスフェクション後48時間培養し続ける。次いで、293T細胞の上清を集め、293T細胞をペレットに5分間300xgで遠心分離する。 レンチウイルス-RR(LV-RR)含有上清を1.5mLの滅菌ポリプロピレン貯蔵管に移し、-80°Cで保管する。
   注:組換えレンチウイルスを使用するには、バイオセーフティレベル2(BSL-2)施設が必要です。
8. ステップ 1.1~1.7 を繰り返し、ステップ 1.3 で pLV-RRT ベクトルの代わりに pLV-RRT ベクトルを使用して、レンチウイルス-RRT (LV-RRT) を取得します。LV-RRTを-80 °Cで保管してください。
   注:非精製レンチウイルスストックは、場合によっては細胞の増殖を阻害する可能性があります。レンチウイルスストックを精製する必要がある場合があります。LV-RRまたはLV-RRT粒子を含むレンチウイルスストックは、複数のフリー解凍サイクルを避けるために貯蔵のために1.5 mLチューブ(チューブあたり1mL)に分割する必要があります。

4T1細胞における遺伝子発現に対するLV-RRおよびLV-RRTレンチウイルス伝達

1. 種子4T1細胞を6ウェルプレート(5 x 10⁵細胞/ウェル)にし、ロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640培地を37°Cで5%CO2を有する加湿インキュベーターで一晩10%FBSを含む培養剤と共に培養した。
2. 培養プレートから培地を取り出し、1mLの新鮮なRPMI 1640培地と1mLのレンチウイルスストック(LV-RRまたはLV-RRT)を各ウェルに交換します。8 μg/mLポリブレンを加え、上下にピペッティングしてレンチウイルス粒子を含む培地を穏やかにブレンドします。
   注:培地にはレンチウイルス粒子が含まれており、ヒト細胞をトランスデュースする可能性があることにご注意ください。
3. RTで1,000×gで60分間遠心分離機でスピントランスダクション溶液を使用し、トランスダクション効率を向上させます。遠心分離後、4T1細胞を4~12時間培養し、37°Cで5%CO2を加えた加湿インキュベーターで維持する。
   注:一部の細胞株では、ポリブレンは長期培養に有毒である可能性があります。したがって、異なる細胞をトランスデュースするためのインキュベーション時間は、変更可能でありてもよい。適切なインキュベーション時間を見つけるために、細胞の状態を複数回確認してください。
4. 10%FBSおよび100 U/mLペニシリンを含むRPMI 1640培地の2mLで変換された4T1細胞の培地をリフレッシュし、レンチウイルス粒子およびポリブレンを除去する。

3. LV-RRおよびLV-RRTの薬物スクリーニングと同定 4T1細胞

1. 以下の手順で、LV-RRまたはLV-RRTによって運ばれるBSD耐性遺伝子に従ってブラスチシジン(BSD)を含有する培地を有するトランスベート細胞を選択する。
   注:あるいは、RFP陽性であるトランスメ下細胞は、LV-RRまたはLV-RRTによって運ばれるRFP遺伝子に従ってフローサイトメトリーによって選択することができる。
2. 経度後48時間、選択培地を用いた1:3~1:4の比で4T1細胞を通過(RPMI 1640培地は10%FBS、100U/mLペニシリン−ストレプトマイシン、および5μg/mL BSD)。2 日または 3 日ごとにメディアを変更します。
   注:最適なBSD濃度は、細胞株によって異なる場合があります。したがって、最初の実験の前にBSDの最適濃度を決定するために、キルカーブのパイロット実験を行うべきである。
3. 薬物スクリーニング後7日間、蛍光反転相造顕微鏡下でLV-RR変換4T1細胞(4T1-RR)及びLV-RRTを4T1細胞(4T1-RRT)で観察する。RFP⁺ 4T1 セルとすべての 4T1 セルの数を 3 つの視野の 4T1 セルでカウントし、それぞれ RFP 陽性比を推定します (図2)。
   注:あるいは、トランスメトリー4T1細胞のRFP陽性比は、フローサイトメトリーによって同定され得る。
4. 生体イメージングシステムを用いて4T1-RR細胞と4T1-RRT細胞のレニラ信号を測定し、細胞数とレニラ信号の線形関係を検出する(図3)。
5. BSDスクリーニングされた4T1-RRおよび4T1-RRT細胞を1:3と1:4の間の分割比で選択媒体と拡大し、液体窒素の細胞株を貯える。

