Purification des plaquettes du sang de souris

Résumé

Ici, le sang de la souris a été recueilli en présence d’un anti-coagulant. Les plaquettes ont été purifiées par le milieu gradient Iohexol en utilisant une centrifugation à faible vitesse. Les plaquettes ont été activées avec la thrombine pour enquêter si elles étaient viables. La qualité des plaquettes purifiées a été analysée par cytométrie en flux et microscopie.

Résumé

Les plaquettes sont purifiées du sang entier pour étudier leurs propriétés fonctionnelles, qui doivent être exemptes de globules rouges (RBC), de globules blancs (WBC) et de protéines plasmatiques. Nous décrivons ici la purification des plaquettes du sang de souris en utilisant trois fois plus de milieu de gradient d’Iohexol par rapport au volume d’échantillon sanguin et la centrifugation dans un rotor de godet oscillant à 400 x g pendant 20 min à 20 ° c. La récupération/rendement des plaquettes purifiées était de 18,2-38,5%, et les plaquettes purifiées étaient dans un état de repos, ce qui ne contenait aucun nombre significatif de RBC et de WBC. Les plaquettes purifiées traitées avec la thrombine ont montré une activation jusqu’à 93%, ce qui indique leur viabilité. Nous avons confirmé que les plaquettes purifiées sont suffisamment pures en utilisant l’évaluation cytométrique et microscopique du flux. Ces plaquettes peuvent être utilisées pour l’expression génique, l’activation, la libération de granule, l’agrégation et les essais d’adhérence. Cette méthode peut être utilisée pour la purification des plaquettes du sang d’autres espèces ainsi.

Introduction

Les plaquettes sont un composant du sang qui fonctionne comme un initiateur de la coagulation sanguine en réponse aux dommages dans le vaisseau sanguin. Ils se réunissent sur le site de blessure pour brancher la paroi du navire¹. Les plaquettes sont des fragments anucléés de cytoplasme dérivés des mégakaryocytes de la moelle osseuse sous l’influence de la thrombopoïétine et entrent dans la circulation². Ils sont considérés comme métaboliquement actifs et capables de détecter l’environnement extracellulaire en activant des cascades de signalisation intracellulaires qui entraînent une propagation plaquettaire, une agrégation et une formation de prise hémostatique^1,3. Outre l’hémostase/thrombose et la guérison des plaies⁴, les plaquettes jouent un rôle important dans les réponses inflammatoires de l’hôte, l’angiogenèse et les métastatis^3,5,6,^7, le ⁸.

Les plaquettes sont purifiées du sang pour étudier leurs propriétés biochimiques et physiologiques, qui doivent être exemptes d’autres composants sanguins. Puisque les globules rouges (RBC) et les globules blancs (WBC) contiennent significativement plus d’ARN et de protéines que les plaquettes^9,10, la présence même d’un petit nombre de ces cellules peut interférer avec les analyses transcriptomiques et protéomiques de l’ARN protéines dérivées de plaquettes. Nous avons constaté que les plaquettes purifiées activées avec l’anticorps de grippage de thrombine tels que l’anti-GPIIb/IIIa (JON/A) et l’anti-P-selectin plus efficacement que les plaquettes sanguines entières.

Étant donné que les plaquettes sont fragiles, il est important de traiter les échantillons aussi légèrement que possible. Si les plaquettes sont activées, elles libèrent leur contenu de granule et finissent par se dégrader. Par conséquent, pour conserver les propriétés fonctionnelles des plaquettes intactes, il est important de maintenir la quiescence plaquettaire pendant l’isolement. Plusieurs protocoles ont décrit l’isolement des plaquettes de l’homme, du chien, du rat et du primat non humain par diverses méthodes^1,10,11,12. Certaines méthodes requièrent plusieurs étapes telles que la collecte de plasma riche en plaquettes par centrifugation, la filtration par colonne de séparation, la sélection négative de plaquettes avec des anticorps spécifiques de RBC et de WBC conjugués à des billes magnétiques, et ainsi de suite, qui sont temps et peut dégrader les plaquettes et leur contenu.

