JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وصفنا بروتين كيناز جديد باستخدام نهج كيميائية حيوية قوية: تحليل وصمة عار الغربية مع الأجسام المضادة مخصصة محددة على خطوط الخلايا المختلفة والأنسجة، والتفاعلات من قبل التجارب coimmunoprecipitation، نشاط كيناز الكشف عن طريق الغربية وصمة عار باستخدام الأجسام المضادة الفوسفاتية محددة وعن طريق γ [32P ] ATP وسم.

Abstract

وقد حددت تسلسل الجينوم كله واسعة النطاق العديد من إطارات القراءة المفتوحة (ORFs) توفير العديد من البروتينات المحتملة. هذه البروتينات قد يكون لها أدوار هامة للخلية، وقد تكشف عن عمليات خلوية جديدة. بين البروتينات, kinases هي الجهات الفاعلة الرئيسية لأنها تنتمي إلى مسارات إشارة الخلية ولها القدرة على تشغيل أو إيقاف العديد من العمليات الحاسمة لمصير الخلية, مثل نمو الخلايا, تقسيم, التمايز, الحركة, والموت.

في هذه الدراسة، ركزنا على بروتين كيناز محتمل جديد، LIMK2-1. لقد أثبتنا وجودها بواسطة بلوت الغربية باستخدام الأجسام المضادة محددة. قمنا بتقييم تفاعلها مع بروتين ما قبل الإنتاج المنظم باستخدام تجارب التهطال المناعية. Coimmunoprecipitation هو تقنية قوية جدا قادرة على الكشف عن التفاعل بين اثنين من البروتينات المستهدفة. ويمكن أيضا أن تستخدم للكشف عن شركاء جدد من بروتين الطعم. يمكن تنقية بروتين الطعم إما عن طريق علامة مصممة لتسلسلها أو عن طريق الأجسام المضادة التي تستهدفه على وجه التحديد. ويمكن بعد ذلك فصل هذه المجمعات البروتينية بواسطة SDS-PAGE (الصوديوم دوديكل كبريتات بولي أكريلاميد هلام) وتحديدها باستخدام الطيف الكتلي. كما تم استخدام LIMK2-1 المناعي لاختبار نشاطكيفي في المختبر عن طريق γ[32P] ATP وسم. وقد يستخدم هذا الخضوع الراسخ العديد من الركيزة المختلفة، ويمكن استخدام نسخ من الطعم المتحولة لتقييم دور المخلفات المحددة. ويمكن أيضا تقييم آثار العوامل الدوائية لأن هذه التقنية هي على حد سواء حساسة للغاية وكمية. ومع ذلك، يتطلب التعامل مع النشاط الإشعاعي الحذر بشكل خاص. ويمكن أيضا تقييم نشاط كيناز مع الأجسام المضادة محددة تستهدف مجموعة فوسفو من الأحماض الأمينية المعدلة. هذه الأنواع من الأجسام المضادة ليست متاحة تجاريا لجميع بقايا الفوسفو المعدلة.

Introduction

على مدى عقود عديدة، تم توضيح العديد من مسارات الإشارات وأظهرت مشاركتها في العمليات الخلوية الحاسمة مثل تقسيم الخلايا، والتمايز، والحركة، وموت الخلايا المبرمجة، والمناعة وعلم الأحياء العصبية. Kinases تلعب دورا هاما في هذه المسارات إشارة كما أنها غالبا ما تنظم بدقة تنشيطها أو تعطيل هات هي جزء من المجمعات متعددة الاستخدامات العابرة التي تستجيب للمحفزات الخارجية1,2,3. الطفرة وخلل التنظيم من الكيناز غالبا ما يؤدي إلى أمراض في البشر، وبالتالي فقد أصبحت واحدة من أهم أهداف المخدرات على مدى السنوات الأربعين الماضية4.

