小鼠血液中血小板的纯化

摘要

在这里, 老鼠的血液是在抗凝剂的存在下采集的。采用碘己醇梯度介质, 采用低速离心法纯化血小板。血小板被激活与凝血酶调查, 他们是否可行。采用流式细胞仪和显微镜对纯化后的血小板质量进行了分析。

摘要

血小板从全血中纯化, 以研究其功能特性, 这些功能应从红细胞 (RBC)、白细胞 (WBC) 和血浆蛋白中解脱出来。我们在这里描述纯化血小板从小鼠血液使用三倍以上的 iohexol 梯度介质相对于血液样本量和离心在一个摇摆桶转子在 400 x g在 20°c 20分钟。纯化后的血小板的恢复率为 18.2-38.5%, 纯化后的血小板处于休眠状态, 不含明显的红细胞和 WBC。用凝血酶处理的纯化血小板的活化率达到 93%, 表明其活力。我们证实, 纯化后的血小板是足够纯净的流式细胞仪和微观评价。这些血小板可用于基因表达、活化、颗粒释放、聚集和粘附检测。该方法也可用于从其他物种的血液中纯化血小板。

引言

血小板是血液的一个组成部分, 它起到血液凝集剂的作用, 以应对血管的损伤。他们聚集在受伤地点, 堵塞船只墙^1号。血小板是由骨髓巨核细胞在血栓生成素的影响下产生的细胞质的无核碎片, 进入循环²。它们被认为是代谢活跃的, 能够通过激活细胞内信号级联来感知细胞外环境, 从而导致血小板扩散、聚集和止血塞形成^1,3。除了止血/血栓形成和伤口^{愈合 4}, 血小板在宿主炎症反应, 血管生成和转移^3,5^,6,7,⁸。

血小板从血液中纯化, 以研究其生化和生理特性, 这些特性应该从其他血液成分中解脱出来。由于红细胞 (rbc) 和白细胞 (wbc) 的 rna 和蛋白质含量明显高于血小板^9,10, 即使是少数这些细胞的存在也会干扰 rna 的转录和蛋白质组学分析和从血小板中提取的蛋白质。我们发现, 用凝血酶激活的纯化血小板比全血小板更有效地结合抗 Gpib/iiia (jonsa) 和抗 p-选择素等抗体。

由于血小板是脆弱的, 重要的是要尽可能温和地对待样品。如果血小板被激活, 它们释放颗粒内的物质, 并最终降解。因此, 为了保持血小板的功能特性完整, 在隔离过程中保持血小板的静止是非常重要的。一些协议描述了通过各种方法^1、10^、11^、12将血小板与人类、狗、^老鼠和^非人类灵长类动物隔离。其中一些方法需要多个步骤, 如通过离心收集富含血小板的血浆, 通过分离柱过滤, 负选择血小板与 rbc-和 wbc 特定抗体共轭磁珠, 等等, 这些步骤是耗时, 并可能降解血小板及其内容物。

福特和他的同事描述血小板纯化从人类血液使用 iohexol 培养基¹¹。这种方法在纯化过程中使用了类似体积的血液样本和培养基。由于人类产生较高的血液量, 因此相对容易净化血小板。

即异己醇是一种通用密度梯度惰性介质, 可自由溶于水, 用于核酸、蛋白质、多糖和核蛋白13、¹⁴的分馏。它具有低渗透性和无毒, 从而成为纯化完整活细胞^{11 的}理想培养基。它是一种非颗粒介质;因此, 细胞在梯度的分布可以用血细胞仪, 流式细胞仪, 或分光光度计来确定。稀释后, 它不会干扰细胞或细胞碎片的大部分酶反应或化学反应。

老鼠是许多人类疾病^{15、16、17、18的重要}动物模型。有发表的一些文章, 描述纯化的小鼠血小板 19^,20。然而, 小鼠产生的血液量相对较小, 这使得血小板难以净化。如果使用相同体积的梯度介质和血液样本, 离心后血小板层不能与 RBC-WBC 层清楚分离。本文介绍了一种快速简便的小鼠血小板纯化方法, 该方法的方法是将异丙醇梯度培养基的三倍以上, 相对于血样体积和低速离心。我们还用凝血酶激活了纯化后的血小板, 并用流式细胞仪和显微镜对其质量进行了研究。

