Purificação de plaquetas de sangue de rato

Resumo

Aqui, o sangue do rato foi coletado na presença de um anticoagulante. As plaquetas foram purificadas por meio de gradiente iohexol utilizando centrifugação de baixa velocidade. As plaquetas foram ativadas com trombina para investigar se eram viáveis. A qualidade das plaquetas purificadas foi analisada por citometria de fluxo e microscopia.

Resumo

As plaquetas são purificadas de sangue total para estudar as suas propriedades funcionais, que devem estar livres de glóbulos vermelhos (RBC), glóbulos brancos (WBC) e proteínas plasmáticas. Nós descrevemos aqui a purificação das plaquetas do sangue do rato usando o meio do inclinação Three-Fold mais iohexol relativo ao volume e à centrifugação da amostra de sangue em um rotor balançando da cubeta em 400 x g por 20 minutos em 20 ° c. A recuperação/rendimento das plaquetas purificadas foi de 18,2-38,5%, e as plaquetas purificadas encontravam-se em estado de repouso, o que não continha nenhum número significativo de RBC e WBC. As plaquetas purificadas tratadas com trombina apresentaram até 93% de ativação, indicando sua viabilidade. Nós confirmamos que as plaqueta purified são suficientemente puras usando a avaliação cytometric e microscópica do fluxo. Estas plaquetas podem ser usadas para a expressão gênica, ativação, liberação de grânulos, agregação e ensaios de aderência. Este método pode ser usado para a purificação de plaquetas do sangue de outras espécies também.

Introdução

As plaquetas são um componente do sangue que funciona como um iniciador de coagulação do sangue em resposta a danos no vaso sanguíneo. Eles se reúnem no local da lesão para ligar a parede do vaso¹. As plaquetas são fragmentos de anucleato de citoplasma derivados dos megacariócitos da medula óssea a influência da Trombopoietina e entram na circulação². Eles são considerados metabolicamente ativos e capazes de detectar o ambiente extracelular ativando cascatas de sinalização intracelular que resultam em espalhamento de plaquetas, agregação e formação de plugue hemostático^1,3. Além de hemostasia/trombose e cicatrização de feridas⁴, as plaquetas desempenham um papel importante nas respostas inflamatórias hospedeiras, angiogênese e metastatis^3,5,6,7^, o ⁸.

As plaquetas são purificadas do sangue para estudar as suas propriedades bioquímicas e fisiológicas, que devem ser livres de outros componentes sanguíneos. Desde que os glóbulos vermelhos (RBC) e glóbulos brancos (WBC) contêm significativamente mais RNA e proteínas do que as plaquetas^9,10, a presença de mesmo um pequeno número destas células pode interferir com a análise transcriptômicos e proteômica de RNA e proteínas derivadas de plaquetas. Nós encontramos que as plaqueta purified ativaram com o anticorpo da ligação da trombina tal como o anti-GPIIb/IIIa (JON/A) e o anti-P-Selectin mais eficientemente do que plaquetas de sangue inteiras.

Uma vez que as plaquetas são frágeis, é importante tratar as amostras o mais suavemente possível. Se as plaquetas forem ativadas, elas liberam o conteúdo do grânulo e, em última análise, degradam. Portanto, para manter as propriedades funcionais das plaquetas intactas, é importante manter a quiescência plaquetária durante o isolamento. Vários protocolos descreveram o isolamento de plaquetas de humanos, cães, ratos e primatas não humanos por vários métodos^1,10,^11,12. Alguns dos métodos requerem várias etapas como a coleta de plasma rico em plaquetas por centrifugação, filtração por coluna de separação, seleção negativa de plaquetas com RBC-e anticorpo específico para WBC conjugado com grânulos magnéticos, e assim por diante, que são consome muito tempo e pode degradar as plaquetas e o seu conteúdo.

Ford e seus colegas descreveram a purificação da plaqueta do sangue humano usando o meio do iohexol¹¹. Este método utiliza um volume semelhante de amostra de sangue e meio durante a purificação. Uma vez que os seres humanos produzem um maior volume de sangue, é relativamente fácil de purificar as plaquetas.

O iohexol é um meio inerte de gradiente de densidade universal que é livremente solúvel em água e utilizado no fracionamento de ácidos nucleicos, proteínas, polissacarídeos e nucleoproteínas^13,14. Tem baixa osmolaridade e é não-tóxico, tornando-se assim um meio ideal para a purificação de células vivas intactas¹¹. É um meio não particulado; Conseqüentemente, a distribuição das pilhas em um inclinação pode ser determinada usando o Hemocytometer, o cytometer do fluxo, ou o Espectrofotômetro. Não interfere com a maioria da reação enzimática ou química das células ou fragmentos celulares após a diluição.