4. Vegfr2-Fluc-KIマウスおよび腫瘍性マウスモデル

注:トランスジェニックVegfr2-Fluc-KIマウスは、6〜8週齢および雌、BLIによって生体内の血管新生を非侵襲的に監視するために、この実験で使用される。

1. 培養4T1-RR細胞及び4T1-RRT細胞を60mmペトリ皿中に、それぞれ37°Cで5%CO2を加えた加湿インキュベーターに入れた。細胞が80%の合流点にある場合は、培地を取り出し、リン酸緩衝生理食べ物(PBS)ですすいで下す。
2. PBSを取り出し、それぞれ0.25%トリプシン-0.53 mM EDTA溶液の追加2 mLを追加します。細胞が切れるまでRT(または37°C)で皿を保ちます。
3. 10%FBSを含む新鮮な培地の5〜10 mLを追加し、それぞれ15 mL遠心管に4T1-RRおよび4T1-RRT細胞を再中断するために細胞を吸引し、分配する。計数室を用いて2種類の4T1細胞をカウントし、RPMI 1640培地で100μL当たり1x10⁶の濃度で細胞懸濁液を調出す。
4. 1%-3%のイソルランを麻酔誘導室で100%酸素で麻酔で麻酔するVegfr2-Fluc-KIマウスを1L/minの流量で麻酔を行い、マウスのつま先ピンチ応答を監視して麻酔の状態を確認します。次に、脱水を防ぐためにマウスの目に眼科のチントを適用します。
5. 部屋からマウスを取り出し、ノセコーンの位置を取り除きます。電動剃毛クリームと脱毛クリームを使用してマウスの肩の毛を完全に取り除き、手術場の良好な視野を提供し、フォローアップ実験でBLI信号を遮断するのを避けることができる。
6. 各マウスの左右の肩に4T1-RR細胞(1x 10 μL総容積で1x10⁶細胞)と4T1-RRT細胞(1x 10μL総容積で1x10⁶セル)を皮下に注入します(0日目として記録)。完全に回復するまで、熱サポートを備えた回復領域にマウスを配置します。
7. 4T1-RRおよび4T1-RRT細胞を移植した後、腫瘍塊に触れ、マウスが毎日腫瘍を持っていることを確認する(図S1)。7日目の移植後、腫瘍を持つマウスに50mg/kgガンシクロビル(GCV)を実験終了まで1日2回注射する。
   注:この実験の前に、4T1-RRT細胞上のGCVの細胞傷害性を検出する必要があります。GCVの殺し効率は、GCVの異なる濃度を有する細胞計数アッセイによって評価することができる(図S2)。
8. 4T1移植後0日目、3日目、7月14日、および21日目に、腫瘍担持マウスの腫瘍増殖および血管新生をモニタリングし、RlucおよびFlucイメージングの両方によって評価する(図4)。

5. 腫瘍(Rluc)と血管新生(Fluc)の二重生物発光イメージング

1. リビングイメージングシステムを開き、リビングイメージングソフトウェアを初期化し、システムを初期化します。
   注: システムの初期化は、充電結合デバイス (CCD) カメラを -90 °C に冷却してからイメージングを開始するまでに数分かかります。CCDカメラを冷却すると、温度が緑色に変わります。
2. 次のカメラ設定を使用します。
   ルミネッセンスと写真を確認してください。
   [オーバーレイ] をオンにします。
   発光設定:
   露出時間は、通常の状態でAUTOを設定します。
   ビニングは 8 に設定されます。
   F/ストップは 1 に設定されます。
   放出フィルタが開きます。
   写真の設定:
   ビニングはミディアムに設定されます。
   F/ストップは8に設定します。
   IVIS システム設定:
   視野: C=1 マウス ビュー、D=5 マウス ビュー。
   被写体の高さは1.5cm。
3. マウスの重量を量り、記録し、必要なコエレンテラジン(CTZ;2.5 mg/kg)とD-ルシフェリン(150 mg/kg)の体積を計算します。
4. 1L/minの流量の麻酔誘導室で100%酸素で腫瘍を持つマウスを1%~3%イソルランで麻酔する。その後、角膜損傷を避けるために、両眼に潤滑眼軟膏の滴を分配する。
5. マウスのレトロブルバーに体重1キログラム当たり2.5mg CTZ(3.33mg/mL)を注入し(例えば、20gマウスの場合、15μLを注入して50μgのCTZを送達する)、 インスリン注射針を使用して。
6. 腫瘍を持つマウスを麻酔コーンでカメラチャンバーに移動し、BLI信号が消えるまで4T1細胞からのRluc信号を取得するために、マウスの後部のいくつかの写真をすぐに取得します。
   注:CTZの半減期は非常に短く、Rlucの信号は~30sに急激に低下します。残留Rluc信号が消散し、RlucとFlucイメージングの間隔が10分以上であることを確認する必要があります。
7. インスリン注射針を用いて150mg/kg D-ルシフェリン(30mg/mL)を経口注射する(例えば、20gマウスの場合、100μLを注入して3mgのD-ルシフェリンを送達する)。Flucイメージングの前に10分間RTでマウスを保持します。
8. 再び麻酔コーンで鼻を持つカメラ室にこのマウスを移動し、血管新生からFluc信号を得るためにマウスの後部のいくつかの写真を取得します。
   注:信号が最大値に達してからフェードするまで、Fluc運動モニタは各マウスに対して実行する必要があります。
9. 各マウスの手順 5.4 ~ 5.8 を繰り返します。
10. イメージング後、動物が目を覚ますまで、マウスを暖かい環境で維持します。
11. 所望の時点(3日目、7日目、14日目、および21日目)で、上記の手順(ステップ5.3-5.10)を繰り返し、時間の経過とともに腫瘍の進行および腫瘍血管新生を検出する。
12. RlucおよびFlucシグナルデータを分析し、腫瘍進行における腫瘍増殖と血管新生との関係を調べます。
    注: BLI 信号サイトをカバーする対象領域 (ROI) は、データの分析に使用されます。フォトン/秒/cm²/steradian (p/s/cm²/sr) の単位で ROI の総輝度(フォトン)を各時間単位で測定します。
13. グラフィックスソフトウェアを使用してROIのRluc信号とFluc信号を解析します(図4)。

