Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، تم جمع دم الفار في وجود مضاد للتخثر. تم تنقيه الصفائح الدموية من قبل التدرج iohexol المتوسطة باستخدام طرد السرعة المنخفضة. الصفائح الدموية تم تفعيلها مع الفحص للتحقيق إذا كانت قابله للحياة تم تحليل نوعيه الصفائح الدموية المنقية من خلال تدفق الخلوي والمجهر.

Abstract

يتم تنقيه الصفائح الدموية من الدم كله لدراسة خصائصها الوظيفية ، والتي ينبغي ان تكون خاليه من خلايا الدم الحمراء (ار بي سي) ، وخلايا الدم البيضاء (مكافحه الحرائق) ، وبروتينات البلازما. ونحن وصف هنا تنقيه الصفائح الدموية من الدم الفار باستخدام ثلاثه اضعاف أكثر iohexol التدرج المتوسط نسبه إلى حجم عينه الدم وطرد في دوار دلو يتارجح في 400 x g لمده 20 دقيقه في 20 ° c. وكان الانتعاش/الغلة من الصفائح الدموية المنقية 18.2-38.5 ٪ ، والصفائح الدموية المنقية كانت في حاله راحة ، والتي لم تحتوي علي اي عدد كبير من ار بي سي ومكافحه الحرائق. وأظهرت الصفائح الدموية المنقية المعالجة مع القدرة علي التنشيط بنسبه 93% ، مما يشير إلى جدواها. وأكدنا ان الصفائح الدموية المنقية نقيه بما فيه الكفاية باستخدام تدفق الخلوي والتقييم المجهري. يمكن استخدام هذه الصفائح الدموية للتعبير عن الجينات ، والتنشيط ، والإفراج عن الحبيبية ، والتجميع ، واختبارات التصاق. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتنقيه الصفائح الدموية من الدم من الأنواع الأخرى ، وكذلك.

Introduction

الصفائح الدموية هي أحد مكونات الدم التي تعمل كبادئ لتخثر الدم ردا علي الضرر في الاوعيه الدموية. انهم يتجمعون في موقع الاصابه لسد جدار السفينة1. الصفائح الدموية هي أجزاء من الخلايا الخلوية المشتقة من البويضات الضخمة لنخاع العظم تحت تاثير الجلطات وتدخل الدورة الدموية2. وتعتبر انها نشطه ايضيه وقادره علي استشعار البيئة خارج الخلية عن طريق تنشيط السلاسل الترددية الإشارات داخل الخلايا التي تؤدي إلى انتشار الصفائح الدموية ، والتراكم ، والأرقاء تشكيل المكونات1،3. إلى جانب الأرقاء/تخثر والتئام الجروح4, الصفائح الدموية تلعب دورا هاما في الاستجاباتالتهابيه المضيف, تولد الاوعيه, و ميتاستاتيس3,5,6,7, 8-الآن

يتم تنقيه الصفائح الدموية من الدم لدراسة خصائصها البيوكيميائية والفسيولوجية ، والتي ينبغي ان تكون خاليه من مكونات الدم الأخرى. منذ خلايا الدم الحمراء (ار بي سي) وخلايا الدم البيضاء (الكريات الحمر) تحتوي علي أكثر بكثير من الحمض الريبي النيبالي والبروتينات من الصفائح الدموية9,10, وجود حتى عدد قليل من هذه الخلايا يمكن ان تتداخل مع التحليلات الناسخة والبروتينية من rna والبروتينات المشتقة من الصفائح الدموية. وجدنا ان الصفائح الدموية المنقية المنشطة مع الأجسام المضادة الربط ، مثل مكافحه GPIIb/IIIa (جون/ا) ومكافحه P-سيلكتين أكثر كفاءه من الصفائح الدموية الكاملة.