Ford et ses collègues ont décrit la purification plaquettaire du sang humain en utilisant l’Iohexol Medium¹¹. Cette méthode utilise un volume similaire d’échantillon sanguin et de milieu pendant la purification. Étant donné que les humains produisent un plus grand volume de sang, il est relativement facile de purifier les plaquettes.

L’Iohexol est un milieu inerte à gradient de densité universel qui est librement soluble dans l’eau et utilisé dans la fractionnation des acides nucléiques, des protéines, des polysaccharides et des nucléoprotéines^13,14. Il a une faible osmolalité et est non-toxique, ce qui en fait un milieu idéal pour la purification des cellules vivantes intactes¹¹. Il s’agit d’un milieu non particulaire; par conséquent, la distribution des cellules dans un gradient peut être déterminée à l’aide d’un hémocytomètre, d’un cytomètre de flux ou d’un spectrophotomètre. Il n’interfère pas avec la plupart des réactions enzymatiques ou chimiques des cellules ou des fragments cellulaires après dilution.

La souris sert de modèle animal important pour de nombreuses maladies humaines^15,16,^17,18. Il y a quelques articles publiés qui décrivent la purification des plaquettes de souris^19,20. Cependant, la souris donne un volume de sang relativement plus faible, ce qui rend difficile la purification des plaquettes. Si le même petit volume de milieu de gradient et d’échantillons sanguins est utilisé, la couche plaquettaire ne peut pas être clairement séparée de la couche RBC-WBC après centrifugation. Dans cet article, nous avons décrit une méthode rapide et simple de purification plaquettaire de souris avec trois fois plus de milieu de gradient d’Iohexol par rapport au volume d’échantillon sanguin et à la centrifugation à faible vitesse. Nous avons également activé les plaquettes purifiées avec la thrombine et étudié leur qualité avec la cytométrie en flux et la microscopie.

Protocole

La collecte de sang de souris doit être effectuée avec les soins institutionnels appropriés et l’approbation du Comité d’utilisation.

Remarque: Le protocole de purification plaquettaire est décrit dans un diagramme de flux de la figure 1.

1. prélèvement de sang

1. Ajouter 25 μL de citrate de sodium à 3,2% (pH 7,2) en tant qu’anti-coagulant et 0,4 mM de Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) dans un tube en polypropylène.
2. Prélever environ 200 μL de sang de la souris C57BL/6 à l’aide d’un saignement rétroorbital.
   Remarque: le sang peut être recueilli à partir de n’importe quel type de souche de souris indépendamment de l’âge ou du sexe.
   1. Utiliser 2 mL d’isoflurane dans n’importe quel type de chambre pour anesthésier la souris.
      Remarque: La profondeur de l’anesthésie est vérifiée par des signes d’augmentation de la respiration et une diminution du mouvement. La souris ne doit pas répondre au mouvement de la chambre d’anesthésie, ou à être manipulé. Si la souris est sensible au mouvement ou à la manipulation, alors il faut plus de temps pour garder dans la chambre d’anesthésie.
   2. 1.2.2 Ouvrez la paupière droite ou gauche de la souris et insérez un tube capillaire de 7,5 cm (0,12 cm de diamètre) dans le plexus vasculaire de l’œil.
   3. Tournez le tube capillaire d’un demi-tour tout en appliquant la pression sur le tube capillaire pour briser les vaisseaux et initier le flux sanguin. Tenez l’animal à l’envers au-dessus du flacon de prélèvement à remplir par capillarité.
   4. Une fois que le volume approprié de sang est recueilli, retirez le tube capillaire et fermez l’œil en appliquant une légère pression pendant 30 s sur la paupière avec de la gaze. Une fois que le saignement est arrêté, retournez la souris à sa cage et surveillez le saignement.
   5. Vérifiez les yeux pour un traumatisme 1-2 jours après un saignement rétroorbital. Retirez toute souris de l’étude montrant des signes de traumatisme significatif à l’œil à la suite de la procédure et l’euthanasier.
      Remarque: La souris ne doit subir aucun type de traitement qui peut inhiber les plaquettes pendant au moins deux semaines avant la collecte du sang. L’échantillon sanguin doit être utilisé pour la purification plaquettaire dans une heure de saignement de la souris.