結果

本実験では、4T1細胞を用いて乳癌マウスモデルを確立し、腫瘍増殖と腫瘍血管新生との関係を調べた(図1)。まず、2つのレンチウイルスをパッケージ化し、Rluc/RFP(LV-RR)およびRluc/RFP/HSV-ttk(LV-RRT)を発現する遺伝子配列をそれぞれ運んだ7。次いで、LV-RRとLV-RRTをそれぞれトランスデュースすることにより、4T1-RRと4T1-RRTという2つの異?...

ディスカッション

このプロトコルでは、腫瘍の発達および血管新生をモニタリングするための非侵襲的二重BLIアプローチについて説明する。BLIレポーターシステムは、Rlucイメージングによって生体内の腫瘍進行および回帰を追跡するためのHSV-ttk/GCV自殺遺伝子を含む最初に開発されました。一方、腫瘍血管新生は、Flucイメージングを介してVegfr2-Fluc-KIマウスを用いて評価される。この腫瘍を持つマウスモデル?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA	Gibco	25200072
1.5 mL Tubes	Axygen Scientific	MCT-105-C-S
15 mL Tubes	Corning Glass Works	601052-50
293T	ATCC	CRL-3216
4T1	ATCC	CRL-2539
60 mm Dish	Corning Glass Works	430166
6-well Plate	Corning Glass Works	3516
Biosafety Cabinet	Shanghai Lishen Scientific	Hfsafe-900LC
Blasticidine S Hydrochloride (BSD)	Sigma-Aldrich	15205
Cell Counting Kit-8	MedChem Express	HY-K0301
CO2 Tegulated Incubator	Thermo Fisher Scientific	4111
Coelenterazine (CTZ)	NanoLight Technology	479474
D-luciferin Potassium Salt	Caliper Life Sciences	119222
DMEM Medium	Gibco	C11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS)	BIOIND	04-001-1A
Fluorescence Microscope	Nikon	Ti-E/U/S
Ganciclovir (GCV)	Sigma-Aldrich	Y0001129
Graphics Software	GraphPad Software	Graphpad Prism 6
Insulin Syringe Needles	Becton Dickinson	328421
Isoflurane	Baxter	691477H
Lentiviral Packaging System	Biosettia	cDNA-pLV03
Liposome	Invitrogen	11668019
Living Imaging Software	Caliper Life Sciences	Living Imaging Software 4.2
Living Imaging System	Caliper Life Sciences	IVIS Lumina II
MEM Medium	Invitrogen	31985-070
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning Glass Works	R21031399
Polybrene	Sigma-Aldrich	H9268-1G
RPMI1640 Medium	Gibco	C11875500BT
SORVALL ST 16R Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	Thermo Sorvall ST 16 ST16R
Ultra-low Temperature Refrigerator	Haier	DW-86L338
XGI-8 Gas Anesthesia System	XENOGEN Corporation	7293