وبما ان الصفائح الدموية هشه ، فمن المهم معالجه العينات بأقل ما يمكن. إذا تم تنشيط الصفائح الدموية ، فانها تطلق محتوياتها الحبيبية وتتحلل في نهاية المطاف. لذلك ، للحفاظ علي خصائص الصفائح الدموية الوظيفية سليمه ، من المهم الحفاظ علي الصفيحات الدموية اثناء العزلة. وقد وصفت عده بروتوكولات عزل الصفائح الدموية من الإنسان, الكلبة, الفئران, والرئيسيات غير البشرية بطرق مختلفه1,10,11,12. بعض الطرق تتطلب خطوات متعددة مثل جمع البلازما الغنية بالصفائح الدموية عن طريق الطرد ، والترشيح عن طريق عمود الفصل ، والاختيار السلبي من الصفائح الدموية مع الأجسام المضادة الخاصة بي بي ار-ومكافحه حرائق الآبار مترافق إلى الخرز المغناطيسي ، وهلم جرا ، وهي تستغرق وقتا طويلا وقد تتحلل الصفائح الدموية ومحتوياتها.

ووصف فورد وزملاءه تنقيه الصفائح الدموية من الدم البشري باستخدام iohexol المتوسطة11. يستخدم هذا الأسلوب كميه مماثله من عينه الدم والمتوسطة اثناء تنقيه. وبما ان البشر ينتجون كميه أكبر من الدم ، فمن السهل نسبيا تنقيه الصفائح الدموية.

Iohexol هو التدرج الكثافة العالمية الخاملة المتوسطة القابلة للذوبان بحريه في الماء والمستخدمة في تجزئه الأحماض النووية والبروتينات والسكريات ، والبروتينات النونويه13،14. فقد منخفضه الصبغة وغير سامه ، مما يجعلها وسيله مثاليه لتنقيه الخلايا الحية السليمة11. وهو وسيله غير الجسيمات; ولذلك ، يمكن تحديد توزيع الخلايا في التدرج باستخدام مقياس الكريات الدموية ، وتدفق الخلوي ، أو مقياس الطيف الطيفي. وهو لا يتداخل مع معظم التفاعل الانزيمي أو الكيميائي للخلايا أو الشظايا الخلوية بعد التخفيف.

الفاره بمثابه نموذج الحيوانية الهامه للعديد من الامراض البشرية15،16،17،18. هناك عدد قليل من المقالات المنشورة التي تصف تنقيه الصفائح الدموية الماوس19,20. ومع ذلك ، ينتج الماوس حجما أصغر نسبيا من الدم ، مما يجعل من الصعب تنقيه الصفائح الدموية. إذا تم استخدام نفس الحجم الصغير من التدرج المتوسط وعينات الدم ، لا يمكن فصل طبقه الصفائح الدموية بشكل واضح من طبقه ار بي سي-الكريات البيضاء بعد طرد. في هذه المقالة ، وصفنا طريقه سريعة وبسيطه لتنقيه الصفائح الدموية الماوس مع ثلاثه اضعاف أكثر iohexol التدرج المتوسطة بالنسبة لحجم عينه الدم وانخفاض سرعه طرد. قمنا أيضا بتنشيط الصفائح الدموية المنقية مع الفحص والتحقيق في جودتها مع التدفق الخلوي والمجهر.

Protocol

وينبغي اجراء جمع الدم الماوس مع الرعاية المؤسسية المناسبة الحيوانية والموافقة علي لجنه الاستخدام.

ملاحظه: يتم وصف بروتوكول تنقيه الصفائح الدموية في رسم تخطيطي للتدفق في الشكل 1.