وفي هذا السياق، من المهم أن تكون قادرة على الكشف عن تفاعل الكيناز مع الجهات التنظيمية في المراحل الأولى أو الركيزة النهائية، وتحديد شركاء جدد. تنقية التقارب والمناعية هي تقنيات قوية جدا لعزل مجمعات البروتين5. قد يكون المفتاح البروتين الطعم أو كيناز الموسومة مع تسلسل الببتيد محددة مما يسمح باستخدام الخرز التجاري التكافؤ إلى جانب الأجسام المضادة التي تستهدف الببتيد. هذه المادة تسمح بتكرار عاليةفي التجارب 6،7،8. البروتينات الذاتية قد تكون أيضا ً مناعية باستخدام الأجسام المضادة التي تستهدف مباشرة بروتين الطعم. الأجسام المضادة قد تكون مرتبطة عبر البروتين A أو البروتين G أغروز الخرز أو ببساطة حاضنة مع هذه الخرز قبل إضافة lysate. يجب تحسين المخازن المؤقتة للتحلل للسماح بذوبان البروتين دون فقدان التفاعل وتجنب تدهور البروتين. ومن العيوب الرئيسية لهذا النهج أن التفاعل يتم الكشف عنه عند الخلايا اللايائية؛ ولذلك، قد غاب عن التفاعلات عابرة أو ضعيفة، جنبا إلى جنب مع تلك التي تتطلب السياق دون الخلوي. ويمكن استخدام تقنيات أخرى للعمل مباشرة في الخلية مثل ربط القرب (PLA)9، في الجسم الحي عبر ربط بمساعدة تنقية التقارب (XAP)10، الحيوي الرنين نقل الطاقة (BRET) أو فورستر الرنين الطاقة نقل (FRET)11،12. وعلاوة على ذلك، فإن الترسيب المناعي ليس مناسباً لتحديد الثوابت الديناميكية الحرارية للربط، والتي تتطلب تقنيات فيزيائية مثل "بلازمون السطح" أو قياس المعايرة الحرارية الإسمترية أو الميكرومتراتي 13,14.

ويمكن تقييم نشاط كيناز باستخدام تقنيات متعددة. هنا، ركزنا على الأجسام المضادة الفوسفو محددة وغاما في المختبر[32P] ATP (أدينوسين ثلاثي الفوسفات) وسم. تستهدف الأجسام المضادة الخاصة بالفوسفو تعديل الفوسفات لبقايا معينة داخل البروتين. ويمكن استخدامها في غرب Blot أو ELISA (اختبار المناعة المرتبطة انزيم) بعد تحليل الخلايا، للكيمياء المناعية، وأيضا على الخلايا السليمة باستخدام تدفق الخلايا أو الفلور المناعي. قد تشمل عيوبها افتقارها إلى التحديد، والتي يمكن تقييمها باستخدام نسخة متحولة من البروتين المستهدف، وعدم توافرها تجاريا لجميع البروتينات. في المختبرγ[32P] ATP وسم هو وسيلة قوية جدا، راسخة وحساسة للغاية15. ويمكن استخدام البروتينات المناعية أو المؤتلفة، ويمكن اختبار ركائز مختلفة. ويمكن أيضا تقييم آثار المخدرات لأن هذه الطريقة كمية. والعيب الرئيسي في ذلك هو أن النشاط الإشعاعي المرتبط بهذا النهج يتطلب التعامل بحذر. طرق بديلة ممكنة أيضا على أساس قياس الفلور أو الركيزة الببتيد الإنارة والاستفادة من خصائص الفلورسنت /الانارة المعدلة على الفوسفور. وتتيح هذه الأساليب أيضاً إنتاجية عالية، وهو ما هو مطلوب، على سبيل المثال، في فحص الجزيئات التي قد تكون مثبطات محتملة للكيناز المستهدف. في الواقع، تمثل الكيناز واحدة من أكبر فئات أهداف الأدوية التي تسعى شركات الأدوية16.

في هذه الدراسة، ركزنا على بروتين ليمك2-1 (ليمك2-1 لتقف على Lin11، Isle1، Mec3 Kinase isoform 2-1). تم وصف بروتين كيناز ليمك2 لأول مرة في عام 199517. يتم إنتاج ثلاثة أشكال متساوية من LIMK2 بواسطة الربط البديل: LIMK2a، LIMK2b و LIMK2-1. في الوقت الحاضر، تم وصف LIMK2-1 فقط على مستوى مرنا في دراسة واحدة18. هنا، نحن نميز هذا البروتين كيناز الجديدة المحتملة على المستوى الجزيئي باستخدام النهج البيوكيميائية قوية. أولا، نحن نبرهن على أن LIMK2-1 هو في الواقع توليفها. على غرار نظيراتها اثنين، LIMK2a وLIMK2b، فإنه يتفاعل مع كيناز المنبع روك (رو المرتبطة البروتين كيناز). نظهر LIMK2-1 لديه نشاط كيناز على البروتين الأساسي الميلين (MBP)، ولكن ليس على cofilin، الركيزة الكنسية من كيناز ليم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد خلية للتَنَيَكَل

تحذير: يجب تنفيذ جميع خطوات ثقافة الخلية في مختبر مخصص، ويتم التلاعب بالخلايا داخل خزانة الميكروبيولوجية من الفئة 2.

  1. خلايا الخلايا البذرة HEK-293 (الكلى الجنينية البشرية) في لوحات 10 سم في 10 مل من DMEM (دولبيككو تعديل النسور المتوسطة) تكملها 10٪ مصل عجل الجنين. الثقافة لمدة 3 إلى 5أيام تحت 5٪ ثاني 2، في 37 درجة مئوية، حتى تصل الخلايا إلى ~ 90٪ التقاء.
  2. علاج Ø 10 سم لوحات مع الكولاجين R لزيادة التصاق الخلية إلى لوحات من البلاستيك.
    1. أضف 5 مل من محلول كولاجين R، 200 ضعف مخفف في الفوسفات المالح ة (PBS) في طبق 10 سم. تُسطح السائل على سطح اللوحة بالكامل.
    2. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
    3. إزالة محلول الكولاجين، وتجاهله. إضافة 5 مل من PBS، ونشره في جميع أنحاء سطح لوحة، وإزالتها وتجاهلها. كرر هذا الغسيل مرة واحدة.
    4. أضف 8 مل من DMEM مع 10٪ مصل عجل الجنين. الحفاظ على لوحات أعدت داخل مجلس الوزراء السلامة الحيوية.
  3. خذ لوحات HEK-293 من الخطوة 1.1 داخل خزانة السلامة البيولوجية. إزالة المتوسطة من لوحات وتجاهله في سلة المهملات التبييض مخصصة. إضافة 2 مل من DMEM التكميلية، ومسح الخلايا لفصلها باستخدام تدفق ميكروبليت 1 مل، مع الحرص على تجنب صنع رغوة.
  4. جمع الخلايا في أنبوب 15 مل وإضافة 4 مل من DMEM التكميلية. تجانس مع ماصة 10 مل، عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 3 مرات.
  5. خذ 2 مل من هذا الحل الخلية وإضافتها إلى لوحات الكولاجين المعالجة التي تحتوي على DMEM التكميلية من الخطوة 1.2.4.
  6. تنمو لمدة 24 ساعة في الحاضنة في 5٪ ثاني2 و 37 درجة مئوية. يجب أن تكون الخلايا 50-80% تُتّمّي في وقت التَّتَرَك.

2. التغوط العابر

  1. إزالة المتوسطة من لوحات، وتجاهله في سلة المهملات التبييض مخصصة، وإضافة 10 مل من DMEM الطازجة التكميلية. ضع الصفائح مرة أخرى في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية أثناء تحضير خليط الامتصاص.
  2. في أنبوب 15 مل، إضافة 450 μL من 10 m تريس-HCl درجة الحموضة 7.5/1 M EDTA (ثلاثي ة لتقف على ثلاثي (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان، وEDTA لحمض الاثيلين) و 50 μL من 2.5 M CaCl2 الحل. مزيج عن طريق الانعكاس.
  3. إضافة 10 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي (حمض ديوكسيريبونوكليك) أعدت من إعداد ميدي على ثقافة سائلة من البكتيريا التي تحولت مع البلازميد مخصصة. مزيج عن طريق الانعكاس.
  4. تحت التحريك السلس على دوامة، إضافة 500 ميكرولتر من BES المخزنة 2x التركيز المالحة (التركيب: BES، 10.7 غرام / لتر، كلوريد الصوديوم، 16.0 غرام / لتر، Na2HPO4،0.27 ز / لتر. BES لتقف على N، N-Bis(2-هيدروكسيإثيل)-2-أمينوإيثانسلفونيتش حمض، N، N-Bis(2-هيدروكسيإيثيل)تورين) انخفاض ببطء عن طريق قطرة.
  5. احتضان لمدة 15 دقيقة على الأقل (تصل إلى 45 دقيقة) في درجة حرارة الغرفة داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. لا دوامة، لا تخلط! نقل الأنابيب بعناية فائقة لا لزعزعة تشكيل معقدة بين الحمض النووي وفوسفات الكالسيوم.
  6. خذ اللوحات من الخطوة 2.1 إلى خزانة الأمان. إضافة مجمعات الحمض النووي بعناية فائقة، قطرة قطرة، على الخلايا في جميع أنحاء سطح اللوحة.
  7. احتضان لمدة 24 إلى 72 ساعة في الحاضنة في 37 درجة مئوية. عادة ما يتم الوصول إلى الحد الأقصى للتعبير البروتين في غضون 48 ساعة.

3. الليسه

ملاحظة: العمل على الجليد، ومع المخازن المؤقتة الباردة لمنع تدهور البروتين.

  1. إعداد العازلة lysis: 50 m Tris-HCl، درجة الحموضة 7.5، 100 mM NaCl، 5 mEDTA، 0.1٪ تريتون X-100، 50 m NaF، 10 mm الصوديوم بيروفوسفات، 1 م نا3VO4،20 m-الفوسفات p-nitrophenyl، 20 مللي أمبير-غليسيروفوسفات، 10 ميكروغرام / مل aprotinin، 0.05 ميكروغرام / مل حمض الأوكليك ، 1 ميكروغرام /مل ليوبيبتين، و 1 مللي م PMSF (فلوريد ميثيل سلفونيل). مطلوب حوالي 4 مل من العازلة lysis لكل لوحة المنقولة.
  2. إزالة لوحات مع الخلايا المنقولة من الحاضنة. ضعهم على الجليد
    ملاحظة: من هذه الخطوة، فمن الممكن العمل على "عادي" مقاعد البدلاء.
  3. إزالة وسائل الإعلام، وتجاهلها في سلة المهملات التبييض مخصصة.
  4. غسل مرتين مع 3 مل من PBS الباردة: إضافة 3 مل من PBS على جانب لوحة قطرة قطرة لتجنب فصل الخلايا المصابة، تنتشر في جميع أنحاء سطح اللوحة، وإزالة PBS وتجاهله؛ كرر هذه الخطوة مرة أخرى. في النهاية، إزالة بعناية بقية PBS عن طريق إمالة لوحة لمنع تخفيف العازلة lysis للخطوة التالية.
  5. إضافة 500 μL من العازلة lysis الباردة على الخلايا المغسولة المنقولة. نشره في جميع أنحاء سطح اللوحة.
  6. احتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد. من وقت لآخر (مرتين على الأقل)، انتشرت مرة أخرى في العازلة في جميع أنحاء سطح اللوحة.
  7. الخردة الخلايا وجمعها في أنبوب ميكروسينترال.
  8. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 10000 x غ عند 4 درجة مئوية.
  9. جمع supernatant في أنبوب microcentrifuge جديد. هذا الكسر يتوافق مع الليسات (استخراج الخلية بأكملها). تخلص من بيليه الذي يتوافق مع الحطام غشاء الخلية.
  10. جمع a aliquot من هذا الجزء إلى أنبوب microcentrifuge جديد (حوالي 50 ميكرولتر). هذا الكسر يتوافق مع "جزء المجموع" أو "خلية Lysate" أو "استخراج الخلية الكاملة" مما يسمح بتحليل ما إذا كان يتم التعبير عن البروتينات المنقولة من قبل وصمة عار الغربية.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن استخدام العينات مباشرة لتحليلات وصمة عار الغربية. ويجب إضافة حاجز Laemmli إلى العينة، ثم تسخينها عند درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، والطرد المركزي في 10000 x g لمدة 5 دقائق، وتحميلها على SDS-PAGE المناسبة. ويمكن أيضا تخزين عينات في -80 درجة مئوية.

