Dual Biolumineszenz-Bildgebung der Tumorprogression und Angiogenese

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung eines tumortragenden Mausmodells zur Überwachung der Tumorprogression und Angiogenese in Echtzeit durch duale Biolumineszenz-Bildgebung.

Zusammenfassung

Die Angiogenese als entscheidender Prozess der Tumorprogression ist zu einem Forschungs-Hotspot und Ziel der Anti-Tumor-Therapie geworden. Es gibt jedoch kein zuverlässiges Modell, um Tumorprogression und Angiogenese gleichzeitig visuell und sensibel zu verfolgen. Die Biolumineszenz-Bildgebung zeigt ihre einzigartige Überlegenheit in der lebendigen Bildgebung aufgrund ihrer Vorteile hoher Empfindlichkeit, starker Spezifität und genauer Messung. Präsentiert hier ist ein Protokoll, um ein tumortragendes Mausmodell zu etablieren, indem eine Renilla-Luziferase-markierte murine Brustkrebs-Zelllinie 4T1 in die transgene Maus mit Angiogenese-induzierter Firefly-Luzifferase-Expression injiziert wird. Dieses Mausmodell bietet ein wertvolles Werkzeug, um die Tumorprogression und Angiogenese in Echtzeit durch duale Biolumineszenz-Bildgebung in einer einzigen Maus zu überwachen. Dieses Modell kann weit verbreitet in Anti-Tumor-Arzneimittel-Screening und Onkologie-Forschung angewendet werden.

Einleitung

Angiogenese ist ein wesentlicher Prozess bei der Progression von Krebs von kleinen, lokalisierten Neoplasmen zu größeren, potenziell metastasierenden Tumoren^1,2. Die Korrelation zwischen Tumorwachstum und Angiogenese wird zu einem der Schwerpunkte im Bereich der onkologischen Forschung. Herkömmliche Methoden zur Messung morphologischer Veränderungen können jedoch die Tumorprogression und Angiogenese bei lebenden Tieren nicht gleichzeitig mit einem visualisierten Ansatz überwachen.

Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) von Tumorzellen ist eine besonders geeignete experimentelle Methode zur Überwachung des Tumorwachstums aufgrund seiner Nicht-Invasivität, Empfindlichkeit und Spezifität^3,4,5,6 . Die BLI-Technologie basiert auf dem Prinzip, dass die Luziferase die Oxidation eines bestimmten Substrats katalysieren kann, während sie Diebiomineszenz aussendet. Die in implantierten Tumorzellen exprimierte Luziferase reagiert mit dem injizierten Substrat, das durch ein lebendiges Bildgebungssystem nachgewiesen werden kann, und Signale spiegeln indirekt die Veränderungen der Zellzahl oder Zelllokalisierung in vivo^6,7wider.

Abgesehen vom Tumorwachstum kann die Tumorangiogenese (der kritische Schritt in der Krebsprogression) auch durch BLI-Technologie mit Vegfr2-Fluc-KI transgenen Mäusen^8,9,10visualisiert werden. Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (Vegf) Rezeptor 2 (Vegfr2), eine Art Von Vegf-Rezeptor, wird meist in den vaskulären Endothelzellen von erwachsenen Mäusen¹¹exprimiert. Bei transgenen Vegfr2-Fluc-KI-Mäusen wird die DNA-Sequenz der Firefly-Luziferase (Fluc) in das erste Exon der endogenen Vegfr2-Sequenz geschlagen. Als Ergebnis wird der Fluc (der als BLI-Signale erscheint) in einer Weise ausgedrückt, die mit dem Niveau der Angiogenese bei Mäusen identisch ist. Um über ein paar Millimeter zu wachsen, rekrutiert der Tumor neue Gefäße aus bestehenden Blutgefäßen, die die durch Wachstumsfaktoren aus den Tumorzellen¹ausgelöste Vegfr2 stark ausdrücken. Dies eröffnet die Möglichkeit, vegfr2-Fluc-KI transgene Mäuse zu verwenden, um die Tumorangiogenese durch BLI nicht-invasiv zu überwachen.