1. جمع الدم

  1. أضافه 25 μL من 3.2 ٪ سيترات الصوديوم (pH 7.2) كمضاد للتخثر و 0.4 mM من بشكل جلي-برو-الأرجنتين-Pro (GPRP) في أنبوب البولي بروبيلين.
  2. جمع ما يقرب من 200 μL من الدم من الماوس C57BL/6 باستخدام الرجعية المدارية النزيف.
    ملاحظه:     يمكن جمع الدم من اي نوع من سلاله الماوس بغض الانتباه عن العمر أو الجنس.
    1. استخدام 2 مل من ايزوفلوراني في اي نوع من الغرفة لتخدير الماوس.
      ملاحظه: يتم فحص عمق التخدير عن طريق علامات زيادة التنفس وانخفاض الحركة. يجب ان الماوس لا تستجيب لحركه غرفه التخدير ، أو ليتم التعامل معها. إذا كان الماوس يستجيب للحركة أو المناولة ، فانه يتطلب المزيد من الوقت للحفاظ علي غرفه التخدير.
    2. 1-2-2 فتح اما الجفن الأيمن أو الأيسر من الماوس وادراج 7.5 سم (0.12 سم قطر) أنبوب الشعرية في الضفيرة الوعائية للعين.
    3. تويست أنبوب الشعرية نصف بدوره في حين تطبيق الضغط علي أنبوب الشعرية لكسر الاوعيه وبدء تدفق الدم. عقد الحيوانية راسا علي عقب علي قنينة جمع ليتم ملؤها عن طريق العمل الشعرية.
    4. بمجرد ان يتم جمع الحجم المناسب من الدم ، وأزاله أنبوب الشعرية وإغلاق العين عن طريق تطبيق ضغط خفيف لمده 30 ثانيه علي الجفن مع الشاش. مره واحده يتم إيقاف النزيف ، وأعاده الماوس إلى قفصها ورصد لنزيف.
    5. فحص العينين للصدمة 1-2 أيام بعد النزيف المداري الرجعية. أزاله اي الماوس من الدراسة تظهر علامات صدمه كبيره للعين نتيجة لهذا الاجراء و موت ببطء.
      ملاحظه: يجب ان الماوس لا تخضع لأي نوع من العلاج الذي يمكن ان تمنع الصفائح الدموية لمده أسبوعين علي الأقل قبل جمع الدم. يجب استخدام عينه الدم لتنقيه الصفائح الدموية في غضون ساعة واحده من نزيف الماوس.

2. تنقيه الصفائح الدموية

ملاحظه: وينبغي اجراء تنقيه الصفائح الدموية في درجه حرارة الغرفة لمنع تدهورها. تاكد من ان درجه حرارة الكواشف والاداات بين 18 إلى 22 درجه مئوية. لمنع تدهور الصفائح الدموية ، يجب تجنب التغليف السريع والاهتزاز القوي اثناء العملية.