O rato serve como um modelo animal importante para muitas doenças humanas^15,16, 17,18. Há alguns artigos publicados que descrevem a purificação de plaquetas de camundongo^19,20. No entanto, o mouse produz um volume relativamente menor de sangue, o que torna difícil para purificar as plaquetas. Se o mesmo pequeno volume de meio de gradiente e amostras de sangue é usado, a camada plaquetária não pode ser claramente separada da camada de RBC-WBC após a centrifugação. Neste artigo, nós descrevemos um método rápido e simples da purificação da plaqueta do rato com o meio do inclinação do iohexol do três-dobra mais relativo ao volume da amostra de sangue e à centrifugação de baixa velocidade. Também ativamos as plaquetas purificadas com trombina e investimos sua qualidade com citometria de fluxo e microscopia.

Protocolo

A coleta de sangue do rato deve ser conduzida com o cuidado animal institucional apropriado e aprovação do Comitê do uso.

Nota: O protocolo de purificação plaquetária é descrito em um diagrama de fluxo na Figura 1.

1. coleta de sangue

1. Adicionar 25 μL de 3,2% de citrato de sódio (pH 7,2) como anticoagulante e 0,4 mM de Gly-pro-ARG-pro (GPRP) num tubo de polipropileno.
2. Colete aproximadamente 200 μL de sangue do mouse C57BL/6 usando sangramento retro-orbital.
   Nota: o sangue pode ser coletado de qualquer tipo de estirpe do rato independentemente da idade ou sexo.
   1. Utilize 2 mL de isoflurano em qualquer tipo de câmara para anestesiar o rato.
      Nota: A profundidade da anestesia é verificada por sinais de respiração aumentada e diminuição do movimento. O rato não deve responder ao movimento da câmara de anestesia, ou a ser manuseado. Se o rato é responsivo ao movimento ou à manipulação, a seguir exige mais tempo para manter-se na câmara da anestesia.
   2. 1.2.2 Abra a pálpebra direita ou esquerda do mouse e insira um tubo capilar de 7,5 cm (0,12 cm de diâmetro) no plexo vascular do olho.
   3. Gire o tubo capilar uma meia volta ao aplicar a pressão ao tubo capilar para quebrar os vasos e iniciar o fluxo sanguíneo. Segure o animal de cabeça para baixo sobre o frasco de coleta para ser preenchido por ação capilar.
   4. Uma vez que o volume de sangue apropriado é coletado, retire o tubo capilar e feche o olho aplicando a pressão suave para 30 s na pálpebra com gaze. Uma vez que o sangramento é interrompido, retorne o mouse para sua gaiola e monitor de sangramento.
   5. Verific os olhos para o traumatismo 1-2 dias após o sangramento retro-orbital. Retire qualquer rato do estudo mostrando sinais de trauma significativo para o olho, como resultado do procedimento e eutanizar.
      Nota: O rato não deve sofrer qualquer tipo de tratamento que possa inibir as plaquetas durante pelo menos duas semanas antes da recolha de sangue. A amostra de sangue deve ser usada para a purificação da plaqueta dentro de uma hora de sangrar o rato.

2. purificação de plaquetas

Nota: A purificação da plaqueta deve ser realizada à temperatura ambiente para evitar a sua degradação. Certifique-se de que a temperatura dos reagentes e dos instrumentos está entre 18 a 22 ° c. Para evitar a degradação plaquetária, a pipetagem rápida e a agitação vigorosa devem ser evitadas durante o procedimento.

1. Adicionar 600 μL de meio de gradiente iohexol (12% de iohexol em pó em 0,85% de cloreto de sódio, 5 mM de tricina, pH 7,2)¹¹ em um tubo de 1,5 ml.
2. Adicionar 200 μL de amostra de sangue lentamente no lado do tubo na parte superior do meio de gradiente com uma ponta de pipeta de furo largo para que o sangue e o meio de iohexol não se misturem (Figura 2a).
3. Centrifugue a amostra que contém o tubo em 400 x g por 20 min a 20 ° c em um rotor de balde oscilante com aceleração lenta e desaceleração.
4. Colete a maior parte da camada rica em plaquetas e uma pequena fração de camada pobre em plaquetas (total de 300 a 400 μL) usando uma ponta de pipeta de furo largo sem perturbar as camadas de RBC e WBC (Figura 2b). Transfira a amostra de plaquetas para um novo tubo.
   Nota: Se a contagem de plaquetas for menor no sangue ou se for utilizado um volume menor de sangue, a camada rica em plaquetas e a camada pobre em plaquetas podem ser vistas como uma única camada.
5. Adicionar 1 mL de PBS à amostra de plaquetas, misturar invertendo e centrifugar a 800 x g durante 10 min a 20 ° c num rotor de balde oscilante. Elimine a solução completamente e adicione 200 μL de PBS para suspender as plaquetas com pipetagem ligeira.
   Nota: Esta etapa é opcional, pois remove o gradiente médio e as proteínas plasmáticas e aumenta a sensibilidade das plaquetas aos agonistas, como a trombina. Desde que as centrífugas diferentes têm programas diferentes, a aceleração/desaceleração lentas podem ser determinadas lendo o manual do usuário do centrifugador.
6. Transfira 30 μL desta amostra para um novo tubo para contar as plaquetas. As plaquetas restantes podem ser usadas para ensaios bioquímicos e fisiológicos, como Ativação plaquetária, agregação, liberação de grânulos, etc.
7. Para o RNA ou a extração da proteína, centrifugue a amostra da plaqueta em 800 x g por 10 minutos para pellet as plaquetas. Descarte o sobrenadante completamente sem perturbar o pellet. Adicione o volume desejado de RNA ou tampão de lise de proteína para lyse as plaquetas.