2. purification plaquettaire

Remarque: La purification plaquettaire doit être effectuée à température ambiante pour prévenir leur dégradation. Assurez-vous que la température des réactifs et des instruments se trouve entre 18 et 22 ° c. Pour prévenir la dégradation plaquettaire, le pipetage rapide et le tremblement vigoureux doivent être évités pendant la procédure.

1. Ajouter 600 μL de milieu gradient d’Iohexol (12% de poudre d’Iohexol dans 0,85% de chlorure de sodium, 5 mM de tricine, pH 7,2)¹¹ dans un tube de 1,5 ml.
2. Ajouter 200 μL d’échantillon sanguin lentement sur le côté du tube au-dessus du milieu dégradé avec une pointe de pipette de large alésage de sorte que le sang et le milieu Iohexol ne se mélangent pas (figure 2a).
3. Centrifuger l’échantillon contenant le tube à 400 x g pendant 20 min à 20 ° c dans un rotor à godet oscillant avec accélération lente et décélération.
4. Recueillir la majeure partie de la couche riche en plaquettes et une petite fraction de la couche pauvre en plaquettes (total 300 à 400 μL) à l’aide d’une pointe de pipette à large alésage sans perturber les couches de RBC et de WBC (figure 2b). Transférer l’échantillon plaquettaire dans un nouveau tube.
   Remarque: Si la numération plaquettaire est moins importante dans le sang ou si un plus petit volume de sang est utilisé, la couche riche en plaquettes et la couche pauvre en plaquettes peuvent être considérées comme une seule couche.
5. Ajouter 1 mL de PBS à l’échantillon de plaquettes, mélanger en l’invertant et centrifuger à 800 x g pendant 10 min à 20 ° c dans un rotor à godet oscillant. Jetez complètement la solution et ajoutez 200 μL de PBS pour Resuspendre les plaquettes avec un pipetage doux.
   Remarque: Cette étape est facultative, car elle élimine le milieu dégradé et les protéines plasmatiques et augmente la sensibilité des plaquettes aux agonistes tels que la thrombine. Puisque différentes centrifugeuses ont des programmes différents, l’accélération lente/décélération peut être déterminée en lisant le manuel de l’utilisateur de la centrifugeuse.
6. Transférer 30 μL de cet échantillon dans un nouveau tube pour compter les plaquettes. Les plaquettes restantes peuvent être utilisées pour des dosages biochimiques et physiologiques tels que l’activation plaquettaire, l’agrégation, la libération de granule, etc.
7. Pour l’extraction d’ARN ou de protéine, Centrifugez l’échantillon de plaquettes à 800 x g pendant 10 min pour pellets les plaquettes. Jetez le surnageant complètement sans déranger le culot. Ajouter le volume désiré de tampon d’ARN ou de protéine lyse pour lyser les plaquettes.

3. comptage des plaquettes

1. Comptez les cellules sanguines entières sans dilution ni plaquettes purifiées (diluées de 2 à 5 fois avec le PBS) à l’aide d’un analyseur de cellules automatisé. Utiliser 30 à 50 μL d’échantillons pour le comptage.
2. Calculez le nombre total de plaquettes en multipliant par le volume de l’échantillon.
3. Calculez le pourcentage de rendement/récupération des plaquettes purifiées.
4. Compter le RBC et le WBC dans l’échantillon de plaquettes purifiés (dilué 50 à 100 fois avec le PBS) avec un hémocytomètre et un microscope.