In diesem Protokoll wird ein tumortragendes Mausmodell zur Überwachung der Tumorprogression und Angiogenese in einer einzigen Maus durch Firefly luciferase (Fluc) bzw. Renilla luciferase (Rluc) Bildgebung eingerichtet (Abbildung 1). Es entsteht eine 4T1-Zelllinie (4T1-RR), die Rluc und rotes fluoreszierendes Protein (RFP) stabil ausdrückt, um das Zellwachstum durch Rluc-Bildgebung zu verfolgen. Um die dynamischen Veränderungen der Angiogenese in der Progression und Regression des Tumors weiter zu untersuchen, wird eine weitere 4T1-Zelllinie (4T1-RRT) erstellt, die Selbstmord-Genherpes simplex-Virus abgeschnittene Thymidinkinase (HSV-ttk), Rluc und RFP ausdrückt. Durch die Verabreichung von Ganciclovir (GCV) werden die HSV-ttk-Exemitzellen selektiv ablated. Basierend auf diesen Zelllinien wird ein tumortragendes Modell in Vegfr2-Fluc-KI-Mäusen entwickelt, das als experimentelles Modell dient, das die Tumorprogression und Tumorangiogenese in vivo überbrückt.

Protokoll

Die Versuche müssen den nationalen und institutionellen Vorschriften über die Verwendung von Tieren zu Forschungszwecken entsprechen. Genehmigungen für die Durchführung von Experimenten müssen eingeholt werden. Die Behandlung von Tieren und die experimentellen Verfahren der Studie entsprechen den Richtlinien des Nankai University Animal Care and Use Committee, die den richtlinien für Tierpflege entsprechen, die von den National Institutes of Health (NIH) genehmigt wurden.

1. LV-Rluc-RFP (RR) und LV-Rluc-RFP-HSV-ttk (RRT) lentivirale Verpackung und Produktion

ANMERKUNG: Der pLV-RR trägt die Gensequenzen von Renilla luciferase (Rluc) und rotem fluoreszierendem Protein (RFP) unter dem Promotor EF1, während der pLV-RRT die Gensequenzen trägt, die Rluc, RFP und Herpes simplex virus abgeschnittene Thymidinkinase (HSV-ttk) ( Abbildung 2).

1. Samen 1 x 10⁶ von 293T Zellen pro Brunnen in eine 6 Wellplatte und Kultur über Nacht in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2 bei 37 °C mit Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum (FBS).
2. Bereiten Sie die Liposomensuspension vor: Mischen Sie 7,5 l Liposom und 0,25 ml minimales wesentliches Medium (MEM) in ein 1,5 ml Rohr nach inkubationszeit für 5 min bei Raumtemperatur (RT), um Liposomen gleichmäßig zu dispergieren.
3. Die DNAs-Lösung (DNAs-RR) vorbereiten: Fügen Sie den pLV-RR-Vektor und die Hilfsplasmide in einem 1,5 ml-Rohr, wie in Tabelle 1beschrieben, 0,25 ml MEM hinzu.
4. Erhalten Sie die Liposomen-/DNAs-RR-Verbindung: Fügen Sie die DNAs-RR-Lösung vorsichtig in vorbereitete Liposomensuspension Tropfen für Tropfen und inkubieren Sie für 20 min bei RT, so dass die DNA-Bindungen an die Lipidmembran.
5. Ersetzen Sie das Medium der 293T-Zellen durch 1 ml DMEM, das 10% FBS enthält, und fügen Sie die Liposomen-/DNAs-RR-Verbindung vorsichtig zum Medium der 293T-Zellen hinzu.
6. Nach der Inkubation in einem befeuchteten Inkubator mit 5%_CO2 bei 37 °C für 12–16 h, ersetzen Sie die Liposomen/DNAs-RR-Verbindung, die ein Medium der 293T-Zellen enthält, durch 1 ml DMEM mit 10% FBS und 100 U/ml Penicillin-Streptomycin.
7. Die 293T-Zellen im befeuchteten Inkubator nach der Transfektion 48 h weiter kultivieren. Dann sammeln Sie den Überstand der 293T-Zellen und zentrifugieren Sie das Medium bei 300 x g für 5 min, um die 293T-Zellen zu pellet. Den lentivirus-RR (LV-RR)-haltigen Überstand in 1,5 ml sterile Polypropylen-Lagerröhrchen geben und bei -80 °C lagern.
   HINWEIS: Für die Arbeit mit dem rekombinanten Lentivirus ist eine Anlage der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) erforderlich.
8. Wiederholen Sie die Schritte 1.1–1.7 und verwenden Sie pLV-RRT-Vektor anstelle des pLV-RR-Vektors in Schritt 1.3, um das Lentivirus-RRT (LV-RRT) zu erhalten. LV-RRT bei -80 °C lagern.
   HINWEIS: Der nicht gereinigte lentivirale Bestand kann in einigen Fällen das Zellwachstum hemmen. Lentivirale Bestände müssen möglicherweise gereinigt werden. Die lentiviralen Bestände, die LV-RR- oder LV-RRT-Partikel enthalten, sollten zur Lagerung in 1,5 ml-Rohre (1 ml pro Röhre) unterteilt werden, um mehrere Freitauzyklen zu vermeiden.