3. contando as plaquetas

1. Contar todas as células sanguíneas sem diluição e plaquetas purificadas (diluídas de 2 a 5 vezes com PBS) utilizando um analisador automatizado de células. Use 30 a 50 μL de amostras para contagem.
2. Calcule o número total de plaquetas multiplicando pelo volume da amostra.
3. Calcule a percentagem de rendimento/recuperação de plaquetas purificadas.
4. Contar o RBC e WBC na amostra de plaquetas purificada (diluído 50 a 100 vezes com PBS) com um hemocitômetro e microscópio.

4. Ativação plaquetária

1. Em um tubo, adicione 1 a 2 milhões plaquetas purificadas em até 100 μL de tampão de coloração (PBS com 2% de soro bovino fetal, FBS).
2. Para o número múltiplo de amostras, faça uma mistura mestra de anticorpos com 1 μL (0,5 mg/mL) do seguinte: PE-Cy7 rato anti-rato TER 119, PE rato CD45, FITC rato anti-rato CD41, e APC rato anti-rato/humano CD62P (P-Selectin) para detectar RBC, WBC, plaquetas, e plaquetas ativadas, respetivamente. Adicione a mistura mestra aos tubos para manchar as pilhas. Não adicione trombina.
3. Em outro tubo, adicione 1 a 2 milhões de plaquetas purificadas em até 100 μL de tampão de coloração e peptídeo de 0,4 mM GPRP. Adicionar trombina para ativar as plaquetas e manchar as células seguintes passo 4,2.
   Nota: GPRP deve ser adicionado à amostra antes de adicionar trombina para evitar a formação de agregados ou coágulos através da ativação plaquetária. A concentração de trombina deve ser otimizada para obter boa ativação de plaquetas. Após a ativação plaquetária, contagens de eventos são diminuídas durante a aquisição de amostras por citometria de fluxo.
4. Como um controle positivo, adicionar 1 μL de sangue total em até 100 μL de tampão de coloração em um tubo e 0,4 mM peptídeo GPRP. Adicionar trombina para ativar as plaquetas. Como controlo negativo, adicione 1 μL de sangue total em até 100 μL de tampão de coloração. Não adicione trombina na amostra de controle negativo. Manchar as células seguintes passo 4,2.
5. Para controle de isotipo de citometria de fluxo, rótulo 5 tubos com não manchado, PE-Cy7, PE, FITC e APC. Adicionar 100 μL de tampão de coloração, 1 μL de sangue e 1 μL do respectivo anticorpo aos tubos rotulados para manchar as células.
6. Incubar amostras para manchar por 30 min em temperatura ambiente no escuro.
7. Lave as amostras adicionando 1 mL de tampão de coloração a cada tubo. Centrifugue a 800 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Descarte o tampão de coloração com cuidado sem desalojar o pellet.
8. Adicionar 300 μL de tampão de coloração a cada tubo, misturar suavemente e transferir para um tubo FACS. Armazene as amostras manchadas no escuro até que sejam analisadas com um citometro de fluxo.