4. activation plaquettaire

1. Dans un tube, ajouter 1 à 2 millions plaquettes purifiées dans jusqu’à 100 μL de tampon de coloration (PBS avec 2% de sérum bovin fœtal, FBS).
2. Pour un nombre multiple d’échantillons, faire un mélange principal d’anticorps avec 1 μL (0,5 mg/mL) de ce qui suit: PE-Cy7 rat anti-souris TER 119, PE rat anti-souris CD45, FITC rat anti-souris CD41, et APC rat anti-souris/Human CD62P (P-selectin) pour détecter RBC, WBC, plaquettes, et plaquettes activées, respectivement. Ajouter le mélange principal aux tubes pour la coloration des cellules. Ne pas ajouter de thrombine.
3. Dans un autre tube, ajouter 1 à 2 millions de plaquettes purifiées dans jusqu’à 100 μL de tampon de coloration et 0,4 mM de peptide GPRP. Ajouter la thrombine pour activer les plaquettes et tacher les cellules après l’étape 4,2.
   Remarque: Le GPRP doit être ajouté à l’échantillon avant d’ajouter la thrombine pour empêcher la formation d’agrégats ou de caillots par activation plaquettaire. La concentration de thrombine doit être optimisée pour obtenir une bonne activation des plaquettes. Après l’activation plaquettaire, le nombre d’événements est diminué lors de l’acquisition d’échantillons par cytométrie en flux.
4. En tant que témoin positif, ajouter 1 μL de sang total dans jusqu’à 100 μL de tampon de coloration dans un tube et un peptide GPRP de 0,4 mM. Ajouter la thrombine pour activer les plaquettes. En tant que contrôle négatif, ajouter 1 μL de sang total dans jusqu’à 100 μL de tampon de coloration. N’ajoutez pas de thrombine dans l’échantillon de contrôle négatif. Tacher les cellules après l’étape 4,2.
5. Pour le contrôle de l’isotype de cytométrie en flux, l’étiquette 5 tubes avec non teinté, PE-Cy7, PE, FITC, et APC. Ajouter 100 μL de tampon de coloration, 1 μL de sang et 1 μL de l’anticorps respectif aux tubes étiquetés pour colorer les cellules.
6. Incuber les échantillons à la tache pendant 30 min à la température ambiante dans l’obscurité.
7. Lavez les échantillons en ajoutant 1 mL de tampon de coloration à chaque tube. Centrifuger à 800 x g pendant 5 min à température ambiante. Jetez soigneusement le tampon de coloration sans déloger le pellet.
8. Ajouter 300 μL de tampon de coloration à chaque tube, mélanger légèrement et transférer dans un tube FACS. Stockez les échantillons colorés dans l’obscurité jusqu’à ce qu’ils soient analysés avec un cytomètre de flux.

5. analyse de la cytométrie en flux des plaquettes

1. Créez une nouvelle expérience et générez des diagrammes de dispersion vers l’avant du journal par rapport aux nuages de points et affectez des portails pour Ter119 PE-Cy7 (RBC), CD45 PE (WBC), CD41 FITC (plaquettes) et CD62P APC (plaquettes activées) selon la stratégie de blocage choisie pour le expérience dans le logiciel FACS DIVA.
   1. Ouvrez la hiérarchie de population en choisissant afficher la hiérarchie de population sous l’onglet populations . modifiez la hiérarchie de population en vérifiant la stratégie de blocage et en renommant correctement les portails.
   2. Ouvrez la vue statistiques en choisissant créer une vue statistiques. Modifiez la vue des statistiques en fonction des préférences de l’utilisateur en cliquant avec le bouton droit sur la vue statistiques et en sélectionnant modifier la vue statistiques.
   3. Choisissez une couleur pour chaque porte qui améliore l’aspect visuel de la mise en page en double-cliquant sur la case correspondant à la population.
2. Dans la fenêtre du cytomètre , cliquez sur l’onglet paramètres et ajustez les tensions pour les paramètres pour visualiser la population d’intérêt sur les parcelles.
3. Ajustez les tensions pour chacun des paramètres de sorte que la population négative puisse être distinguée de la population positive. Avant d’enregistrer les échantillons pour le contrôle de compensation, vérifiez que les contrôles positifs à une seule teinte sont à l’échelle (Assurez-vous que les pics positifs sont visibles et pas trop loin vers la droite).
   Remarque: Si les pics positifs sont hors échelle, les tensions doivent être ajustées pour voir les populations positives.
4. Enregistrez les cellules colorées en une seule couleur pour les contrôles de compensation (non colorées, PE-Cy7, PE, FITC et APC).
5. Si les grilles de commande positives ne sont pas correctement paramétrés, réglez-les en changeant de tension.
6. Accédez à expérience ≫ paramétrage de la rémunération ≫ calculer la rémunération. Choisissez appliquer uniquement dans la fenêtre résultante.
7. Basculez vers la feuille de calcul globale en cliquant sur le bouton bascule dans le haut, à gauche de la fenêtre de la feuille de calcul.
8. Chargez l’échantillon de contrôle positif et acquérez suffisamment de cellules pour ajuster la compensation et les barrières.
9. Chargez l’échantillon à nouveau et vérifiez que chaque parcelle montre la population de cellules attendue en fonction de l’anticorps teinté fluorochrome. Acquérir et enregistrer 100 000 événements pour des échantillons de sang total et 10 000 événements pour les plaquettes purifiées. Chargez les échantillons un par un jusqu’à ce que l’acquisition soit terminée.
10. Analysez les données de cytométrie de flux avec le logiciel avec des tracés et des portails appropriés (figure 3)