  1. أضافه 600 μL من التدرج iohexol المتوسطة (12 ٪ مسحوق iohexol في 0.85 ٪ كلوريد الصوديوم ، 5 مم Tricine ، pH 7.2)11 في أنبوب 1.5 mL.
  2. أضافه 200 μL من عينه الدم ببطء أسفل الجانب من الأنبوب علي راس متوسط التدرج مع طرف ماصه واسعه تتحمل بحيث الدم و iohexol المتوسطة لا تخلط (الشكل 2A).
  3. الطرد المركزي العينة التي تحتوي علي أنبوب في 400 x g لمده 20 دقيقه في 20 °c في دوار دلو يتارجح مع تسارع بطيء والتباطؤ.
  4. جمع معظم الطبقات الغنية بالصفائح الدموية وجزء صغير من طبقه الصفائح الدموية الفقيرة (إجمالي 300 إلى 400 μL) باستخدام طرف ماصه واسعه التجويف دون إزعاج طبقات ار بي سي ومكافحه الحرائق (الشكل 2 ب). نقل عينه الصفائح الدموية إلى أنبوب جديد.
    ملاحظه: إذا كان عدد الصفائح الدموية اقل في الدم أو يتم استخدام حجم أصغر من الدم ، يمكن ان ينظر إلى طبقه الصفائح الدموية الغنية وطبقه الصفيحات الفقيرة علي انها طبقه واحده.
  5. أضافه 1 مل من تلفزيوني إلى عينه الصفائح الدموية ، ومزيج من قبل عكس ، والطرد المركزي في 800 x g لمده 10 دقيقه في 20 درجه مئوية في دوار دلو يتارجح. تجاهل الحل تماما وأضافه 200 μL من تلفزيوني لأعاده تعليق الصفائح الدموية مع الأنابيب الخفيفة.
    ملاحظه: هذه الخطوة اختياريه ، لأنها تزيل بروتينات البلازما المتوسطة واللونية وتزيد من حساسية الصفائح الدموية لناهضات مثل الصفيحة. بما ان أجهزه الطرد المركزي المختلفة لديها برامج مختلفه ، يمكن تحديد التسارع/التباطؤ البطيء عن طريق قراءه دليل المستخدم لجهاز الطرد المركزي.
  6. نقل 30 μL من هذه العينة إلى أنبوب جديد لحساب الصفائح الدموية. ويمكن استخدام الصفائح الدموية المتبقية لاختبارات الكيمياء الحيوية والفسيولوجية مثل تنشيط الصفائح الدموية ، والتجميع ، والإفراج الحبيبية ، الخ.
  7. لاستخراج الحمض الريبي النيبالي أو البروتين ، والطرد المركزي عينه الصفائح الدموية في 800 x g ل 10 دقيقه لبيليه الصفائح الدموية. تجاهل سوبرناتانت تماما دون إزعاج بيليه. أضافه الحجم المطلوب من RNA أو البروتين تحلل العازلة لlyse الصفائح الدموية.

3. عد الصفائح الدموية

  1. عد خلايا الدم بأكملها دون تخفيف وتنقيه الصفائح الدموية (المخفف 2 إلى 5 اضعاف مع تلفزيوني) باستخدام محلل الخلايا الألى. استخدام العينات من 30 إلى 50 μL للعد.
  2. احسب العدد الإجمالي لصفائح الصفيح بالضرب بحجم العينة.
  3. حساب النسبة المئوية لغله/استعاده الصفائح الدموية المنقية.
  4. حساب ار بي سي والكريات البيضاء في عينه الصفائح الدموية المنقية (المخفف 50 إلى 100-اضعاف مع التلفزيونية) مع المجهر.

4. تنشيط الصفائح الدموية

  1. في أنبوب ، أضافه 1 إلى 2,000,000 الصفائح الدموية المنقية في ما يصل إلى 100 μL من تلطيخ العازلة (تلفزيوني مع 2 ٪ الجنين البقري المصل ، الدم).
  2. لعدد متعدد من العينات ، وجعل مزيج رئيسي من الأجسام المضادة مع 1 μL (0.5 ملغ/مل) من التالي: PE-Cy7 الفئران المضادة للماوس TER 119 ، PE الفئران المضادة للماوس CD45 ، FITC الفئران المضادة للماوس CD41 ، والفئران APC المضادة للماوس/CD62P الإنسان الصفائح الدموية المنشطة ، علي التوالي. أضافه المزيج الرئيسي إلى أنابيب لتلطيخ الخلايا. لا تقم باضافه البعد.
  3. في أنبوب آخر ، أضافه 1 إلى 2,000,000 من الصفائح الدموية المنقية في ما يصل إلى 100 μL من تلطيخ العازلة ، و 0.4 mM GPRP الببتيد. أضافه الانسجه لتنشيط الصفائح الدموية ووصمه عار الخلايا التالية الخطوة 4.2.
    ملاحظه: يجب أضافه GPRP إلى العينة قبل أضافه الشكل لمنع التراكم أو التجلط من خلال تنشيط الصفائح الدموية. يجب تحسين تركيز الصفيحة للحصول علي تنشيط جيد لصفائح الصفيح. بعد تنشيط الصفائح الدموية ، يتم تقليل عدد الاحداث اثناء الحصول علي العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي.
  4. كعنصر تحكم إيجابي ، أضافه 1 μL من الدم كله في ما يصل إلى 100 μL العازلة تلطيخ في أنبوب و 0.4 mM GPRP الببتيد. أضافه الشكل لتنشيط الصفائح الدموية. كعنصر تحكم سلبي ، أضافه 1 μL من الدم كله في ما يصل إلى 100 μL من تلطيخ العازلة. لا تقم باضافه الشكل في عينه التحكم السلبية. وصمه عار الخلايا التالية الخطوة 4.2.
  5. للتحكم في النمط الخلوي التدفق ، تسميه 5 أنابيب مع غير ملون ، PE-Cy7 ، PE ، FITC ، و APC. أضافه 100 μL من تلطيخ العازلة ، 1 μL من الدم ، و 1 μL من الأجسام المضادة لكل منها إلى أنابيب المسمي لوصمه عار الخلايا.
  6. احتضان عينات لوصمه عار لمده 30 دقيقه في درجه حرارة الغرفة في الظلام.
  7. غسل العينات عن طريق أضافه 1 مل من تلطيخ العازلة لكل أنبوب. الطرد المركزي في 800 x g لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة. تجاهل العازلة تلطيخ بعناية دون التخلي عن بيليه.
  8. أضافه 300 μL من تلطيخ العازلة لكل أنبوب ، مزيج اقل ما يقال ، ونقل إلى أنبوب FACS. خزن العينات الملونة في الظلام حتى يتم تحليلها باستخدام مقياس التدفق الخلوي.

5. تحليل تدفق الخلوي الصفائح الدموية

  1. إنشاء تجربه جديده وتوليد سجل مبعثر مقابل الجانب سجل مبعثر المؤامرات نقطه وتعيين بوابات ل Ter119 PE-Cy7 (ربك) ، CD45 PE (الكريات البيضاء) ، CD41 FITC (الصفائح الدموية) ، و CD62P APC (الصفائح الدموية المنشطة) السكان وفقا لاستراتيجية النابضة المختارة لل تجربه في برنامج المغنية FACS.
    1. افتح التسلسل الهرمي للسكان عن طريق اختيار إظهار التسلسل الهرمي للسكان ضمن علامة التبويب السكان. تحرير التسلسل الهرمي للسكان عن طريق التحقق من استراتيجية النابضة وأعاده تسميه البوابات بشكل صحيح.
    2. افتح طريقه عرض الإحصائيات عن طريق اختيار إنشاء عرض إحصائيات. تحرير عرض الإحصائيات وفقا لتفضيلات المستخدم بالنقر بزر الأيمن فوق عرض الإحصاءات وتحديد تحرير عرضالإحصاءات.
    3. اختيار لون لكل بوابه التي تعزز الجانب البصري للتخطيط عن طريق النقر المزدوج علي مربع المقابلة للسكان.
  2. في نافذه المضخم الخلوي ، انقر علي علامة التبويب المعلمات وضبط الفولتية للمعلمات لتصور السكان من الفائدة علي المؤامرات.
  3. ضبط الفولتية لكل من المعلمات بحيث يمكن تمييز السكان السلبية من السكان الايجابيه. قبل تسجيل العينات لمراقبه التعويض ، تاكد من ان الضوابط الايجابيه ذات الصبغة الواحدة علي النطاق (تاكد من ان القمم الموجبة مرئية وليست بعيده إلى اليمين).
    ملاحظه: إذا كانت القمم الايجابيه خارج النطاق ، ينبغي تعديل الفولتية لرؤية السكان الإيجابيين.
  4. تسجيل الخلايا الملونة أحاديه اللون لعناصر التحكم في التعويض (غير ملون ، PE-Cy7 ، PE ، FITC ، APC).
  5. إذا لم يتم اعداد بوابات التحكم الايجابيه بشكل صحيح ، فاضبطها عن طريق تغيير الفولتية.
  6. انتقل إلى التجربة ≫ اعداد التعويض ≫ حساب التعويض. اختر تطبيق فقط في النافذة الناتجة.
  7. قم بالتبديل إلى ورقه العمل العمومية بالنقر فوق زر التبديل في الأعلى ، يسار اطار ورقه العمل.
  8. تحميل عينه التحكم الايجابيه والحصول علي ما يكفي من الخلايا لضبط التعويض والبوابات.
  9. تحميل العينة مره أخرى والتحقق من ان كل مؤامرة يظهر السكان الخلية المتوقعة استنادا إلى الأجسام المضادة الملونة الفلوروكروم. الحصول علي وتسجيل 100,000 الاحداث لعينات الدم الكامل و 10,000 الاحداث الصفائح الدموية المنقية. تحميل العينات واحدا تلو الآخر حتى يكتمل الاستحواذ.
  10. تحليل بيانات التدفق الخلوي مع البرنامج مع المؤامرات والبوابات المناسبة (الشكل 3)

النتائج

يتم وصف ملخص تنقيه الصفائح الدموية في رسم تخطيطي للتدفق (الشكل 1). وتشمل الخطوات جمع الدم من الماوس باستخدام الرجعية المدارية النزيف في وجود مضاد للتخثر ، أضافه عينه من الدم علي التدرج iohexol ، طرد في دوار دلو يتارجح في 400 x g لمده 20 دقيقه في 20 درجه مئوية. تم تقييم جوده الصفائ...

Discussion

عاده ، يتم عزل الصفائح الدموية بواسطة طرد منخفضه السرعة التي تعطي البلازما الغنية بالصفائح الدموية التي تحتوي علي عدد كبير من خلايا الدم ، والحطام الخلوي ، وبروتينات البلازما التي يمكن ان تتداخل مع الاختبارات البيوكيميائية والفسيولوجية والاحتياجات بعيده تنقيه21. ولذلك ، من ?...

Disclosures

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا العمل من خلال التمويل الاولي لمؤسسه سينسيناتي لبحوث الأطفال ومنحه جامعه سينسيناتي التجريبية الانتقالية إلى محمد ناظم ونود ان نشكر الدراسات الخلوية في مستشفي الأطفال سينسيناتي لتدفق البحوث الاساسيه لخدماتهم.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin)Thermoscientific17-0626-82Platelets activation marker
Eppendorf tubeFisher Scientific14-222-166Tube for centifuge
FACS DIVA softwareBD BiosciencesNon-catalog itemAnalysis of platelets and whole blood
FACS tubeFisher Scientific352008Tubes for flow cytomtery
Fetal bovine serum (FBS)Invitrogen26140079Ingredient for staining buffer
FITC rat anti-mouse CD41BD Biosciences553848Platelets marker
Flow cytometerBD BiosciencesNon-catalog itemAnalysis of platelets and whole blood
FlowJo softwareFlowJo, Inc.Non-catalog itemAnalysis of platelets and whole blood
Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)EMD Millipore03-34-0001Prevent platelet clot formation
Hematocrit Capillary tubeFisher Scientific22-362566Blood collection capillary tube
HemavetDrew ScientificNon-catalog itemBlood cell analyzer
HemocytometerHausser Scientific3100Cell counting chamber
IsofluraneBaxter1001936040Use to Anesthetize mouse
Microscope (Olympus CKX41)OlympusNon-catalog itemCell monitoring and counting
Nycodenz (Histodenz)Sigma-AldrichD2158Gradient medium
PE rat anti-mouse CD45BD Biosciences561087WBC marker
PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119BD Biosciences557853RBC marker
Pipet tips 200 µL, wide-boreThermoFisher Scientific21-236-1ATransferring blood and platelet samples
Pipet tips 1000 µL, wide-boreThermoFisher Scientific21-236-2CTransferring blood and platelet samples
Phosphate buffured saline (PBS)ThermoFisher Scientific14040-117Buffer for washing and dilution
Sodium chlorideSigma-AldrichS7653Physiological saline
Sodium citrateFisher Scientific02-688-26Anti-coagulant
Staining bufferIn-houseNon-catalog itemWash and dilution buffer
Steile waterIn-houseNon-catalog itemSolvent
Table top centrifugeThermoFisher Scientific75253839/433607Swinging bucket rotor centrifuge
ThrombinEnzyme Research LaboratotyHT 1002aPlatelet activation agonist
TricineSigma-AldrichT0377Buffer for Nycodenz medium

References

  1. de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Insights into platelet-based control of coagulation. Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).
  2. Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E. Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: a review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation. British Journal of Haematology. 165 (2), 227-236 (2014).
  3. Weyrich, A. S., Zimmerman, G. A. Platelets: signaling cells in the immune continuum. Trends in Immunology. 25 (9), 489-495 (2004).
  4. Nami, N., et al. Crosstalk between platelets and PBMC: New evidence in wound healing. Platelets. 27 (2), 143-148 (2016).
  5. Mancuso, M. E., Santagostino, E. Platelets: much more than bricks in a breached wall. British Journal of Haematology. 178 (2), 209-219 (2017).
  6. Hampton, T. Platelets' Role in Adaptive Immunity May Contribute to Sepsis and Shock. Journals of the American Medical Association. 319 (13), 1311-1312 (2018).
  7. Sabrkhany, S., Griffioen, A. W., Oude Egbrink, M. G. The role of blood platelets in tumor angiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1815 (2), 189-196 (2011).
  8. Menter, D. G., et al. Platelet "first responders" in wound response, cancer, and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 36 (2), 199-213 (2017).
  9. Fink, L., et al. Characterization of platelet-specific mRNA by real-time PCR after laser-assisted microdissection. Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 749-756 (2003).
  10. Trichler, S. A., Bulla, S. C., Thomason, J., Lunsford, K. V., Bulla, C. Ultra-pure platelet isolation from canine whole blood. BioMed Central Veterinary Research. 9, 144 (2013).
  11. Ford, T. C., Graham, J., Rickwood, D. A new, rapid, one-step method for the isolation of platelets from human blood. Clinica Chimica Acta. 192 (2), 115-119 (1990).
  12. Noisakran, S., et al. Infection of bone marrow cells by dengue virus in vivo. Experimental Hematolology. 40 (3), 250-259 (2012).
  13. Rickwood, D., Ford, T., Graham, J. Nycodenz: a new nonionic iodinated gradient medium. Analytical Biochemistry. 123 (1), 23-31 (1982).
  14. Graham, J. M., Ford, T., Rickwood, D. Isolation of the major subcellular organelles from mouse liver using Nycodenz gradients without the use of an ultracentrifuge. Analytical Biochemistry. 187 (2), 318-323 (1990).
  15. Milligan, G. N., et al. A lethal model of disseminated dengue virus type 1 infection in AG129 mice. Journal of General Virology. 98 (10), 2507-2519 (2017).
  16. Strassel, C., et al. Lentiviral gene rescue of a Bernard-Soulier mouse model to study platelet glycoprotein Ibbeta function. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (7), 1470-1479 (2016).
  17. Bergmeier, W., Boulaftali, Y. Adoptive transfer method to study platelet function in mouse models of disease. Thrombosis Research. 133, S3-S5 (2014).
  18. Bakchoul, T., et al. Recommendations for the use of the non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model in autoimmune and drug-induced thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (5), 872-875 (2015).
  19. Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide. Platelets. , 1-10 (2018).
  20. Jirouskova, M., Shet, A. S., Johnson, G. J. A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), 661-669 (2007).
  21. Birschmann, I., et al. Use of functional highly purified human platelets for the identification of new proteins of the IPP signaling pathway. Thrombosis Research. 122 (1), 59-68 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

147Iohexol

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved