טיהור של טסיות מתוך דם העכבר

Summary

כאן, דמו של העכבר נאסף. בנוכחות אנטי-מקריש טסיות היו מטוהרים על ידי המדיום iohexol באמצעות מהירות נמוכה צנטריפוגה. טסיות הדם הופעלו עם תרומבין. כדי לחקור אם הם היו מעשי האיכות של טסיות מטוהר נותחו על ידי cy, מיקרוסקופ זרימה.

Abstract

טסיות מטוהרים מדם שלם כדי ללמוד את המאפיינים הפונקציונליים שלהם, אשר צריך להיות חופשי מתאי דם אדומים (RBC), כדוריות דם לבנות (WBC), וחלבונים פלזמה. אנו מתארים כאן טיהור של טסיות מתוך דם העכבר באמצעות שלושה מקפלים יותר מעבר מדרגה בינונית ביחס לנפח דגימת דם ו צנטריפוגה ברוטור דלי מנופף ב 400 x g עבור 20 דקות ב 20 ° c. ההתאוששות/תשואה של טסיות מטוהר היו 18.2-38.5%, ואת טסיות מטוהר היו במצב מנוחה, אשר לא מכילים כל מספר משמעותי של RBC ו-WBC. טסיות מטוהרים מטופלים עם תרומבין הגיע עד 93% הפעלה, המציין את הכדאיות שלהם. אנו מאשרים כי טסיות מטוהר הם טהורים מספיק באמצעות cytometric זרימה הערכה מיקרוסקופית. טסיות אלה ניתן להשתמש עבור ביטוי גנים, הפעלה, שחרור גרגר עושה מצבור, הדבקה assays. שיטה זו ניתן להשתמש לטיהור של טסיות מדם של מינים אחרים, כמו גם.

Introduction

טסיות הם רכיב של דם המתפקד כיוזם של קרישת דם בתגובה לנזק בכלי הדם. הם מתאספים באתר של פציעה. כדי לחבר את כלי הקיבול לקיר¹ טסיות הם שברי אנוקלאט של ציטופלסמה הנגזר מהקרציטים של מח העצם תחת השפעת התרובטין ולהיכנס למחזור הדם². הם נחשבים metabolically פעילים ומסוגלים לחוש הסביבה מסחטות על ידי הפעלת מפלי איתות תאיים כי התוצאה היא התפשטות טסיות, מצבור, ו הומוסטטית היווצרות תקע^1,3. מלבד הומוסטזיס/פקקת וריפוי הפצע⁴, טסיות לשחק תפקיד חשוב בתגובות דלקתיות מארח, אנגיוגנזה, ו גרורות^{3,5,6,7, שמונה}.

טסיות מטוהרים מדם ללמוד תכונות ביוכימיים ופיסיולוגיים שלהם, אשר צריך להיות חופשי מרכיבי דם אחרים. מאז כדוריות הדם האדומות (rbc) וכדוריות הדם הלבנות (wbc) מכילים באופן משמעותי יותר RNA וחלבונים מאשר טסיות^9,10, נוכחות של מספר קטן של תאים אלה יכול להפריע לניתוח הטרנססקריפט והפרוטאומית של RNA וחלבונים הנגזרים מטסיות הדם. מצאנו כי טסיות מטוהרים מופעל עם נוגדנים לאגד תרומבין כגון אנטי GPIIb/IIIa (ג'ון/A) ו אנטי-P-selectin ביעילות רבה יותר מאשר טסיות דם שלמות.

מאחר שטסיות הן שבירות, חשוב לטפל בדגימות במתינות ככל האפשר. אם טסיות מופעלות, הם משחררים את תוכן הגרריר שלהם ובסופו של דבר לבזות. לכן, כדי לשמור על המאפיינים הפונקציונליים של טסיות שלמות, חשוב לשמור על השקט טסיות בזמן הבידוד. פרוטוקולים מספר תיארו בידוד של טסיות מן האדם, כלב, עכברוש, והפרימטים לא אנושיים על ידי שיטות שונות^1,10,11,12. חלק מהשיטות דורשות שלבים מרובים כגון אוסף של פלזמה עשיר טסיות ידי צנטריפוגה, סינון על ידי הפרדת הטור, מבחר שלילי של טסיות עם הנוגדן הספציפי RBC-ו-WBC-מצוייחים לחרוזים מגנטיים, וכן הלאה, אשר זמן רב ועלול לבזות את הטסיות ואת תוכנם.