Résultats

Le résumé de la purification plaquettaire est décrit dans un diagramme de flux (figure 1). Les étapes comprennent la collecte de sang de la souris en utilisant des saignements rétroorbitaux en présence d’un anticoagulant, addition d’échantillon sanguin sur le milieu gradient Iohexol, centrifugation dans un rotor de godet oscillant à 400 x g pendant 20 min à 20 ° c. La qualité des plaquettes purifiées a été évaluée avec la microscopie et la cytométrie en flux apr...

Discussion

Communément, les plaquettes sont isolées par centrifugation à basse vitesse qui donne un plasma riche en plaquettes qui contient un nombre significatif de cellules sanguines, de débris cellulaires et de protéines plasmatiques qui peuvent interférer avec les essais biochimiques et physiologiques et les besoins purification ultérieure²¹. Par conséquent, il est important d’utiliser une méthode rapide et simple qui peut produire des plaquettes pures sans contaminants majeurs. Le protocole p...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin)	Thermoscientific	17-0626-82	Platelets activation marker
Eppendorf tube	Fisher Scientific	14-222-166	Tube for centifuge
FACS DIVA software	BD Biosciences	Non-catalog item	Analysis of platelets and whole blood
FACS tube	Fisher Scientific	352008	Tubes for flow cytomtery
Fetal bovine serum (FBS)	Invitrogen	26140079	Ingredient for staining buffer
FITC rat anti-mouse CD41	BD Biosciences	553848	Platelets marker
Flow cytometer	BD Biosciences	Non-catalog item	Analysis of platelets and whole blood
FlowJo software	FlowJo, Inc.	Non-catalog item	Analysis of platelets and whole blood
Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)	EMD Millipore	03-34-0001	Prevent platelet clot formation
Hematocrit Capillary tube	Fisher Scientific	22-362566	Blood collection capillary tube
Hemavet	Drew Scientific	Non-catalog item	Blood cell analyzer
Hemocytometer	Hausser Scientific	3100	Cell counting chamber
Isoflurane	Baxter	1001936040	Use to Anesthetize mouse
Microscope (Olympus CKX41)	Olympus	Non-catalog item	Cell monitoring and counting
Nycodenz (Histodenz)	Sigma-Aldrich	D2158	Gradient medium
PE rat anti-mouse CD45	BD Biosciences	561087	WBC marker
PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119	BD Biosciences	557853	RBC marker
Pipet tips 200 µL, wide-bore	ThermoFisher Scientific	21-236-1A	Transferring blood and platelet samples
Pipet tips 1000 µL, wide-bore	ThermoFisher Scientific	21-236-2C	Transferring blood and platelet samples
Phosphate buffured saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	14040-117	Buffer for washing and dilution
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Physiological saline
Sodium citrate	Fisher Scientific	02-688-26	Anti-coagulant
Staining buffer	In-house	Non-catalog item	Wash and dilution buffer
Steile water	In-house	Non-catalog item	Solvent
Table top centrifuge	ThermoFisher Scientific	75253839/433607	Swinging bucket rotor centrifuge
Thrombin	Enzyme Research Laboratoty	HT 1002a	Platelet activation agonist
Tricine	Sigma-Aldrich	T0377	Buffer for Nycodenz medium