2. LV-RR und LV-RRT lentivirale Transduktion zur Genexpression in 4T1-Zellen

1. Samen 4T1-Zellen in eine 6-Well-Platte (5 x 10⁵ Zellen/well) und Kultur mit Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium mit 10% FBS über Nacht in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2 bei 37 °C.
2. Entfernen Sie das Medium von der Kulturplatte und ersetzen Sie es durch 1 ml frisches RPMI 1640 Medium sowie 1 ml Lentivirale Vorräte (LV-RR oder LV-RRT) an jedem Brunnen. Fügen Sie 8 g/ml Polybren hinzu und mischen Sie das Medium, das lentivirale Partikel enthält, sanft, indem Sie nach oben und unten pfeifen.
   HINWEIS: Bitte beachten Sie, dass das Medium lentivirale Partikel enthält, die menschliche Zellen transducieren könnten.
3. Spintransduktionslösung in einer Zentrifuge bei 1.000 g für 60 min bei RT zur Steigerung der Transduktionseffizienz. Nach der Zentrifugation 4T1-Zellen für 4–12 h kulturieren und in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2 bei 37 °C aufbewahren.
   HINWEIS: Für einige Zelllinien kann Polybren für die Langzeitkultur giftig sein. Daher kann die Inkubationszeit für die Transducing verschiedener Zellen änderbar sein. Überprüfen Sie den Zellenstatus mehrmals, um die geeignete Inkubationszeit zu finden.
4. Erfrischen Sie das Medium der transduzierten 4T1-Zellen mit 2 ml RPMI 1640 Medium, das 10% FBS und 100 U/ml Penicillin-Streptomycin enthält, um lentivirale Partikel und Polybren zu entfernen.

3. Arzneimittelscreening und Identifizierung von LV-RR- und LV-RRT-transduzierten 4T1-Zellen

1. Wählen Sie transduzierte Zellen mit Medium, das Blasticidin (BSD) enthält, gemäß dem BSD-Resistenzgen, das von LV-RR oder LV-RRT getragen wird, wie die folgenden Schritte beschrieben.
   HINWEIS: Alternativ könnten die transduzierten Zellen, die RFP-positiv sind, durch Durchflusszytometrie gemäß dem RFP-Gen ausgewählt werden, das von LV-RR oder LV-RRT getragen wird.
2. 48 h nach Transduktion Durchgang 4T1-Zellen im Verhältnis 1:3 zu 1:4 mit Selektionsmedium (RPMI 1640 medium mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin-Streptomycin und 5 g/ml BSD). Wechseln Sie das Medium alle 2 oder 3 Tage.
   HINWEIS: Die optimale BSD-Konzentration kann von Zelllinie zu Zelllinie variieren. Daher sollte ein Pilotversuch der Kill-Kurve durchgeführt werden, um die optimale Konzentration von BSD vor dem ersten Experiment zu bestimmen.
3. 7 Tage nach dem Arzneimittelscreening die LV-RR-transduzierten 4T1-Zellen (4T1-RR) und LV-RRT-transduzierte 4T1-Zellen (4T1-RRT) unter dem fluoreszenzinvertierten Phasenkontrastmikroskop. Zählen Sie die Anzahl der RFP⁺ 4T1-Zellen und aller 4T1-Zellen in drei Sichtfeldern, um das RFP-positive Verhältnis zu schätzen (Abbildung 2).
   HINWEIS: Alternativ könnte das RFP-positive Verhältnis der transducierten 4T1-Zellen durch Durchflusszytometrie identifiziert werden.
4. Messen Sie die Renilla-Signale von 4T1-RR-Zellen und 4T1-RRT-Zellen mit hilfe eines lebenden Bildgebungssystems, um die lineare Beziehung zwischen Zellzahlen und Renillasignalen zu erkennen (Abbildung 3).
5. Erweitern Sie BSD-geprüfte 4T1-RR- und 4T1-RRT-Zellen mit Selektionsmedium bei Split-Verhältnissen zwischen 1:3 und 1:4 und speichern Sie die Zelllinienbestände in flüssigem Stickstoff.