פורד ועמיתיו תיאר לטיהור טסיות דם אנושי באמצעות iohexol בינוני¹¹. שיטה זו משתמשת בכמות דומה של דגימת דם ובינונית במהלך הטיהור. מאז בני האדם להניב נפח גבוה יותר של דם, קל יחסית לטהר את טסיות.

Iohexol היא צפיפות אוניברסלית מעבר הדרגתי בינונית, כי הוא מסיסים באופן חופשי במים ומשמש השבר של חומצות גרעין, חלבונים, פוליסכרידים, ו נוקלאופרוטאינים^13,14. יש לו אוסמאליות נמוכה והוא לא רעיל, ובכך הופך אותו למדיום אידיאלי לטיהור של תאים חיים שלמים¹¹. זהו מדיום שאינו חלקיקי; לפיכך, ניתן לקבוע את התפלגות התאים במעבר צבע באמצעות הומוציטומטר, הזרמת cytom, או ספקטרוסקופיה. היא אינה מפריעה לרוב התגובה האנזימטית או הכימית של התאים או החלקים הסלולריים לאחר דילול.

העכבר משמש מודל חשוב בעלי חיים עבור מחלות אנושיות רבות^15,16,^17,18. יש כמה מאמרים שפורסמו שמתארים טיהור של טסיות העכבר^19,20. עם זאת, העכבר מניב נפח קטן יחסית של דם, מה שמקשה על טיהור טסיות. אם נעשה שימוש באותו כמות קטנה של בינוני ודגימות דם, שכבת הטסיות לא יכולה להיות מופרדת בבירור משכבת ה-RBC-WBC לאחר צנטריפוגה. במאמר זה, תיארנו שיטה מהירה ופשוטה של טיהור העכבר טסיות עם שלושה קיפול מעבר מדרגה גבוהה יותר בינונית ביחס לנפח דגימת הדם ומהירות נמוכה צנטריפוגה. בנוסף, הפעלנו את טסיות הדם הטהורה עם התרומבין וחקרו את איכותם בעזרת cy, והמיקרוסקופיה.

Protocol

אוסף דם העכבר צריך להתבצע עם טיפול בעלי חיים מוסדיים המתאים ולהשתמש אישור הוועדה.

הערה: פרוטוקול טיהור טסיות מתואר בדיאגרמת זרימה באיור 1.

1. אוסף דם

1. הוסף 25 μL של 3.2% נתרן ציטראט (pH 7.2) כאנטי מקריש ו 0.4 mM של הפרו-Pro-Arg-Pro (GPRP) בצינור פוליפרופילן.
2. לאסוף כ 200 μL של דם מ C57BL/6 העכבר באמצעות מסלולית רטרו.
   הערה: ניתן לאסוף דם מכל סוג של מאמץ העכבר ללא קשר לגיל או מין.
   1. השתמש 2 מ ל של isofלוריאן בכל סוג של תא לההרדמה העכבר.
      הערה: עומק ההרדמה נבדק על ידי סימנים של נשימה מוגברת וירידה בתנועה. העכבר לא צריך להגיב על התנועה של תא ההרדמה, או להיות מטופל. אם העכבר מגיב תנועה או טיפול, אז זה דורש יותר זמן לשמור בחדר ההרדמה.
   2. 1.2.2 פתח את העפעף הימני או השמאלי של העכבר והכנס שפופרת קפילר 7.5 ס מ (בקוטר 0.12 ס מ) לתוך מקלעת כלי הדם של העין.
   3. סובבו את צינור הקפילר אחד לחצי להפוך תוך הפעלת לחץ על צינור נימי לשבור את כלי הדם וליזום זרימת דם. להחזיק את החיה הפוכה מעל בקבוקון האוסף להיות מלא על ידי פעולה קפילר.
   4. לאחר הנפח המתאים של דם נאסף, להסיר את צינור נימי ולסגור את העין על ידי החלת לחץ קל עבור 30 s על העפעף עם גזה. לאחר הפסקת דימום, להחזיר את העכבר לכלוב שלו לפקח על דימום.
   5. בדוק את העיניים של טראומה 1-2 ימים לאחר דימום מסלולית רטרו. להסיר את כל העכבר מן המחקר מראה סימנים של טראומה משמעותית לעין כתוצאה של ההליך המתת חסד.
      הערה: העכבר לא צריך לעבור כל סוג של טיפול אשר יכול לעכב טסיות לפחות שבועיים לפני איסוף הדם. דגימת הדם חייבת לשמש לטיהור טסיות בתוך שעה אחת של דימום העכבר.

2. טיהור דם

הערה: טיהור טסיות צריך להתבצע בטמפרטורת החדר כדי למנוע השפלה שלהם. ודא כי הטמפרטורה של הריאגנטים והמכשירים הם בין 18 ל -22 ° c. כדי למנוע השפלה טסיות, ליטוף מהיר וטלטול נמרץ יש להימנע במהלך ההליך.

1. הוסף 600 μL של בינוני מעבר הצבע iohexol (12% iohexol אבקה ב 0.85% נתרן כלוריד, 5 מ"מ Tricine, pH 7.2)¹¹ לתוך שפופרת 1.5 mL.
2. הוסף 200 μL של דגימת דם לאט במורד הצד של הצינור על גבי המדיום מעבר הצבע עם טיפ מנשא משעמם רחב כך דם ו iohexol בינוני לא לערבב (איור 2A).
3. צנטריפוגה את המדגם המכיל צינור ב 400 x g עבור 20 דקות ב 20 ° צ' ברוטור דלי מנופף עם האצה איטית והאטה.
4. לאסוף את רוב שכבת טסיות עשיר וחלק קטן של שכבת טסיות-העניים (סך 300 עד 400 μL) באמצעות טיפ מנשא משעמם רחב מבלי להטריד את שכבות RBC ו-WBC (איור 2B). העבר את דגימת הטסיות. לשפופרת חדשה
   הערה: אם ספירת טסיות היא פחות בדם או נפח קטן יותר של דם משמש, שכבה עשירה טסיות ושכבה הדלה טסיות ניתן לראות כשכבה אחת.
5. הוסף 1 mL של PBS לדגימת טסיות, לערבב על ידי היפוך, ו צנטריפוגה ב 800 x g עבור 10 דקות ב 20 ° c ברוטור דלי מנופף. למחוק את הפתרון לחלוטין ולהוסיף 200 μL של PBS להשעות את טסיות עם ליטוף קל.
   הערה: שלב זה הוא אופציונלי, כפי שהוא מסיר את מעבר הצבע ואת החלבונים פלזמה ומגביר את הרגישות של טסיות לאגוניסטים כגון תרומבין. מאחר שבצנטריפוגות שונות יש תוכניות שונות, ניתן לקבוע את ההאצה האיטית/האטה על-ידי קריאת המדריך למשתמש של הצנטריפוגה.
6. העברה 30 μL של מדגם זה לתוך צינור חדש כדי לספור טסיות. טסיות שנותרו ניתן להשתמש עבור ביוכימיים ופיסיולוגיים כגון הפעלה טסיות, צבירה, שחרור גרגר עושה וכו '.
7. עבור החילוץ RNA או חלבון, צנטריפוגה את דגימת טסיות ב 800 x g עבור 10 דקות כדי הגלולה טסיות. להיפטר באופן מוחלט מבלי להפריע לגלולה. הוסף את הנפח הרצוי של מאגר ה-RNA או לפירוק החלבון כדי ליאוס את טסיות.

3. ספירת טסיות

1. לספור את כל התאים דם ללא דילול טסיות מטוהרים (מדולל 2 כדי 5-קיפול עם PBS) באמצעות מנתח התא אוטומטי. השתמש בדוגמיות של 30 עד 50 μL לספירה.
2. לחשב את המספר הכולל של טסיות באמצעות הכפלת על ידי הדגימה של המדגם.
3. חשב את אחוז התשואה/שחזור של טסיות מטוהרים.
4. הרוזן RBC ו WBC במדגם טסיות מטוהר (מדולל 50 כדי 100-קיפול עם PBS) עם הומוציטוטומטר ומיקרוסקופ.

4. הפעלת טסיות דם

1. בצינור, להוסיף 1 כדי 2,000,000 טסיות מטוהרים בתוך עד 100 μL של מאגר כתמים (PBS עם 2% סרום שור עוברי, FBS).
2. עבור מספר מרובים של דגימות, לעשות שילוב מאסטר של נוגדנים עם 1 μL (0.5 mg/mL) של הבאים: PE-Cy7 עכברוש נגד עכבר TER 119, PE עכברוש נגד עכבר CD45, עכבר FITC עכברוש נגד העכבר CD41, ועכבר APC anti-mouse/אדם CD62P (P-selectin) כדי לזהות RBC, WBC, טסיות, טסיות דם מופעלות, בהתאמה. הוסף את התמהיל הראשי לצינורות לצביעת התאים. אין להוסיף את התרומבין.
3. בצינור אחר, להוסיף 1 עד 2,000,000 של טסיות מטוהרים בתוך עד 100 μL של מאגר הצביעת, ו 0.4 mM GPRP פפטיד. הוסף את התרומבין כדי להפעיל את טסיות ולהכתים את התאים הבאים צעד 4.2.
   הערה: יש להוסיף את GPRP למדגם לפני הוספת התרומבין כדי למנוע צבירה או מבנה קריש באמצעות הפעלת טסיות דם. ריכוז התרומבין צריך להיות מותאם כדי לקבל הפעלה טובה של טסיות. לאחר הפעלת טסיות דם, ספירות האירועים ירדו במהלך הרכישה של דגימות על ידי הזרמת cy, try.
4. כפקד חיובי, להוסיף 1 μL של דם שלם עד 100 μL כתמים מאגר בצינור ו 0.4 mM GPRP פפטיד. הוסף את התרומבין להפעלת טסיות. כפקד שלילי, להוסיף 1 μL של דם שלם עד 100 μL של מאגר הצביעת. אין להוסיף את התרומבין בדגימת שליטה שלילית. הכתם את התאים לאחר שלב 4.2.
5. עבור הזרמת cy, הפקד isotype, תווית 5 צינורות עם בלתי מוכתם, PE-Cy7, PE, FITC, ו APC. הוסף 100 μL של מאגר כתמים, 1 μL של דם, ו-1 μL של הנוגדן המתאים לצינורות המסומנים כדי להכתים את התאים.
6. מודטה דגימות לכתם עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
7. שטוף את הדגימות על ידי הוספת 1 mL של מאגר הצביעת לכל צינור. צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. למחוק את מאגר הצביעת בזהירות מבלי לבטל את לינה את הגלולה.
8. הוסף 300 μL של צביעת מאגר לכל צינורית, ערבב במתינות והעברה לשפופרת של FACS. אחסן את הדגימות המוכתמות בחשכה עד שנותחו באמצעות ציטוטומטר זורם.

5. הזרמת Cy, ניתוח של טסיות דם

1. צור ניסוי חדש וליצור מגרשים לפנים פיזור לעומת היומן מתווה פיזור נקודה ולהקצות שערים עבור Ter119 PE-Cy7 (rbc), CD45 PE (wbc), CD41 fitc (טסיות), ו-CD62P APC (טסיות מופעל) אוכלוסיות על פי אסטרטגיית הפגישה שנבחרה ל התנסות בתוכנה הדיווה של FACS.
   1. פתח את הירארכיית האוכלוסיה על-ידי בחירה באפשרות הצג הירארכיית אוכלוסיה תחת הכרטיסיה אוכלוסיות . ערוך את הירארכיית האוכלוסיה על-ידי בדיקת אסטרטגיית הפעולה ושינוי הצורה כראוי לשערים.
   2. פתח את תצוגת הסטטיסטיקה על-ידי בחירה באפשרות ' צור תצוגת סטטיסטיקה '. עריכת תצוגת סטטיסטיקה בהתאם להעדפות המשתמש על-ידי לחיצה ימנית על תצוגת הסטטיסטיקה ובחירה באפשרות ' עריכת תצוגת סטטיסטיקה '.
   3. בחר צבע עבור כל שער המשפר את ההיבט החזותי של הפריסה על-ידי לחיצה כפולה על התיבה התואמת לאוכלוסיה.
2. בחלון Cytometer לחץ על הכרטיסייה פרמטרים ולהתאים את המתח עבור פרמטרים כדי להמחיש את אוכלוסיית העניין על המגרשים.
3. התאם מתח עבור כל אחד מהפרמטרים כך שניתן יהיה להבדיל בין האוכלוסיה השלילית לבין האוכלוסיה החיובית. לפני הקלטת הדגימות עבור פקד הפיצוי, בדוק שהפקדים החיוביים המוכתמים בודדים נמצאים בקנה מידה (ודא שהפסגות החיוביות גלויות ולא רחוק מימין).
   הערה: אם הפסגות החיוביות מחוץ לסולם, יש לכוונן את המתח כדי לראות את האוכלוסיות החיוביות.
4. הקלט את התאים המוכתמים בצבע יחיד עבור פקדי פיצוי (בלתי מוכתם, PE-Cy7, PE, FITC ו-APC).
5. אם שערי השליטה החיוביים אינם מוגדרים כראוי, התאימו אותם על-ידי שינוי מתח.
6. עבור להתנסות ≫ התקנת פיצוי ≫ חישוב פיצוי. בחר באפשרות ' החל רק ' בחלון המתקבל.
7. עבור לגליון העבודה הגלובלי על-ידי לחיצה על לחצן דו-מצבי בחלק העליון, משמאל לחלון גליון העבודה.
8. טען את דגימת הבקרה החיובית ורכוש מספיק תאים כדי לכוונן את הפיצוי ואת השערים.
9. לטעון את המדגם שוב ולבדוק כי כל העלילה מציגה את אוכלוסיית התא צפוי בהתבסס על הנוגדן fluorochrome מוכתם. לרכוש ולהקליט 100,000 אירועים עבור דגימות דם שלמות ו 10,000 אירועים עבור טסיות מטוהרים. טען את הדגימות בזה אחר זה עד להשלמת הרכישה.
10. לנתח את cy, הזרמת נתונים עם התוכנה עם מגרשים ושערים מתאימים (איור 3)

תוצאות

סיכום של טיהור טסיות מתואר בדיאגרמת זרימה (איור 1). השלבים כוללים אוסף של דם מהעכבר באמצעות מסלולית רטרו בנוכחות של נוגד קרישה, תוספת של דגימת דם על בינוני הדרגתי iohexol, צנטריפוגה ברוטור דלי מנופף ב 400 x g עבור 20 דקות ב 20 ° c. האיכות של טסיות מטוהר הוערך עם מיקרוסקופ וזרימה cy, ...

Discussion

בדרך כלל, טסיות מבודדות על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה אשר מניב פלזמה עשיר טסיות המכיל מספר משמעותי של כדוריות הדם, הפסולת התאית, וחלבונים פלזמה אשר יכול להפריע הביוכימי והפיסיולוגיים והצרכים הפיזיולוגיים טיהור נוסף²¹. לכן, חשוב להשתמש בשיטה מהירה ופשוטה אשר יכולה להניב טסיו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin)	Thermoscientific	17-0626-82	Platelets activation marker
Eppendorf tube	Fisher Scientific	14-222-166	Tube for centifuge
FACS DIVA software	BD Biosciences	Non-catalog item	Analysis of platelets and whole blood
FACS tube	Fisher Scientific	352008	Tubes for flow cytomtery
Fetal bovine serum (FBS)	Invitrogen	26140079	Ingredient for staining buffer
FITC rat anti-mouse CD41	BD Biosciences	553848	Platelets marker
Flow cytometer	BD Biosciences	Non-catalog item	Analysis of platelets and whole blood
FlowJo software	FlowJo, Inc.	Non-catalog item	Analysis of platelets and whole blood
Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)	EMD Millipore	03-34-0001	Prevent platelet clot formation
Hematocrit Capillary tube	Fisher Scientific	22-362566	Blood collection capillary tube
Hemavet	Drew Scientific	Non-catalog item	Blood cell analyzer
Hemocytometer	Hausser Scientific	3100	Cell counting chamber
Isoflurane	Baxter	1001936040	Use to Anesthetize mouse
Microscope (Olympus CKX41)	Olympus	Non-catalog item	Cell monitoring and counting
Nycodenz (Histodenz)	Sigma-Aldrich	D2158	Gradient medium
PE rat anti-mouse CD45	BD Biosciences	561087	WBC marker
PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119	BD Biosciences	557853	RBC marker
Pipet tips 200 µL, wide-bore	ThermoFisher Scientific	21-236-1A	Transferring blood and platelet samples
Pipet tips 1000 µL, wide-bore	ThermoFisher Scientific	21-236-2C	Transferring blood and platelet samples
Phosphate buffured saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	14040-117	Buffer for washing and dilution
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Physiological saline
Sodium citrate	Fisher Scientific	02-688-26	Anti-coagulant
Staining buffer	In-house	Non-catalog item	Wash and dilution buffer
Steile water	In-house	Non-catalog item	Solvent
Table top centrifuge	ThermoFisher Scientific	75253839/433607	Swinging bucket rotor centrifuge
Thrombin	Enzyme Research Laboratoty	HT 1002a	Platelet activation agonist
Tricine	Sigma-Aldrich	T0377	Buffer for Nycodenz medium