研究方案

老鼠采血应经过适当的机构动物护理和使用委员会的批准。

请注意:血小板纯化协议在图 1中的流程图中进行了描述。

1. 采血

1. 在聚丙烯管中加入25μl 的3.2% 柠檬酸钠 (pH 7.2) 作为抗凝剂, 在聚丙烯管中加入 0.4 mM 的Β-Arg-pro (GPRP)。
2. 利用 c57bl6 小鼠的后眼眶出血收集大约200μl 的血液。
   注:血液可以收集从任何类型的小鼠应变, 无论年龄或性别。
   1. 在任何类型的腔内使用2毫升异氟醚麻醉鼠标。
      请注意:麻醉深度是通过呼吸增加和运动减少的迹象来检查的。小鼠不应该对麻醉室的运动做出反应, 也不应该对被处理的动作做出反应。如果老鼠对运动或处理有反应, 那么它需要更多的时间来保持在麻醉室。
   2. 1.2.2 打开小鼠的右眼皮或左眼皮, 并将7.5 厘米 (直径0.12 厘米) 的毛细血管管插入眼睛的血管丛。
   3. 将毛细管扭转半圈, 同时对毛细管施加压力, 以打破血管并引发血液流动。把动物倒挂在收集的小瓶上, 用毛细管作用填充。
   4. 一旦收集到适当的血量, 取出毛细血管管, 用纱布在眼睑上施加30秒的温和压力, 闭上眼睛。出血停止后, 将鼠标返回其笼子并监测出血情况。
   5. 回顾眼眶后出血后1-2天的外伤。从研究中取出任何表现出因手术而对眼睛造成重大创伤迹象的老鼠, 并实施安乐死。
      请注意:在采血前至少两周内, 小鼠不应接受任何能抑制血小板的治疗。血液样本必须在小鼠出血后一小时内用于血小板净化。

2. 血小板纯化

请注意:血小板净化应在室温下进行, 以防止其降解。确保试剂和仪器的温度在18至22°c 之间。为防止血小板降解, 应避免在手术过程中快速移液和剧烈晃动。

1. 加入600μl 的碘己醇梯度介质 (12% 的碘己醇粉在0.85 氯化钠, 5 mM 三胺, pH 7.2)¹¹到 1.5 ml 管。
2. 在梯度介质顶部的管侧慢慢加入200Μl 的血液样本, 并有一个宽孔移液器的尖端, 使血液和 iohexol 培养基不混合 (图 2a)。
3. 在20°c 下, 在具有缓慢加速和减速的摆动桶转子中, 以 400 x g 的速度离心含有管的样品20分钟。
4. 使用宽孔移液器尖端收集大部分富含血小板的层和一小部分平台差层 (共300至 400μl), 而不会干扰 RBC 和 WBC 层 (图 2B)。将血小板样本转移到新的试管中。
   请注意:如果血小板计数在血液中较少或使用的血液体积较小, 则可以将富含血小板的层和血小板差的层视为单层。
5. 在血小板样品中加入1毫升 PBS, 通过倒置混合, 在20°c 下, 在20°c 下离心机 10分钟, 在摇桶转子中工作10分钟。完全丢弃溶液, 加入200Μl 的 PBS, 用温和的移液重新悬浮血小板。
   请注意:此步骤是可选的, 因为它去除梯度介质和血浆蛋白, 并增加血小板对凝血酶等激动剂的敏感性。由于不同的离心机有不同的程序, 缓慢加速减速可以通过阅读离心机的用户手册来确定。
6. 将这个样品的30Μl 转移到一个新的试管中, 以计算血小板的数量。剩余的血小板可用于生化和生理检测, 如血小板活化、聚集、颗粒释放等。
7. 对于 RNA 或蛋白质提取, 离心血小板样品在 800 x克, 10分钟, 以颗粒血小板。完全丢弃上清液而不干扰颗粒。加入所需的 RNA 或蛋白质裂解缓冲液, 将血小板裂解。

3. 血小板计数

1. 使用自动细胞分析仪对没有稀释和纯化血小板的整个血细胞进行计数 (用 PBS 稀释2至 5倍)。使用30至50μl 样品进行计数。
2. 通过乘以样本量计算血小板的总数。
3. 计算纯化血小板的产率百分比。
4. 用血细胞仪和显微镜对纯化后的血小板样品 (用 PBS 稀释50至 100倍) 中的红细胞和 WBC 进行计数。

4. 血小板活化

1. 在试管中, 在高达100μl 的染色缓冲液中加入1至200万个纯化血小板 (PBS, 含2% 的胎牛血清, FBS)。
2. 对于多个样本数, 用以下 1Μl (0.5 mg/mL) 制作抗体的主混合: PE-CY7 大鼠抗鼠 ter 119、PE 大鼠抗小鼠 CD45、FITC 大鼠抗鼠 CD41 和 apc 大鼠抗鼠 CD62P (p-选择) 检测红细胞、WBC、血小板和分别激活血小板。将主混合物加入管中, 对细胞进行染色。不要添加凝血酶。
3. 在另一种试管中, 在高达100μl 的染色缓冲液中加入100万至200万个纯化的血小板, 并添加 0.4 mM GPRP 肽。添加凝血酶激活血小板, 并在步骤4.2 之后染色细胞。
   请注意:在添加凝血酶之前, 应将 GPRP 添加到样品中, 以防止通过血小板活化形成骨料或凝块。应优化凝血酶浓度, 以获得良好的血小板活化。血小板活化后, 流式细胞仪采集样品时的事件计数减少。
4. 作为阳性对照, 在管中添加1Μl 全血, 在管中添加100μl 染色缓冲液和 0.4 mM GPRP 肽。加入凝血酶激活血小板。作为阴性对照, 在高达100μl 的染色缓冲液中加入1μl 的全血。不要在阴性对照样本中添加凝血酶。按照步骤4.2 对单元格进行染色。
5. 对于流式细胞仪的同型控制, 标签5管与未染色, Pe-cy7, PE, FITC 和 APC。在标记的试管中加入100μl 染色缓冲液、1μl 血液和1μl 的相关抗体, 以染色细胞。
6. 在室温下在黑暗中进行取样, 使其染色30分钟。
7. 在每个试管中加入1毫升的染色缓冲液, 清洗样品。在室温下以 800 x 克离心5分钟。小心丢弃染色缓冲液, 而不丢弃颗粒。
8. 在每个管中加入300μl 的染色缓冲液, 温和混合, 然后转移到流式细胞仪管中。将染色样品存放在黑暗中, 直到用流动细胞仪进行分析。

5. 血小板的流式细胞仪分析

1. 创建一个新的实验, 并生成日志向前散射图与日志侧散点图, 并根据为其选择的门控策略为 Ter119 pe-cy7 (RBC)、CD45 PE (WBC)、CD41 fitc (血小板) 和 CD62P apc (激活血小板) 群分配大门。在流式细胞仪 diva 软件中进行实验。
   1. 通过在"人口" 选项卡下选择"显示人口层次结构"来打开人口层次结构. 通过检查门控策略并正确重命名大门来编辑人口层次结构。
   2. 通过选择"创建统计信息视图"打开统计信息视图。通过右键单击统计信息视图并选择"编辑统计信息视图", 根据用户首选项编辑统计信息视图。
   3. 为每个门选择一种颜色, 通过双击与填充相对应的框, 增强布局的视觉方面。
2. 在 " Cytometer" 窗口中, 单击 "参数" 选项卡并调整参数的电压, 以可视化图上感兴趣的人群。
3. 调整每个参数的电压, 以便将负种群与正群体区分开来。在记录补偿控制的样本之前, 请检查单色阳性控制是否在规模上 (确保正峰是可见的, 而不是对右侧太远)。
   请注意:如果正峰值是不刻度, 电压应调整, 以查看正种群。
4. 记录单色染色单元以进行补偿控制 (未染色、Pe-cy7、PE、FITC 和 APC)。
5. 如果没有正确设置正控制门, 请通过改变电压来调整它们。
6. 转到实验 ≫ 补偿设置 ≫ 计算补偿.在生成的窗口中选择 "仅应用" 。
7. 通过单击工作表窗口左侧顶部的切换按钮切换到全局工作表。
8. 加载正控制样品, 获得足够的细胞来调整补偿和闸门。
9. 再次加载样本, 并检查每个图是否显示了基于氟铬染色抗体的预期细胞群。获取和记录 100, 000个完整血液样本事件和 10, 000个纯化血小板事件。逐一加载样品, 直到完成采集。
10. 使用适当的图和门使用软件分析流式细胞仪数据 (图 3)

结果

血小板纯化的总结在流程图中进行了描述 (图 1)。步骤包括在抗凝剂存在的情况下, 使用反眼眶出血从老鼠身上采集血液, 在 iohexol 梯度介质上添加血液样本, 在 400 x g的摇桶转子中离心 20分钟, 在20°c。用抗体染色后, 用显微镜和流式细胞仪对纯化后的血小板质量进行评价, 以检测任何污染细胞和活化血小板。

如果血液慢慢添加到培养基上, iohexol 梯?...

讨论

通常情况下, 血小板是通过低速离心分离的, 这种离心法产生富含血小板的血浆, 其中含有大量的血细胞、细胞碎片和血浆蛋白, 这些细胞、细胞碎片和血浆蛋白会干扰生化和生理检测和需求进一步净化²¹。因此, 重要的是要使用一种快速和简单的方法, 可以产生纯血小板, 而不会产生主要的污染物。这里介绍的协议描述了使用梯度介质和低速离心从小鼠血液中纯化血小板的方法。该...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin)	Thermoscientific	17-0626-82	Platelets activation marker
Eppendorf tube	Fisher Scientific	14-222-166	Tube for centifuge
FACS DIVA software	BD Biosciences	Non-catalog item	Analysis of platelets and whole blood
FACS tube	Fisher Scientific	352008	Tubes for flow cytomtery
Fetal bovine serum (FBS)	Invitrogen	26140079	Ingredient for staining buffer
FITC rat anti-mouse CD41	BD Biosciences	553848	Platelets marker
Flow cytometer	BD Biosciences	Non-catalog item	Analysis of platelets and whole blood
FlowJo software	FlowJo, Inc.	Non-catalog item	Analysis of platelets and whole blood
Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)	EMD Millipore	03-34-0001	Prevent platelet clot formation
Hematocrit Capillary tube	Fisher Scientific	22-362566	Blood collection capillary tube
Hemavet	Drew Scientific	Non-catalog item	Blood cell analyzer
Hemocytometer	Hausser Scientific	3100	Cell counting chamber
Isoflurane	Baxter	1001936040	Use to Anesthetize mouse
Microscope (Olympus CKX41)	Olympus	Non-catalog item	Cell monitoring and counting
Nycodenz (Histodenz)	Sigma-Aldrich	D2158	Gradient medium
PE rat anti-mouse CD45	BD Biosciences	561087	WBC marker
PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119	BD Biosciences	557853	RBC marker
Pipet tips 200 µL, wide-bore	ThermoFisher Scientific	21-236-1A	Transferring blood and platelet samples
Pipet tips 1000 µL, wide-bore	ThermoFisher Scientific	21-236-2C	Transferring blood and platelet samples
Phosphate buffured saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	14040-117	Buffer for washing and dilution
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Physiological saline
Sodium citrate	Fisher Scientific	02-688-26	Anti-coagulant
Staining buffer	In-house	Non-catalog item	Wash and dilution buffer
Steile water	In-house	Non-catalog item	Solvent
Table top centrifuge	ThermoFisher Scientific	75253839/433607	Swinging bucket rotor centrifuge
Thrombin	Enzyme Research Laboratoty	HT 1002a	Platelet activation agonist
Tricine	Sigma-Aldrich	T0377	Buffer for Nycodenz medium