4. Vegfr2-Fluc-KI Mäuse und tumortragendes Mausmodell

HINWEIS: Die transgenen Vegfr2-Fluc-KI-Mäuse, 6-8 Wochen alt und weiblich, werden in diesem Experiment verwendet, um die Angiogenese in vivo von BLI nicht-invasiv zu überwachen.

1. Kultur 4T1-RR-Zellen und 4T1-RRT-Zellen in 60 mm Petrischalen in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2 bei 37 °C. Wenn die Zellen bei 80% Zusammenfluss sind, entfernen Sie das Medium und spülen Sie es mit Phosphatgepufferter Saline (PBS).
2. Entfernen Sie die PBS und fügen Sie eine zusätzliche 2 ml von 0,25% Trypsin-0,53 mM EDTA-Lösung bzw. hinzu. Halten Sie die Schale bei RT (oder bei 37 °C) auf, bis sich die Zellen lösen.
3. Fügen Sie 5–10 ml frisches Medium mit 10% FBS hinzu, dann aspirieren und abgeben Zellen, um 4T1-RR- und 4T1-RRT-Zellen in 15 ml Zentrifugenröhren zu suspendieren. Zählen Sie zwei Arten von 4T1-Zellen mit einer Zählkammer und bereiten Sie die Zellsuspensionen mit einer Konzentration von 1 x 10⁶ pro 100 l in RPMI 1640 medium vor.
4. Anästhetisieren Sie die Vegfr2-Fluc-KI-Mäuse mit 1%–3% Isofluran in 100% Sauerstoff in der Anästhesie-Induktionskammer mit einer Durchflussrate von 1 L/min. Überwachen Sie die Zehenpinch-Reaktion der Maus, um den Status der Anästhesie zu bestätigen. Dann wenden Sie ophthalmologische Salbe auf die Augen der Maus, um Austrocknung zu verhindern.
5. Entfernen Sie die Maus aus der Kammer und positionieren Sie sie in nosecone. Entfernen Sie das Haar der Schulter der Maus vollständig mit Elektrorasierer und Haarentfernungscreme, die eine gute Sicht auf das chirurgische Feld bieten könnte und vermeiden, die BLI-Signale in Folgeexperimenten zu blockieren.
6. Subkutan injizieren 4T1-RR-Zellen (1 x 10⁶ Zellen bei einem Gesamtvolumen von 100 L) und 4T1-RRT-Zellen (1 x 10⁶ Zellen bei einem Gesamtvolumen von 100 L) in die linke bzw. rechte Schulter jeder Maus (Aufnahme als Tag 0). Platzieren Sie Mäuse im Erholungsgebiet mit thermischer Unterstützung, bis sie vollständig geborgen sind.
7. Berühren Sie nach der Implantation von 4T1-RR- und 4T1-RRT-Zellen die Tumormassen, um zu überprüfen, ob die Mäuse jeden Tag tumortragend sind (Abbildung S1). Am Tag 7 nach der Implantation injiziert intraperitoneal 50 mg/kg Ganciclovir (GCV) zweimal täglich bis zum Ende des Experiments in die tumortragende Maus.
   HINWEIS: Vor diesem Experiment sollte das Zytotoxisch von GCV an 4T1-RRT-Zellen nachgewiesen werden. Die Tötungseffizienz von GCV konnte durch Zellzähltest mit unterschiedlicher GCV-Konzentration bewertet werden (Abbildung S2).
8. Am Tag 0, 3, 7, 14 und 21 nach der 4T1-Implantation überwachen Sie das Tumorwachstum und die Angiogenese tumortragender Mäuse und bewerten sie sowohl durch Rluc als auch durch Fluc-Bildgebung (Abbildung4).

5. Duale Biolumineszenz-Bildgebung von Tumor (Rluc) und Angiogenese (Fluc)

1. Öffnen Sie das lebende Bildgebungssystem, initialisieren Sie die lebende Bildgebungssoftware, und initialisieren Sie dann das System.
   HINWEIS: Die Systeminitialisierung dauert einige Minuten, um die aufgeladene Gerätekamera (CCD) auf -90 °C abzukühlen, bevor die Bildgebung beginnen kann. Die Temperatur wird grün, wenn die CCD-Kamera gekühlt wird.
2. Verwenden Sie die folgenden Kameraeinstellungen:
   Überprüfen Sie die Lumineszenz und Fotografie.
   Überprüfen Sie Überlagerung.
   Lumineszenzeinstellungen:
   Belichtungszeit setzt AUTO unter normalen Bedingungen.
   Binning setzt auf 8.
   F/Stop setzt auf 1.
   Emissionsfilter setzt Open.
   Fotoeinstellungen:
   Binning setzt auf Medium.
   F/Stop setzt auf 8.
   IVIS-Systemeinstellungen:
   Sichtfeld: C=1 Mausansicht, D=5-Mäuseansicht.
   Die Motivhöhe setzt 1,5 cm.
3. Wiegen und erfassen Sie die Mäuse und berechnen Sie das benötigte Volumen von Coelenterazin (CTZ; 2,5 mg/kg) und D-Luziferin (150 mg/kg).
4. Anästhetisieren Sie tumortragende Maus um 1%–3% Isofluran in 100% Sauerstoff in der Anästhesie-Induktionskammer mit einer Durchflussrate von 1 L/min. Überwachen Sie die Zehenpinch-Reaktion der Maus, um den Status der Anästhesie zu bestätigen. Geben Sie dann einen Tropfen Schmieraugensalbe auf beide Augen, um Hornhautschäden zu vermeiden.
5. Injizieren Sie 2,5 mg CTZ (3,33 mg/ml) pro Kilogramm Körpergewicht in die Retrobulbar der Maus (z. B. für eine 20 g Maus, injizieren Sie 15 l, um 50 g CTZ zu liefern) mit einer InsulinspritzeNadel.
6. Bewegen Sie die tumortragende Maus mit der Nase im Anästhesiekegel sanft in die Kamerakammer und erfassen Sie sofort mehrere Bilder des Maus-Dorsal, um die Rluc-Signale von 4T1-Zellen zu erhalten, bis die BLI-Signale verblassen.
   ANMERKUNG: Die Halbwertszeit von CTZ ist sehr kurz und die Signale von Rluc fallen süberschmisch um 30 s. Um sicherzustellen, dass sich jedes verbleibende Rluc-Signal aufgelöst hat und das Intervall zwischen Rluc und Fluc-Bildgebung mehr als 10 min betragen sollte.
7. Intraperitoneal injizieren 150 mg/kg D-Luciferin (30 mg/ml) mit einer Insulinspritze Nadel (z.B. für eine 20 g Maus, injizieren 100 l, um 3 mg D-Luciferin zu liefern). Halten Sie die Maus bei RT für 10 min vor Fluc-Bildgebung.
8. Bewegen Sie diese Maus wieder in die Kamerakammer mit ihrer Nase im Anästhesiekegel und erfassen Sie mehrere Bilder der Maus dorsal, um die Fluc-Signale von der Angiogenese zu erhalten.
   HINWEIS: Der kinetische Fluc-Monitor sollte für jede Maus durchgeführt werden, bis die Signale das Maximum erreichen und dann verblassen.
9. Wiederholen Sie die Prozedurschritte 5.4–5.8 für jede Maus.
10. Nach der Bildgebung die Mäuse in einer warmen Umgebung warten, bis die Tiere aufwachen.
11. Zum gewünschten Zeitpunkt (Tag 3, 7, 14 und 21) wiederholen Sie oben stehende Verfahren (Schritt 5.3–5.10), um die Tumorprogression und Tumorangiogenese im Laufe der Zeit zu erkennen.
12. Analysieren Sie die Rluc- und Fluc-Signale, um den Zusammenhang zwischen Tumorwachstum und Angiogenese bei der Tumorprogression zu untersuchen.
    HINWEIS: Die Regionen von Interesse (ROI), die die BLI-Signalstelle abdecken, werden zur Analyse der Daten verwendet. Messen Sie die Gesamtstrahlung (Photonen) des ROI in der Einheit photonen/sekunden/cm²/steradian (p/s/cm²/sr) für jeden Zeitpunkt.
13. Analysieren Sie die Rluc- und Fluc-Signale des ROI mithilfe von Grafiksoftware (Abbildung 4).

Ergebnisse

In diesem Experiment wurde ein Brustkrebs-Mausmodell mit 4T1-Zellen erstellt, um den Zusammenhang zwischen Tumorwachstum und Tumorangiogenese zu untersuchen (Abbildung 1). Zunächst wurden zwei Lentiviren verpackt, die Gensequenzen trugen, die Rluc/RFP (LV-RR) und Rluc/RFP/HSV-ttk (LV-RRT) exättierten, wie bereits berichtet⁷. Anschließend wurden zwei verschiedene 4T1-Zelllinien mit den Namen 4T1-RR und 4T1-RRT durch die Transducing L...

Diskussion

In diesem Protokoll wird ein nicht-invasiver dualer BLI-Ansatz zur Überwachung der Tumorentwicklung und Angiogenese beschrieben. Das BLI-Reportersystem wurde entwickelt und enthält das HSV-ttk/GCV-Selbstmordgen zur Verfolgung der Tumorprogression und Regression in vivo durch Rluc-Bildgebung. In der Zwischenzeit wird die Tumorangiogenese mit Vegfr2-Fluc-KI-Mäusen mittels Fluc-Bildgebung untersucht. Dieses tumortragende Mausmodell ist in der Lage, eine praktische Plattform für die kontinuierliche und nicht-invasive Tra...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA	Gibco	25200072
1.5 mL Tubes	Axygen Scientific	MCT-105-C-S
15 mL Tubes	Corning Glass Works	601052-50
293T	ATCC	CRL-3216
4T1	ATCC	CRL-2539
60 mm Dish	Corning Glass Works	430166
6-well Plate	Corning Glass Works	3516
Biosafety Cabinet	Shanghai Lishen Scientific	Hfsafe-900LC
Blasticidine S Hydrochloride (BSD)	Sigma-Aldrich	15205
Cell Counting Kit-8	MedChem Express	HY-K0301
CO2 Tegulated Incubator	Thermo Fisher Scientific	4111
Coelenterazine (CTZ)	NanoLight Technology	479474
D-luciferin Potassium Salt	Caliper Life Sciences	119222
DMEM Medium	Gibco	C11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS)	BIOIND	04-001-1A
Fluorescence Microscope	Nikon	Ti-E/U/S
Ganciclovir (GCV)	Sigma-Aldrich	Y0001129
Graphics Software	GraphPad Software	Graphpad Prism 6
Insulin Syringe Needles	Becton Dickinson	328421
Isoflurane	Baxter	691477H
Lentiviral Packaging System	Biosettia	cDNA-pLV03
Liposome	Invitrogen	11668019
Living Imaging Software	Caliper Life Sciences	Living Imaging Software 4.2
Living Imaging System	Caliper Life Sciences	IVIS Lumina II
MEM Medium	Invitrogen	31985-070
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning Glass Works	R21031399
Polybrene	Sigma-Aldrich	H9268-1G
RPMI1640 Medium	Gibco	C11875500BT
SORVALL ST 16R Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	Thermo Sorvall ST 16 ST16R
Ultra-low Temperature Refrigerator	Haier	DW-86L338
XGI-8 Gas Anesthesia System	XENOGEN Corporation	7293