4. المناعية الترسيب

  1. بلطف اوقف خرز أجاروز إلى جانب الأجسام المضادة المناسبة: HA (هيماغلوتينين الأنفلونزا البشرية)، العلم، أو GFP (البروتين الفلورسنت الأخضر) عن طريق عكس سلس.
  2. قطع نهاية طرف 200 ميكروبليت ميكروبليت للسماح الخرز لدخول طرف. ماصيت الخرز صعودا وهبوطا عدة مرات لتشبع غيض لضمان اتخاذ الحجم الصحيح من الخرز.
  3. خذ 40 ميكرولتر من الخرز في أنبوب ميكروسينترال.
  4. إضافة 500 ميكرولتر من TENET (30 m Tris-HCl درجة الحموضة 7.5، 120 mM كلوريد الصوديوم، 5 m EDTA، 1٪ تريتون X-100) العازلة. مزيج عن طريق الانعكاس. جهاز طرد مركزي لمدة 2 دقيقة عند 1000 x غرام عند 4 درجة مئوية. إزالة بعناية supernatant وتجاهله. إضافة 500 μL من TENET. تحضن لمدة ساعة على الأقل عند 4 درجة مئوية على عجلة دوارة.
    ملاحظة: هذه الخطوة قبل الحضانة في TENET يسمح للحد من التفاعلات غير محددة وذلك لتقليل إشارة الخلفية.
  5. غسل الخرز مرتين مع 500 μL من العازلة lysis.
    1. جهاز طرد مركزي 2 دقيقة عند 1000 x غرام عند 4 درجة مئوية.
    2. إزالة العازلة supernatant بعناية، وتجاهله.
      ملاحظة: الحرص على عدم ازهب الخرز خلال هذه الخطوات الغسيل.
    3. إضافة 500 μL من العازلة lysis. تجانس عن طريق عكس الأنبوب.
    4. كرر الخطوات 4.5.1- 4.5.3.
  6. جهاز طرد مركزي لمدة 2 دقيقة عند 1000 x غرام عند 4 درجة مئوية. إزالة العازلة supernatant بعناية، وتجاهله.
  7. تحنيب الخرز مع lysate من الخطوة 3.9 لمدة 2 إلى 4 ساعات في 4 درجة مئوية على عجلة الدورية.
  8. غسل الخرز المناعي.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، قد يتم غسل الخرز المناعي خمس مرات مع العازلة lysis، ومن ثم eluted مع العازلة Laemmli. ويمكن استخدام الإيلوت لتحليل البقعة الغربية أو تخزينها عند -80 درجة مئوية. بدلا من ذلك، يمكن غسل الخرز مرتين مع العازلة lysis ثم ثلاث مرات مع العازلة كيناز لأداء γ[32P] ATP وسم.

5 - تحليلات التهطال المناعية

  1. غسل الخرز المناعي من الخطوة 4.7 مع العازلة lysis.
    1. جهاز طرد مركزي لمدة 2 دقيقة عند 1000 x غ في جهاز طرد مركزي مبرد عند 4 درجة مئوية.
    2. إزالة بعناية supernatant، وتجاهله.
    3. إضافة 500 μL من العازلة lysis. تجانس عن طريق عكس الأنبوب.
    4. كرر الخطوات من 5.1.1 إلى 5.1.3 أربع مرات.
  2. الأوتيون
    1. جهاز طرد مركزي لمدة 2 دقيقة عند 1000 x غ في جهاز طرد مركزي مبرد عند 4 درجة مئوية.
    2. إزالة بعناية supernatant، وتجاهله. إزالة قطرات الأخيرة من supernatant مع حقنة هاملتون من أجل تجنب الطموح من الخرز، وتجاهل supernatant.
    3. أضف 40 ميكرولتر من العازل العازل لـ 4x Laemmli (200 m Tris/HCl pH 6.8, 4% SDS, 40% الجلسرين, 0.5 مليون β-mercaptoethanol, 0.02% بروموفينول الأزرق). تجانس عن طريق التنصت بلطف على أنبوب.
    4. تحضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    5. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق في 10000 x ز في درجة حرارة الغرفة.
    6. مع حقنة هاملتون، وإزالة supernatant وجمعها في أنبوب ميكروسينترال الجديد. هذا الكسر يتوافق مع "Eluate"، والتي يمكن تخزينها عند -80 درجة مئوية، أو تحليلها مباشرة من قبل Blot الغربية.

6. تقييم كيناز

  1. إعداد العازل كيناز: 50 m HEPES-NAOH درجة الحموضة 7.5 (HEPES ل4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1-بيبيرازين إيثانسولفولفينيك حمض)،150 مل كلوريد الصوديوم، 5 m MgCl 2، 5 mM MM MnCl2،50 mM NaF، 1 م Na3VO4،20 مللي م β-غليسيروفوسفات، 1 ميكروغرام/ مل الليبيبتين، و 1 m PMSF. مطلوب حوالي 2 مل من العازل كيناز لكل حالة من امنالترسيب.
  2. غسل الخرز المناعي من الخطوة 4.7 مرتين مع 500 μL من العازلة lysis.
    1. جهاز طرد مركزي لمدة 2 دقيقة عند 1000 x غ في جهاز طرد مركزي مبرد عند 4 درجة مئوية.
    2. إزالة بعناية supernatant، وتجاهله. إضافة 500 μL من العازلة lysis. تجانس من قبل الانعكاس.
    3. كرر الخطوات 6.2.1 و 6.2.2.
  3. غسل الخرز المناعي ثلاث مرات مع 500 ميكرولتر من العازلة كيناز.
    1. جهاز طرد مركزي لمدة 2 دقيقة عند 1000 x غ في جهاز طرد مركزي مبرد عند 4 درجة مئوية.
    2. إزالة بعناية supernatant، وتجاهله. إضافة 500 μL من الكيناز المخزن المؤقت. تجانس من قبل الانعكاس.
    3. كرر الخطوات 6.3.1 و 6.3.2 مرتين.
  4. جهاز طرد مركزي لمدة 2 دقيقة عند 1000 x غ في جهاز طرد مركزي مبرد عند 4 درجة مئوية.
  5. إزالة بعناية supernatant، وتجاهله. إزالة قطرات الأخيرة من supernatant مع حقنة هاملتون من أجل تجنب الطموح من الخرز، وتجاهل supernatant.
  6. إضافة 40 μL من الكيناز العازلة إلى الخرز المناعي. إعادة تعليق الخرز عن طريق التنصت بلطف على أنبوب.
  7. إعداد المزيج لγ[32P] ATP وسم (حجم النهائي هو 22.5 μL، كاملة مع العازلة كيناز) في قفل آمن أنبوب.
    1. إضافة حجم المطلوبة من الكيناز المخزن المؤقت للوصول إلى حجم نهائي من 22.5 μL.
    2. قطع نهاية طرف 20 ميكروبوريت ميكروبولتر. إعادة تعليق الخرز المناعي من الخطوة 6.6 عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات. جمع 10 μL من هذه الخرز في أنبوب قفل آمن.
    3. أضف ATP من محلول مخزون 10 μM للوصول إلى 50 m M من تركيز النهائي. وفقا لعدد من عينة تعامل، ويقترح تخفيف محلول الأسهم من ATP في العازلة كيناز للسماح للماصة 1 إلى 2 ميكرولتر، للتأكد من أن حجم صحيح.
    4. إضافة 2.5 ميكروغرام من الركيزة (الكوفيلين أو البروتين الأساسي الميلين، MBP في حالة الدراسة الحالية).
  8. إضافة 5 μCiمن γ[32 P] ATP (3,000 Ci/mmol) لبدء رد الفعل. مزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا ببطء.
    تحذير: من هذه النقطة، يجب القيام بالعمل في مكان آمن مخصص للتلاعب بالنشاط الإشعاعي مع الاحتياطات الحذرة، والحماية المخصصة والضوابط المناسبة (الدروع المشعة، عداد جيجر، وجمع النفايات المحددة، والثدي الشخصية و شارات الأصابع للكشف عن التعرض للإشعاع، نصائح التصفية).
  9. احتضان لمدة 20 دقيقة في 30 درجة مئوية.
  10. إيقاف رد الفعل مع 6 μL من 5X العازلة Laemmli.
  11. الحرارة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  12. جهاز طرد مركزي في 10000 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  13. تحميل على صفحة SDS. انتقل إلى الهجرة.
    ملاحظة: الحرص على أن الخط الأمامي من γ الحرة[32P] ATP لا يخرج من هلام لتجنب تلوث خزان الهجرة.
  14. وصمة عار على الجل في درجة حرارة الغرفة.
    1. إزالة الجل من لوحات الزجاج.
    2. المضي قدما مع ثلاثة حمامات في الماء في درجة حرارة الغرفة.
    3. وصمة عار هلام بين عشية وضحاها مع Coomassie الأزرق في درجة حرارة الغرفة.
    4. اللطال مع عدة حمامات غسل مع الماء في درجة حرارة الغرفة.
  15. لف الجل بغلاف بلاستيكي.
  16. كشف لليلة واحدة أو أكثر على شاشة فسفوريمسر.
  17. قراءة الشاشة على phosphorimager للكشف عن العصابات المسماة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يتم توليف البروتين LIMK2-1
[ليمك2-1] ذكرت في [دتبنك], غير أنّ [س فر] فقط واحدة ورقة قد أبدى الوجود من ه [مرنا]18. بالمقارنة مع اثنين من homologs، ليمك2a وLIMK2b، ليمك2-1 لديه مجال C-محطة إضافية محددة كمجال البروتين فوسفاتاز 1 المثبطة (PP1i). صممنا جسم مضاد يستهدف ببتيد من ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هنا، استخدمنا أدوات كيميائية حيوية قوية لوصف على المستوى الجزيئي بروتين جديد، LIMK2-1، ويعتقد أن يكون كيناز على أساس تسلسلها وعلى homologs لها، LIMK2a و LIMK2b20.

أولا، أظهرنا وجود LIMK2-1 على مستوى البروتين باستخدام تحليل وصمة عار الغربية مع الأجسام المضادة محددة. بعد ذلك، قمن...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل رابطة مكافحة السرطان، ورابطة الأورام العصبية الليفية وريكلينغهاوزن، ومركز لا ريجيون فال دي لوار. شكراجزيلا لأوريلي كوسون وديبورا كاساس لبيانات قياس التدفق السيتومتري، وإلى كيرون هيكمان لويس لتنقيح المخطوطة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibody anti-actinSigma-AldrichA1978for Western Blot
Antibody anti-c-MycInvitrogenMA1-21316for Western Blot
Antibody anti-cofilinCell signaling Technology3312/5175for Western Blot
Antibody anti-GFPSanta Cruzsc-9996for Western Blot
Antibody anti-HARoche Applied Science11687423001for Western Blot
Antibody anti-phospho-cofilinCell signaling Technology3313for Western Blot
Antibody Anti-PP1iEurogentecdesigned for this studyfor Western Blot
AprotininEuromedexA-162Bfor lysis buffer
ATPInvitrogenPV3227for γ[32P] labeling
γ[32P] ATPPerkin ElmerNEG502Afor γ[32P] labeling
BES buffered salineSigma-Aldrich14280for transfection
β-glycerophosphateSigma-AldrichG9422for lysis and kinase buffer
β-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148for Laemmli
BSASigma-AldrichA3059for blocking buffer
Bromophenol BlueSigma-AldrichB0126for Laemmli
CaCl2Sigma-AldrichC3881for transfection
CentrifugeSigma111-541
Collagen RPan BiotechP06-20166for transfection
Control siRNAAmbionAM4611for PP1i antibody specificity
Coomassie PageBlue Protein Staining SolutionThermo-Fisher24620for gel staining
EDTASigma-Aldrich3690for lysis buffer
Electrophoresis UnitBioradMini-Proteanfor Western Blot
EZview Red anti-HA affinity gelSigma-AldrichE6779for immunoprecipitation
GeneSys softwareOzymefor Western Blot acquisition
GeneTolls softwareOzymefor Western Blot quantification
GFP-trap beadsChromtekfor immunoprecipitation
GlycineEuromedex26-128-6405for transfer buffer
GST-cofilinUpstate Cell signaling12-556for γ[32P] labeling
Hamilton syringe 100 mLHamilton710to remove carefully supernatant from beads without aspirating them
HEPESSigma-AldrichH3375for kinase buffer
ImageQuant TL softwareGE Healthcarefor radioactivity acquisition and quantification
LIMK2 siRNAAmbions8191for PP1i antibody specificity
LeupeptinSigma-AldrichSP-04-2217for lysis and kinase buffer
MBPUpstate Cell signaling13-173for γ[32P] labeling
MgCl2Sigma-AldrichM8266for kinase buffer
MnCl2Sigma-Aldrich244589for kinase buffer
NaClEuromedex1112for lysis and kinase buffer
NaFSigma-AldrichS-1504for lysis and kinase buffer
Okaidic acidEuromedex0-2220for lysis buffer
PMSFSigma-Aldrich78830for lysis and kinase buffer
p-nitrophenylphosphateEuromedex1026for lysis buffer
PVDF membrane Immobillon-PMerck-MilliporeIPVH00010 pore size 0,45 mmfor Western Blot
Rotating wheelLabincofor bead incubation
Safe lock eppendorfEppendorf0030120.086for kinase assay
SDSSigma-Aldrich5030for Laemmli and migration buffer
Sodium orthovanadateLC LaboratoriesS8507for lysis and kinase buffer
Sodium pyrophosphateFluka71501for lysis buffer
Super Signal West DuraProtein Biology34075for Western Blot
Syngene PxiOzymefor Western Blot
Tissue extracts

 		Biochain

 		P1234035 Brain
P12345152 Lung
P1234149 Liver
P1234188 Pancreas
P1234260 Testis		for Western Blot analysis

 
Transfer UnitBioradMini-Trans-Blotfor Western Blot
TrisEuromedex26-128-3094 Bfor lysis buffer
Tween-20Sigma-AldrichP7949for blocking buffer
Typhoon FLA9500GE Healthcareto read autoradiography
Typhoon TrioAmersham Bioscienceto read autoradiography
Whatman paperGE Healthcare3030-672for Western Blot

References

  1. Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).
  2. Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. 298, Science. New York, N.Y. 1912-1934 (2002).
  3. Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling. Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).
  4. Bhullar, K. S., et al. Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions. Molecular Cancer. 17, 48(2018).
  5. Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, Clifton, N.J. 349-364 (2008).
  6. Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).
  7. Wood, D. W. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).
  8. Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).
  9. Greenwood, C., et al. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
  10. Wang, X., Huang, L. Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1844, Clifton, N.J. 401-410 (2018).
  11. Raykova, D., et al. Let There Be Light! Proteomes. 4, (2016).
  12. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).
  13. Podobnik, M., et al. How to Study Protein-protein Interactions. Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).
  14. Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648(2014).
  15. Peck, S. C. Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).
  16. Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format. Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).
  17. Okano, I., et al. Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs. The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).
  18. Croft, D. R., et al. p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton. Cell Research. 21, 666-682 (2011).
  19. Tastet, J., et al. LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability. Neuroscience. 399, 199-210 (2019).
  20. Vallee, B., et al. LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b. The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).
  21. Lee, Y. C., et al. Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation. Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

148 32 P ATP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved