Reinigung von Plateletten aus dem Mausblut

Zusammenfassung

Hier wurde in Anwesenheit eines Antikoagulanten Mausblut gesammelt. Die Blutplättchen wurden mit einer niedrigen Drehzahlenzentrifugation durch Iohexol-Gradientenmedium gereinigt. Die Blutplättchen wurden mit Thrombin aktiviert, um zu untersuchen, ob sie lebensfähig sind. Die Qualität der gereinigten Blutplättchen wurde durch Strömungszytometrie und Mikroskopie analysiert.

Zusammenfassung

Die Plateletten werden von Vollblut gereinigt, um ihre funktionellen Eigenschaften zu untersuchen, die frei sein sollten von roten Blutkörperchen (RBC), weißen Blutkörperchen (WBC) und Plasma-Proteinen. Wir beschreiben hier die Reinigung von Blutplättchen aus dem Mausblut mit dem Dreifach mehr Iohexol-Gradientenmittel im Verhältnis zum Blutprobenvolumen und der Zentrifugation in einem schwingenden Eimer-Rotor bei 400 x g für 20 min bei 20 ° C. Die Erträge der gereinigten Blutungen lagen bei 18,2-38,5%, und die gereinigten Blutplättchen befanden sich in einem ruhenden Zustand, der keine nennenswerte Anzahl von RBC und WBC enthielt. Die gereinigten Blutplättchen, die mit Thrombin behandelt wurden, zeigten bis zu 93% Aktivierung, was auf ihre Lebensfähigkeit hinweist. Wir haben bestätigt, dass die gereinigten Blutplättchen mit Hilfe von Strömungszytometrie und mikroskopischer Auswertung ausreichend rein sind. Diese Blutplättchen können für die Genexpression, Aktivierung, Granulatfreigabe, Aggregation und Haftungsanalysen verwendet werden. Diese Methode kann zur Reinigung von Blutplättchen aus dem Blut anderer Arten auch verwendet werden.

Einleitung

Blutplättchen sind ein Bestandteil des Blutes, der als Initiator der Blutgerinnung als Reaktion auf Schäden im Blutgefäß fungiert. Sie versammeln sich an der Stelle der Verletzung, um die Gefäßwand¹zu stopfen. Plattenets sind Zusammenhänge von Zytoplasma, die aus den Megakaryozyten des Knochenmarks unter dem Einfluss von Thrombopoietin abgeleitet werden und in den Kreislauf²gelangen. Sie gelten als metabolisch aktiv und können die extrazelluläre Umgebung durch die Aktivierung intrazellulärer Signalkaskaden erkennen, die zu der Ausbreitung, Aggregation und Hämodizatische Steckerbildung 1, 3^führen. Neben der Hämostasis/Thrombose und der Wundheilung⁴spielen die Platten eine wichtige Rolle bei den Entzündungsreaktionen, der Angiogenese und den Metastatis^{3,5 , 6,7}, ⁸.

Die Plateletten werden aus dem Blut gereinigt, um ihre biochemischen und physiologischen Eigenschaften zu untersuchen, die frei von anderen Blutbestandteilen sein sollten. Da rote Blutkörperchen (RBC) und weiße Blutkörperchen (WBC) deutlich mehr RNA^undProteine enthalten als die Blutplättchen 9,10, kann das Vorhandensein von sogar einer kleinen Anzahl dieser Zellen mit transkriptomischen und proteomischen Analysen der RNA stören Und Proteine, die aus Blutplättchen stammen. Wir fanden heraus, dass gereinigte Blutplättchen, die mit Thrombin-Bind-Antikörper wie Anti-GPIIb/IIIa (JON/A) und Anti-P-Selektin aktiviert wurden, effizienter als Vollblutplüten.

Da die Blutplättchen zerbrechlich sind, ist es wichtig, die Proben möglichst milde zu behandeln. Wenn die Platten aktiviert sind, geben sie ihren Granulatgehalt frei und sinken schließlich ab. Um die funktionellen Eigenschaften der Platelette intakt zu halten, ist es daher wichtig, die Ruhe während der Isolation zu erhalten. Mehrere Protokolle haben die Isolierung von Blutplättchen von menschlichem, Hund, Ratte und nicht-menschlichem Primat mit verschiedenen Methoden^{1,10,11, 12beschrieben}. Einige der Methoden erfordern mehrere Schritte wie das Sammeln von platelettreichem Plasma durch Zentrifugation, Filtration durch Trennsäule, negative Auswahl von Blutplättchen mit RBC-und WBC-spezifischen Antikörper, die mit Magnetperlen konjugiert werden, und so weiter, die Zeitaufwendig und kann Blutplättchen und deren Inhalt abbauen.

Ford und seine Kollegen beschrieben die Platelet-Reinigung aus menschlichem Blut mit Iohexol Medium¹¹. Diese Methode verwendet ein ähnliches Volumen der Blutprobe und Medium während der Reinigung. Da der Mensch ein höheres Blutvolumen erweist, ist es relativ einfach, die Blutplättchen zu reinigen.

Iohexol ist ein universelles Dichtegradienten-inertes Medium, das frei im Wasser löslich ist und bei der Fraktionierung von Nukleinsäuren, Proteinen, Polysacchariden und Nukleoproteinen 13^,14verwendet wird. Es hat eine geringe Osmolalität und ist ungiftig, so dass es ein ideales Medium für die Reinigung vonintakten lebenden Zellen 11. Es ist ein nicht-partikelfreies Medium; So kann die Verteilung der Zellen in einem Farbverlauf mit Hämozytometer, Strömungszytometer oder Spektrophotometer bestimmt werden. Es stört nicht die meisten enzymatischen oder chemischen Reaktionen der Zellen oder Zellfragmente nach der Verdünnung.

Die Maus dient als wichtiges Tiermodell für viele menschliche Krankheiten^{15, 16,17,18}. Es gibt ein paar veröffentlichte Artikel, die die Reinigung von Maus-Platten 19,^{20beschreiben}. Allerdings liefert die Maus ein relativ geringeres Blutvolumen, was die Reinigung von Blutplättchen erschwert. Wird das gleiche geringe Volumen an GradientenMittel-und Blutproben verwendet, kann die Plattenschicht nach der Zentrifugation nicht eindeutig von der RBC-WBC-Schicht getrennt werden. In diesem Artikel haben wir eine schnelle und einfache Methode der Maus-Plattenreinigung mit dreifach mehr Iohexol-Gradientenmedium im Verhältnis zum Blutprobenvolumen und der niedrigen Geschwindigkeit Zentrifugation beschrieben. Wir haben auch die gereinigten Blutplättchen mit Thrombin aktiviert und ihre Qualität mit Strömungszytometrie und Mikroskopie untersucht.

Protokoll

Die Blutentnahme von Maus sollte mit entsprechender institutioneller Tierpflege und Zustimmung des Ausschusses durchgeführt werden.

NOTE: Das Platelet-Reinigungsprotokoll wird in einem Strömungsdiagramm in Abbildung1 beschrieben.

1. Sammlung von Blut

1. 25 μL von 3,2% Natriumcitrat (pH 7,2) als Anti-Gerinnungsmittel und 0,4 mM Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) in ein Polypropylen-Rohr geben.
2. Sammeln Sie etwa 200 μL Blut aus der C57BL/6-Maus mit Retro-Orbital-Blutungen.
   Hinweis: Blut kann von jeder Art von Maus-Stamm gesammelt werden, unabhängig von Alter oder Geschlecht.
   1. Verwenden Sie 2 mL Isoofluran in jeder Art von Kammer, um die Maus zu betäuben.
      NOTE: Die Tiefe der Anästhesie wird durch Anzeichen einer erhöhten Atmung und verminderter Bewegung überprüft. Die Maus sollte nicht auf die Bewegung der Anästhesie-Kammer oder auf die Behandlung reagieren. Wenn die Maus auf Bewegung oder Handhabung reagiert, dann braucht es mehr Zeit, um in der Anästhesiekammer zu halten.
   2. 1.2.2 Öffnen Sie entweder das rechte oder das linke Augenlid der Maus und legen Sie ein 7,5 cm großes Kapillarrohr in den Gefäßplexus des Auges.
   3. Drehen Sie das Kapillarrohr eine halbe Drehung, während Sie Druck auf das Kapillarrohr ausüben, um die Gefäße zu brechen und den Blutfluss zu beginnen. Halten Sie das Tier über die Sammelvial auf den Kopf, um durch Kapillarwirkung gefüllt zu werden.
   4. Sobald das entsprechende Blutvolumen gesammelt ist, das Kapillarrohr entfernen und das Auge schließen, indem Sie 30 s auf das Augenlid mit Gaze drücken. Sobald die Blutung gestoppt ist, bringe die Maus in ihren Käfig zurück und kontrolliere sie für die Blutung.
   5. Überprüfen Sie die Augen auf Traumata 1-2 Tage nach Retro-Orbital-Blutungen. Entfernen Sie jede Maus aus der Studie, die Anzeichen von signifikanten Traumata auf das Auge als Folge des Eingriffs und Euthanierung.
      NOTE: Die Maus sollte sich keiner Behandlung unterziehen, die Blutplättchen für mindestens zwei Wochen vor der Blutentnahme hemmen kann. Die Blutprobe muss für die Blutreinigung innerhalb einer Stunde nach Blutung der Maus verwendet werden.

2. Platelet Purifizierung

NOTE: Die Platelet-Reinigung sollte bei Raumtemperatur durchgeführt werden, um deren Abbau zu verhindern. Achten Sie darauf, dass die Temperatur der Reagenzien und Instrumente zwischen 18 und 22 ° C liegt. Um einen Platzabbau zu verhindern, sollte während des Eingriffs ein schnelles Pipettieren und kräftiges Schütteln vermieden werden.

1. 600 μL Iohexol-Gradientenmittel (12% Iohexol-Pulver in 0,85% Natriumchlorid, 5 mM Tricine, pH 7.2) 11 in ein 1,5 mL Rohr geben.
2. 200 μL Blutprobe langsam auf die Seite des Rohres auf dem Gradientenmedium mit einer breiten Bohrpfeifenspitze hinzufügen, damit sich Blut und Iohexol-Medium nicht vermischen (Abbildung 2A).
3. Zentrifuge die Probe mit Schlauch bei 400 x g für 20 min bei 20 ° C in einem schwingenden Eimer-Rotor mit langsamer Beschleunigung und Verzögerung.
4. Sammeln Sie den größten Teil der platelettreichen Schicht und einen kleinen Bruchteil der platelet-armen Schicht (insgesamt 300 bis 400 μL) mit einer breiten Bohrpfeifenspitze, ohne die RBC und WBC-Schichten zu stören (Abbildung 2B). Übertragen Sie die Plattenprobe auf ein neues Rohr.
   NOTE: Liegt die Plattenzählung weniger im Blut oder wird ein kleineres Blutvolumen verwendet, kann die plateletarreiche Schicht und die platelettarme Schicht als eine einzige Schicht gesehen werden.
5. In einem schwingenden Eimer-Rotor 1 mL PBS in die Platelet-Probe geben, durch Umkehrung und Zentrifuge bei 800 x g für 10 min bei 20 ° C vermischen. Die Lösung komplett ablegen und 200 μL PBS hinzufügen, um die Platten mit mildem Pipettieren wiederzubeleben.
   NOTE: Dieser Schritt ist optional, da er das Gradientenmedium und Plasma-Proteine entfernt und die Empfindlichkeit von Blutplättchen gegenüber Agonisten wie Thrombin erhöht. Da verschiedene Zentrifugen unterschiedliche Programme haben, kann die langsame Beschleunigung/Verlangsamung durch das Lesen der Bedienungsanleitung der Zentrifuge bestimmt werden.
6. Übertragen Sie 30 μL dieser Probe in ein neues Rohr, um Platten zu zählen. Die restlichen Blutplättchen können für biochemische und physiologische Untersuchungen wie Plateletaktivierung, Aggregation, Granulatfreigabe usw. verwendet werden.
7. Für die RNA oder Proteinextraktion die Blutplättprobe bei 800 x g für 10 min zentrifugen, um die Blutplättchen zu pülen. Verfall supernatant ganz, ohne das Pellet zu stören. Fügen Sie das gewünschte Volumen von RNA oder Protein-Lysis Puffer hinzu, um die Blutplättchen zu lysern.

3. Zählung der Platelets

1. Zählen Sie die ganzen Blutkörperchen ohne Verdünnung und gereinigten Blutplättchen (verdünnt 2 bis 5-fach mit PBS) mit einem automatisierten Zellanalysator. Verwenden Sie 30 bis 50 μL-Proben zum Zählen.
2. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Blutplättchen, indem Sie sich mit dem Volumen der Probe multiplizieren.
3. Berechnen Sie den Anteil der Erträge von gereinigten Blutplättchen.
4. Zählen Sie die RBC und WBC in der gereinigten Plattenprobe (verdünnt 50 bis 100-fach mit PBS) mit einem Hämozytometer und Mikroskop.

4. Platelet-Aktivierung

1. In einem Rohr 1 bis 2 Millionen gereinigte Blutplättchen in bis zu 100 μL Färbepuffer (PBS mit 2% fetalem Rinderserum, FBS).
2. Für eine mehrfache Anzahl von Proben, machen Sie eine Master-Mischung von Antikörpern mit 1 μL (0,5 mg/mL) der folgenden: PE-Cy7 Ratte Anti-Maus TER 119, PE Ratte Anti-Maus CD45, FITC Ratte Anti-Maus-CD41, und APC Ratte anti-mouse/human CD62P (P-selectin) zu erkennen RBC, WBC, Blutplättchen, und Aktivierte Plateletten. Fügen Sie den Master-Mix in die Rohre, um die Zellen zu färben. Thrombin nicht hinzufügen.
3. In einem anderen Rohr 1 bis 2 Millionen gereinigte Blutplättchen in bis zu 100 μL Färbepuffer und 0,4 mM GPRP Peptid hinzufügen. Thrombin hinzufügen, um die Blutplättchen zu aktivieren und die Zellen nach Schritt 4.2 zu verfärben.
   NOTE: GPRP sollte der Probe hinzugefügt werden, bevor Thrombin hinzugefügt wird, um Aggregate oder Kleingebildung durch Plattenaktivierung zu verhindern. Die Thrombin-Konzentration sollte optimiert werden, um eine gute Aktivierung der Blutplättchen zu erreichen. Nach der Aktivierung des Plattenplatzes werden die Ereigniszahlen bei der Erfassung von Proben durch Strömungszytometrie verringert.
4. Als positive Kontrolle 1 μL Vollblut in bis zu 100 μL Färbepuffer in einem Rohr und 0,4 mM GPRP Peptid hinzufügen. Thrombin hinzufügen, um die Platelets zu aktivieren. Als negative Kontrolle 1 μL Vollblut in bis zu 100 μL Färbepuffer hinzufügen. Geben Sie Thrombin nicht in negative Kontrollprobe. Verlassen Sie die Zellen nach Schritt 4.2.
5. Für die Strömungszytometrie isotype Steuerung, Etikett 5 Rohre mit unbefleckt, PE-Cy7, PE, FITC, und APC. Fügen Sie 100 μL Färbepuffer, 1 μL Blut und 1 μL des jeweiligen Antikörpers zu den beschrifteten Röhren hinzu, um die Zellen zu verfärben.
6. Inkubieren Sie Proben, um bei Raumtemperatur im Dunkeln 30 Minuten lang zu flecken.
7. Waschen Sie die Proben, indem Sie 1 mL Färbepuffer zu jedem Rohr hinzufügen. Zentrifuge bei 800 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Den Färbepuffer vorsichtig ablegen, ohne das Pellet zu entleeren.
8. Fügen Sie jedem Rohr 300 μL Fleckenpuffer hinzu, mischen Sie milde und übertragen Sie auf ein FACS-Rohr. Die gebeizten Proben im Dunkeln aufbewahren, bis sie mit einem Strömungszytometer analysiert sind.

5. Flow Cytometry Analysen von Platelets

1. Erstellen Sie ein neues Experiment und generieren Sie Log-Forward-Streuung vs Log-seitige Streuplots und weisen Sie Tore für Ter119 PE-Cy7 (RBC), CD45 PE (WBC), CD41 FITC (Blutungen) und CD62P APC (aktivierte Platelets) Populationen nach der Gating-Strategie für die Experimentieren Sie in der FACS DIVA Software.
   1. Öffnen Sie die Bevölkerungshierarchie, indem Sie die Bevölkerungshierarchie unter der Registerkarte Populationen wählen. Bearbeiten Sie die Populationshierarchie, indem Sie die Gating-Strategie überprüfen und die Tore richtig umbenennen.
   2. Öffnen Sie die statistische Ansicht, indem Sie sich für die Ansicht erstellen von Statistikenentscheiden. Bearbeiten Sie die Statistikansicht nach den Benutzereinstellungen, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Statistik-Ansicht klicken und die Ansicht Bearbeiten der Statistik auswählen.
   3. Wählen Sie eine Farbe für jedes Tor, die den visuellen Aspekt des Layouts durch einen Doppelklick auf das Feld entsprechend der Bevölkerung verbessert.
2. Klicken Sie im Cytometer-Fenster auf die Registerkarte Parameter und passen Sie die Spannungen für Parameter an, um die Population des Interesses auf den Grundstücken darzustellen.
3. Passen Sie die Spannungen für jeden der Parameter so an, dass die negative Population von der positiven Population unterschieden werden kann. Bevor Sie die Proben für die Kompensationskontrolle aufnehmen, überprüfen Sie, ob die eingefärbten positiven Kontrollen in der Größenordnung sind (stellen Sie sicher, dass die positiven Spitzen sichtbar sind und nicht zu weit nach rechts).
   NOTE: Wenn die positiven Spitzen abgefallen sind, sollten die Spannungen angepasst werden, um die positiven Populationen zu sehen.
4. Zeichnen Sie die einfarbig gefärbten Zellen für Kompensationskontrollen (unbefleckt, PE-Cy7, PE, FITC und APC).
5. Wenn die positiven Kontrolltore nicht richtig aufgestellt sind, passen Sie sie an, indem Sie Spannungen ändern.
6. Gehen Sie zum Experiment > Kompensationseinstellung > Kompensation berechnen. Wählen Sie nur im resultierenden Fenster .
7. Wechseln Sie zum globalen Arbeitsblatt, indem Sie auf den Knopf "Toggle" oben links im Arbeitsfenster klicken.
8. Laden Sie die positive Kontrollprobe und gewinnen Sie genügend Zellen, um die Ausgleichszahlung und die Tore anzupassen.
9. Laden Sie die Probe erneut und überprüfen Sie, ob jede Handlung die erwartete Zellpopulation auf der Basis des fluorchromen gefärbten Antikörpers zeigt. Erwerben und erfassen Sie 100.000 Veranstaltungen für Vollblutproben und 10.000 Veranstaltungen für gereinigte Blutplättchen. Laden Sie die Proben einzeln, bis die Akquisition abgeschlossen ist.
10. Analysieren Sie die Flow-Zytometrie-Daten mit der Software mit entsprechenden Grundstücken und Toren (Bild 3)

Ergebnisse

Die Zusammenfassung der Plattenreinigung wird in einem Strömungsdiagramm beschrieben (Abbildung 1). Zu den Schritten gehören die Blutentnahme von der Maus mit Retro-Orbitalblutungen in Anwesenheit eines Gerinnungshaus, die Zugabe von Blutprobe auf das Iohexol-Gradientenmedium, Zentrifugation in einem schwingenden Eimer-Rotor bei 400 x g für 20 min bei 20 ° C. Die Qualität der gereinigten Blutplättchen wurde nach der Färbung mit Antikörper mit Mikroskopie und Strömungszytome...

Diskussion

Häufig werden Blutplättchen durch eine Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit isoliert, die plateletreichem Plasma liefert, das eine beträchtliche Anzahl von Blutkörperchen, Zellabfall und Plasmaproteinen enthält, die die biochemischen und physiologischen Assays und Bedürfnisse stören können. Weitere Reinigung^21. Daher ist es wichtig, eine schnelle und einfache Methode zu verwenden, die reine Blutplättchen ohne größere Verunreinigungen erzeugen kann. Das hier vorgestellte Protokol...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin)	Thermoscientific	17-0626-82	Platelets activation marker
Eppendorf tube	Fisher Scientific	14-222-166	Tube for centifuge
FACS DIVA software	BD Biosciences	Non-catalog item	Analysis of platelets and whole blood
FACS tube	Fisher Scientific	352008	Tubes for flow cytomtery
Fetal bovine serum (FBS)	Invitrogen	26140079	Ingredient for staining buffer
FITC rat anti-mouse CD41	BD Biosciences	553848	Platelets marker
Flow cytometer	BD Biosciences	Non-catalog item	Analysis of platelets and whole blood
FlowJo software	FlowJo, Inc.	Non-catalog item	Analysis of platelets and whole blood
Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)	EMD Millipore	03-34-0001	Prevent platelet clot formation
Hematocrit Capillary tube	Fisher Scientific	22-362566	Blood collection capillary tube
Hemavet	Drew Scientific	Non-catalog item	Blood cell analyzer
Hemocytometer	Hausser Scientific	3100	Cell counting chamber
Isoflurane	Baxter	1001936040	Use to Anesthetize mouse
Microscope (Olympus CKX41)	Olympus	Non-catalog item	Cell monitoring and counting
Nycodenz (Histodenz)	Sigma-Aldrich	D2158	Gradient medium
PE rat anti-mouse CD45	BD Biosciences	561087	WBC marker
PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119	BD Biosciences	557853	RBC marker
Pipet tips 200 µL, wide-bore	ThermoFisher Scientific	21-236-1A	Transferring blood and platelet samples
Pipet tips 1000 µL, wide-bore	ThermoFisher Scientific	21-236-2C	Transferring blood and platelet samples
Phosphate buffured saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	14040-117	Buffer for washing and dilution
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Physiological saline
Sodium citrate	Fisher Scientific	02-688-26	Anti-coagulant
Staining buffer	In-house	Non-catalog item	Wash and dilution buffer
Steile water	In-house	Non-catalog item	Solvent
Table top centrifuge	ThermoFisher Scientific	75253839/433607	Swinging bucket rotor centrifuge
Thrombin	Enzyme Research Laboratoty	HT 1002a	Platelet activation agonist
Tricine	Sigma-Aldrich	T0377	Buffer for Nycodenz medium