5. análises de citometria de fluxo de plaquetas

1. Criar um novo experimento e gerar log Forward Scatter versus log Side dispersão de pontos e atribuir portões para Ter119 PE-Cy7 (RBC), CD45 PE (WBC), CD41 FITC (plaquetas) e CD62P APC (plaquetas ativadas) populações de acordo com a estratégia de gating escolhida para o experiência no software FACS DIVA.
   1. Abra a hierarquia de população escolhendo Mostrar hierarquia de população na guia populações . Edite a hierarquia populacional verificando a estratégia de gating e renomeando corretamente as portas.
   2. Abra a exibição de estatísticas escolhendo criar exibição de estatísticas. Edite a exibição de estatísticas de acordo com as preferências do usuário clicando com o botão direito na exibição de estatísticas e selecionando Editar exibição de estatísticas.
   3. Escolha uma cor para cada portão que aprimore o aspecto visual do layout clicando duas vezes na caixa correspondente à população.
2. Na janela do Citometro , clique na guia parâmetros e ajuste as tensões para parâmetros para visualizar a população de interesse nas parcelas.
3. Ajuste as tensões para cada um dos parâmetros para que a população negativa possa ser distinguida da população positiva. Antes de gravar as amostras para o controlo de compensação, verifique se os controlos positivos com uma única mancha estão em escala (certifique-se de que os picos positivos são visíveis e não demasiado distantes para a direita).
   Nota: Se os picos positivos estão fora de escala, as tensões devem ser ajustadas para ver as populações positivas.
4. Registre as células manchadas de cor única para controles de compensação (sem manchas, PE-Cy7, PE, FITC e APC).
5. Se as portas de controle positivo não estiverem configuradas corretamente, ajuste-as alterando as tensões.
6. Vá para experimento ≫ configuração de remuneração ≫ calcular compensação. Escolha aplicar somente na janela resultante.
7. Alterne para a planilha global clicando no botão de alternância na parte superior, à esquerda da janela da planilha.
8. Carregar a amostra de controle positivo e adquirir células suficientes para ajustar a compensação e as portas.
9. Carregue a amostra novamente e verifique se cada parcela mostra a população de células esperada com base no anticorpo manchado de fluorocromo. Adquira e registre 100.000 eventos para amostras de sangue total e 10.000 eventos para plaquetas purificadas. Carregue as amostras uma a uma até que a aquisição seja concluída.
10. Analise os dados de citometria de fluxo com o software com parcelas e portões apropriados (Figura 3)

Resultados

O resumo da purificação plaquetária é descrito em um diagrama de fluxo (Figura 1). As etapas incluem a coleção do sangue do rato usando o sangramento retro-orbital na presença de um anticoagulante, adição da amostra de sangue no meio do inclinação do iohexol, centrifugação em um rotor balançando da cubeta em 400 x g por 20 minutos em 20 ° c. A qualidade das plaquetas purificadas foi avaliada com microscopia e citometria de fluxo após coloração com anticorpo para de...

Discussão

Comumente, as plaquetas são isoladas por centrifugação de baixa velocidade que produz plasma rico em plaquetas que contém um número significativo de células sanguíneas, detritos celulares e proteínas plasmáticas que podem interferir com os ensaios e necessidades bioquímicas e fisiológicas purificação mais adicional²¹. Portanto, é importante usar um método rápido e simples que pode produzir plaquetas puras sem grandes contaminantes. O protocolo aqui apresentado descreve a purificaç...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin)	Thermoscientific	17-0626-82	Platelets activation marker
Eppendorf tube	Fisher Scientific	14-222-166	Tube for centifuge
FACS DIVA software	BD Biosciences	Non-catalog item	Analysis of platelets and whole blood
FACS tube	Fisher Scientific	352008	Tubes for flow cytomtery
Fetal bovine serum (FBS)	Invitrogen	26140079	Ingredient for staining buffer
FITC rat anti-mouse CD41	BD Biosciences	553848	Platelets marker
Flow cytometer	BD Biosciences	Non-catalog item	Analysis of platelets and whole blood
FlowJo software	FlowJo, Inc.	Non-catalog item	Analysis of platelets and whole blood
Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)	EMD Millipore	03-34-0001	Prevent platelet clot formation
Hematocrit Capillary tube	Fisher Scientific	22-362566	Blood collection capillary tube
Hemavet	Drew Scientific	Non-catalog item	Blood cell analyzer
Hemocytometer	Hausser Scientific	3100	Cell counting chamber
Isoflurane	Baxter	1001936040	Use to Anesthetize mouse
Microscope (Olympus CKX41)	Olympus	Non-catalog item	Cell monitoring and counting
Nycodenz (Histodenz)	Sigma-Aldrich	D2158	Gradient medium
PE rat anti-mouse CD45	BD Biosciences	561087	WBC marker
PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119	BD Biosciences	557853	RBC marker
Pipet tips 200 µL, wide-bore	ThermoFisher Scientific	21-236-1A	Transferring blood and platelet samples
Pipet tips 1000 µL, wide-bore	ThermoFisher Scientific	21-236-2C	Transferring blood and platelet samples
Phosphate buffured saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	14040-117	Buffer for washing and dilution
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Physiological saline
Sodium citrate	Fisher Scientific	02-688-26	Anti-coagulant
Staining buffer	In-house	Non-catalog item	Wash and dilution buffer
Steile water	In-house	Non-catalog item	Solvent
Table top centrifuge	ThermoFisher Scientific	75253839/433607	Swinging bucket rotor centrifuge
Thrombin	Enzyme Research Laboratoty	HT 1002a	Platelet activation agonist
Tricine	Sigma-Aldrich	T0377	Buffer for Nycodenz medium