Caracterização no nível molecular usando abordagens bioquímicas robustas de uma nova proteína quinase

Resumo

Nós caracterizamos uma proteína nova da quinase usando aproximações bioquímicas robustas: análise ocidental do borrão com um anticorpo específico dedicado em linhas e em tecidos diferentes da pilha, interações por experimentos do coimmunoprecipitação, atividade da quinase detectada por ocidental Blot usando um anticorpo fosho-específico e por γ [³²P] rotulagem ATP.

Resumo

O sequenciamento do genoma inteiro extenso identificou muitos quadros de leitura abertos (ORFs) que fornecem muitas proteínas potenciais. Estas proteínas podem ter papéis importantes para a célula e podem desvendar novos processos celulares. Entre as proteínas, as cinases são atores principais como eles pertencem a vias de sinalização celular e têm a capacidade de ligar ou desligar muitos processos cruciais para o destino da célula, como o crescimento celular, divisão, diferenciação, motilidade, e morte.

Neste estudo, nós focamos em uma proteína potencial da quinase nova, LIMK2-1. Nós demonstramos sua existência por Western blot usando um anticorpo específico. Nós avaliamos sua interação com uma proteína de regulamento ascendente usando experimentos da coimunoprecipitação. A coimunoprecipitação é uma técnica muito poderosa capaz de detectar a interação entre duas proteínas alvo. Ele também pode ser usado para detectar novos parceiros de uma proteína de isca. A proteína da isca pode ser purificada quer através de uma etiqueta projetada para sua seqüência ou através de um anticorpo especificamente direcioná-lo. Estes complexos proteicos podem então ser separados por SDS-PAGE (gel de PolyAcrylamide do sulfato do Dodecyl do sódio) e identificados usando a espectrometria maciça. Immunoprecipitated LIMK2-1 foi usado igualmente para testar sua atividade da quinase in vitro pela rotulagem do ATP de γ [³²P]. Este ensaio bem estabelecido pode usar muitos substratos diferentes, e versões mutadas da isca podem ser usadas para avaliar o papel de resíduos específicos. Os efeitos dos agentes farmacológicos também podem ser avaliados, uma vez que esta técnica é altamente sensível e quantitativa. No entanto, o manuseio de radioatividade requer cautela especial. A atividade da quinase pode igualmente ser avaliada com os anticorpos específicos que visam o grupo do phospho do aminoácido modificado. Estes tipos de anticorpos não estão disponíveis comercialmente para todos os resíduos de fosho modificados.

Introdução

Durante muitas décadas, inúmeras vias de sinalização foram elucidadas e seu envolvimento em processos celulares cruciais, como divisão celular, diferenciação, motilidade, morte celular programada, imunidade e neurobiologia, tem sido demonstrado. As quinases desempenham um papel significativo nessas vias de sinalização, pois muitas vezes regulam finamente sua ativação ou inativação e fazem parte de complexos versáteis transitórios que respondem a estímulos externos^1,2,3. A mutação e o desregulação das quinases conduzem frequentemente às doenças nos seres humanos, e tornaram-se conseqüentemente um dos alvos os mais importantes da droga sobre os 40 anos passados⁴.

Neste contexto, é importante ser capaz de detectar a interação quinase com seus reguladores upstream ou substratos a jusante e identificar novos parceiros. A purificação de afinidade e a imunoprecipitação são técnicas muito poderosas para o isolamento de complexos proteicos⁵. A proteína ou quinase da isca pode ser etiquetada com uma seqüência específica do peptide permitindo o uso de grânulos comerciais covalentemente acoplado com os anticorpos que alvejam o peptide. Este material permite uma alta reprodutibilidade em experimentos^6,7,8. As proteínas endógenas também podem ser imunoprecipitadas usando anticorpos direcionados diretamente à proteína de isca. Os anticorpos podem ser reticulados aos grânulos de agarose da proteína A ou da proteína G ou simplesmente incubado com estes grânulos antes de adicionar o lysate. Os buffers de Lise devem ser otimizados para permitir a solubilização de proteínas sem perder a interação e evitar a degradação da proteína. Uma desvantagem principal desta aproximação é que a interação está detectada em cima da lise da pilha; Conseqüentemente, as interações transientes ou fracas, junto com aquelas que exigem o contexto subcellular podem ser perdidas. Outras técnicas podem ser usadas para trabalhar diretamente na célula, como o ensaio de ligadura de proximidade (PLA)⁹, a purificação de afinidade assistida por ligação cruzada in vivo (xap)¹⁰, transferência de energia de ressonância de BIOLUMINESCÊNCIA (BRET) ou energia de ressonância de Förster Transferência (fret)^11,12. Além disso, a imunoprecipitação não é apropriada para determinar as constantes termodinâmicas da ligação, para as quais são necessárias ^{técnicas físicas como ressonância Plasmon superficial, Calorimetria de Titulação Isotérmica ou Termoforese em microescala 13,14}.

A atividade da quinase pode ser avaliada usando várias técnicas. Nisto, nós focamos em anticorpos phospho-específicos e in vitro γ [³²P] ATP (triphosphate de adenosina) que etiquetam. Os anticorpos phospho-específicos alvejar a modificação do fosfato de um resíduo particular dentro de uma proteína. Podem ser usados no borrão ocidental ou no ELISA (ensaio enzima-lig de ImmunoSorbent) após o lysis da pilha, para immunohistochemistry, e igualmente em pilhas intactas usando a citometria ou a imunofluorescência do fluxo. Suas desvantagens podem incluir sua falta de especificidade, que pode ser avaliada usando uma versão mutada da proteína alvo, e sua não estar disponível comercialmente para todas as proteínas. In vitro γ [³²P] a rotulagem ATP é um método muito robusto, bem estabelecido e altamente sensível¹⁵. Proteínas imunoprecipitadas ou recombinantes podem ser usadas, e diferentes substratos podem ser testados. Os efeitos das drogas também podem ser avaliados, pois esse método é quantitativo. Sua principal desvantagem é que a radioatividade associada à abordagem requer manuseio com cautela. Os métodos alternativos são igualmente possíveis baseados na medida de substratos fluorescentes ou luminescentes do peptide e aproveitando-se de propriedades fluorescentes/luminescentes alteradas em cima do phosphorylation. Tais métodos também permitem alta taxa de transferência, o que é necessário, por exemplo, na triagem de moléculas que podem ser potenciais inibidores da quinase-alvo. De fato, as quinases representam uma das maiores classes de alvos de drogas perseguidos pelas empresas farmacêuticas¹⁶.

Neste estudo, nós focamos na proteína LIMK2-1 (LIMK2-1 significa Lin11, Isle1, Mec3 isoforma da quinase 2-1). A proteína da quinase LIMK2 foi descrita pela primeira vez em 1995¹⁷. Três isoformas de LIMK2 são produzidas por splicing alternativo: LIMK2a, LIMK2b e LIMK2-1. Presentemente, LIMK2-1 foi descrito somente no nível do mRNA em um único estudo¹⁸. Nisto, nós caracterizamos esta proteína nova potencial da quinase no nível molecular usando aproximações bioquímicas robustas. Em primeiro lugar, demonstramos que LIMK2-1 é de fato sintetizado. Semelhante às suas duas contrapartes, LIMK2a e LIMK2b, interage com a quinase ascendente ROCK (proteína quinase associada a Rho). Nós mostramos LIMK2-1 tem uma atividade da quinase na proteína básica de myelin (MBP), mas não no cofilin, o substrato canônico de LIM kinases.

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Protocolo

1. preparação da pilha para o transfection

Cuidado: todas as etapas da cultura da pilha devem ser executadas em um laboratório dedicado, e as pilhas são manipuladas dentro de um armário microbiológico da classe 2.

1. Semente HEK-293 (rim embrionário humano) células em placas de Ø 10 cm em 10 mL de DMEM (Dulbecco ' s Modified Eagles médio) suplementado com 10% de soro de bezerro fetal. Cultura para 3 a 5 dias 5% CO₂, em 37 ° c, até que as pilhas alcancem a confluência de ~ 90%.
2. Trate as placas do Ø 10 cm com colagénio R para aumentar a adesão da pilha às placas plásticas.
   1. Adicionar 5 mL de uma solução de colágeno R, 200 vezes diluído em tampão salino de fosfato (PBS) numa placa de Ø 10 cm. Sobreponha o líquido sobre toda a superfície da chapa.
   2. Incubar à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h no armário de biossegurança.
   3. Remova a solução de colágeno e descarte-a. Adicionar 5 mL de PBS, espalhá-lo por toda a superfície da placa, removê-lo e descartá-lo. Repita esta lavagem uma vez.
   4. Adicione 8 mL de DMEM suplementado com o soro fetal da vitela de 10%. Mantenha as placas preparadas dentro do gabinete de biossegurança.
3. Tome HEK-293 placas da etapa 1,1 dentro do gabinete de biossegurança. Retire o meio das placas e descarte-o em um lixo de lixívia dedicado. Adicionar 2 mL de DMEM suplementado, e lave as células para desanexá-los usando o fluxo de uma micropipeta de 1 mL, tendo o cuidado de evitar fazer espuma.
4. Colete as células em um tubo de 15 mL e adicione 4 mL de DMEM suplementado. Homogeneizar com uma pipeta de 10 mL, pipetando para cima e para baixo 3 vezes.
5. Tome 2 mL desta solução da pilha e adicione-as às placas colagénio-tratadas que contêm DMEM suplementado da etapa 1.2.4.
6. Cresça por 24 horas na incubadora em 5% CO₂ e 37 ° c. As células devem ser 50-80% confluentes no momento da transfecção.

2. Transfections transientes

1. Remova o meio das placas, descarte-o em um lixo de lixívia dedicado e adicione 10 mL de DMEM recém-suplementado. Põr para trás as placas na incubadora em 37 ° c ao preparar a mistura do transfection.
2. Em um tubo de 15 mL, adicione 450 μL de um EDTA de 10 mM Tris-HCl pH 7,5/1 mM (Tris significa tris (hidroximetil) aminometano, e EDTA para ácido etilenedinitrilotetraacético) solução e 50 μL de uma solução de 2,5 M CaCl₂ . Misture por inversão.
3. Adicionar 10 μg de DNA plasmídico (Ácido desoxirribonucleico) preparado a partir de uma preparação MIDI em uma cultura líquida de bactérias transformadas com o plasmídeo dedicado. Misture por inversão.
4. agitação suave em um Vortex, adicione 500 μL de concentrado de soro fisiológico tamponado de BES (composição: BES, 10,7 g/L, NaCl, 16,0 g/L, na₂HPO₄, 0,27 g/l; BES representa N, N-bis (2-Hydroxyethyl)- -2-aminoetanoesulfonic ácido, N, N-bis (2-Hydroxyethyl) taurine) lentamente gota a gota.
5. Incubar durante pelo menos 15 min (até 45 min) à temperatura ambiente dentro do gabinete de biossegurança. Não vórtice, não misture! Mova os tubos com muito cuidado para não perturbar a complexa formação entre DNA e fosfato de cálcio.
6. Leve as placas da etapa 2,1 para o gabinete de segurança. Adicione os complexos de DNA com muito cuidado, gota a gota, para as células em toda a superfície da placa.
7. Incubar por 24 a 72 horas na incubadora em 37 ° c. Geralmente a expressão máxima da proteína é alcançada dentro de 48 horas.

3. lise

Nota: trabalhe no gelo, e com amortecedores frios para impedir a degradação da proteína.

1. Prepare o tampão de Lise: 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50 mM NaF, 10 mM pirofosfato de sódio, 1 mM na₃vo₄, 20 mm p-nitrofenil fosfato, 20 mm β-glicerofosfato, 10 μg/ml aprotinina, 0, 5 μg/ml de ácido okaidic , 1 μg/mL de leupeptina e 1 mM de PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonilo). Cerca de 4 mL de tampão de Lise são necessários para cada placa transfected.
2. Retire as placas com células transfectadas da incubadora. Coloque-os no gelo.
   Nota: a partir desta etapa, é possível trabalhar em um banco "normal".
3. Remova a mídia e descarte-a em um lixo de lixívia dedicado.
4. Lave duas vezes com 3 mL de PBS frio: Adicionar 3 mL de PBS no lado da placa gota a gota para evitar a desanexação de células transfectadas, espalhados por toda a superfície da placa, remover PBS e descartá-lo; Repita esta etapa mais uma vez. No final, Retire cuidadosamente o resto da PBS inclinando a placa para evitar a diluição do tampão de Lise para o próximo passo.
5. Adicionar 500 μL de tampão de Lise a frio nas células lavadas transfectadas. Espalhá-lo por toda a superfície da placa.
6. Incubar por 10 min no gelo. De tempos em tempos (pelo menos duas vezes), espalhe novamente o tampão em toda a superfície da placa.
7. Sucata as células e recolhê-los em um tubo de microcentrífuga.
8. Centrifugador por 10 min a 10.000 x g a 4 ° c.
9. Colete sobrenadante em um novo tubo de microcentrífuga. Esta fração corresponde ao lisado (extrato de células inteiras). Descarte o pellet que corresponde aos detritos da membrana celular.
10. Colete uma alíquota desta fração para um novo tubo de microcentrífuga (cerca de 50 μL). Esta fração corresponde à "fração TOTAL" ou "lisado de células" ou "extrato de células inteiras", permitindo a análise de se as proteínas transfectadas são expressas por Western Blot.
    Nota: neste ponto, as amostras podem ser usadas diretamente para análises Western Blot. O tampão de Laemmli deve ser adicionado à amostra, que é aquecida então em 95 ° c por 5 minutos, centrifugada em 10.000 x g por 5 minutos, e carregada no SDS-PAGE apropriado. As amostras também podem ser armazenadas em-80 ° c.

4. imunoprecipitação

1. Gentilmente ressuscitem grânulos de agarose juntamente com o anticorpo apropriado: HA (hemaglutinina da gripe humana), bandeira, ou GFP (proteína fluorescente verde) por inversão suave.
2. Corte a extremidade de uma ponta de 200 μL de uma micropipeta para permitir que os grânulos entrem na ponta. Pipeta as contas para cima e para baixo várias vezes para saturar a ponta para garantir a tomar o volume correto de grânulos.
3. Tome 40 μL de grânulos em um tubo de microcentrífuga.
4. Adicionar 500 μL de TENET (30 mM Tris-HCl pH 7,5, 120 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100) tampão. Misture por inversão. Centrifugador por 2 min a 1.000 x g a 4 ° c. Retire cuidadosamente o sobrenadante e descarte-o. Adicionar 500 μL de TENET. Incubar durante pelo menos 1 hora a 4 ° c numa roda rotativa.
   Nota: esta etapa de pré-incubação no TENET permite reduzir interações não específicas e assim diminuir o sinal de fundo.
5. Lave os grânulos duas vezes com 500 μL de tampão de Lise.
   1. Centrifugar 2 min a 1.000 x g a 4 ° c.
   2. Remova cuidadosamente o buffer de sobrenadante e descarte-o.
      Nota: Tome cuidado para não aspirar grânulos durante estes passos de lavagem.
   3. Adicionar 500 μL de tampão de Lise. Homogeneizar invertendo o tubo.
   4. Repita os passos 4.5.1-4.5.3.
6. Centrifugador por 2 min a 1.000 x g a 4 ° c. Remova cuidadosamente o buffer de sobrenadante e descarte-o.
7. Incubar grânulos com o lisado da etapa 3,9 por 2 a 4 horas em 4 ° c em uma roda de giro.
8. Lave os grânulos Immunoprecipitated.
   Nota: neste ponto, os grânulos Immunoprecipitated podem ser lavados cinco vezes com o tampão do lysis, e então eluída com tampão de Laemmli. O eluído pode ser usado para análises ocidentais do borrão ou armazenado em-80 ° c. Alternativamente, os grânulos podem ser lavados duas vezes com o tampão do lysis e então três vezes com o amortecedor da quinase para executar a rotulagem do ATP do γ [³²P].

5. análises de coimunoprecipitação

1. Lave as contas imunoprecipitadas da etapa 4,7 com o tampão de Lise.
   1. Centrifugar durante 2 min a 1.000 x g num centrifugador refrigerado a 4 ° c.
   2. Retire cuidadosamente o sobrenadante e descarte-o.
   3. Adicionar 500 μL de tampão de Lise. Homogeneizar invertendo o tubo.
   4. Repita os passos 5.1.1-5.1.3 quatro vezes.
2. Eluição
   1. Centrifugar durante 2 min a 1.000 x g num centrifugador refrigerado a 4 ° c.
   2. Retire cuidadosamente o sobrenadante e descarte-o. Retire as últimas gotas de sobrenadante com uma seringa de Hamilton, a fim de evitar a aspiração dos grânulos, e descartar o sobrenadante.
   3. Adicionar 40 μL de 4x tampão de Laemmli (200 mM Tris/HCl pH 6,8, 4% SDS, 40% glicerol, 0,5 M β-Mercaptoetanol, 0, 2% azul de bromofenol). Homogeneizar tocando suavemente o tubo.
   4. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
   5. Centrifugar durante 5 min a 10.000 x g à temperatura ambiente.
   6. Com uma seringa de Hamilton, retire o sobrenadante e colete-o em um novo tubo de microcentrífuga. Esta fração corresponde ao "Eluate", que pode ser armazenado em-80 ° c, ou diretamente analisado por Western Blot.

6. ensaio quinase

1. Prepare o tampão da quinase: 50 milímetros HEPES-NaOH pH 7,5 (HEPES significa 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineetanoesulfonic ácido), 150 mM NaCl, 5mm MgCl 2,5 mm MNCL₂, 50 mm NAF, 1 mm na₃vo₄, 20 mm β-glicerofosfato, 1 μg/ml leupeptina e 1 mM de PMSF. Em torno de 2 mL do tampão da quinase é exigido para cada condição da imunoprecipitação.
2. Lave as contas imunoprecipitadas da etapa 4,7 duas vezes com 500 μL de tampão de Lise.
   1. Centrifugar durante 2 min a 1.000 x g num centrifugador refrigerado a 4 ° c.
   2. Remova cuidadosamente o sobrenadante e descarte-o. Adicionar 500 μL de tampão de Lise. Homogeneizar por inversão.
   3. Repita os passos 6.2.1 e 6.2.2.
3. Lave os grânulos Immunoprecipitated três vezes com 500 μL do amortecedor da quinase.
   1. Centrifugar durante 2 min a 1.000 x g num centrifugador refrigerado a 4 ° c.
   2. Remova cuidadosamente o sobrenadante e descarte-o. Adicionar 500 μL de tampão quinase. Homogeneizar por inversão.
   3. Repita os passos 6.3.1 e 6.3.2 duas vezes.
4. Centrifugar durante 2 min a 1.000 x g num centrifugador refrigerado a 4 ° c.
5. Remova cuidadosamente o sobrenadante e descarte-o. Retire as últimas gotas de sobrenadante com uma seringa de Hamilton, a fim de evitar a aspiração dos grânulos, e descartar o sobrenadante.
6. Adicionar 40 μL de tampão quinase aos grânulos imunoprecipitados. Ressuspender os grânulos tocando suavemente no tubo.
7. Prepare a mistura para a rotulagem do ATP do γ [³²P] (o volume final é 22,5 μL, termine com tampão da quinase) em um lock-Tube seguro.
   1. Adicione o volume necessário de tampão da quinase para alcançar um volume final de 22,5 μL.
   2. Corte a extremidade de uma ponta de 20 μL de uma micropipeta. Resuspend os grânulos Immunoprecipitated da etapa 6,6 introduzindo com pipting acima e para baixo diversas vezes. Colete 10 μL destes grânulos no tubo do seguro-fechamento.
   3. Adicione ATP de uma solução de estoque de 10 μM para atingir 50 mM de concentração final. De acordo com o número de amostra tratada, uma diluição da solução de estoque de ATP no tampão da quinase é sugerida para permitir a pipeta 1 a 2 μL, para ter certeza de que o volume está correto.
   4. Adicionar 2,5 μg de substrato (cofilina ou myelin Basic protein, MBP no caso do presente estudo).
8. Adicionar 5 μCi de γ [³²P] ATP (3.000 CI/mmol) para iniciar a reação. Misture com pipetagem para cima e para baixo lentamente.
   Cuidado: a partir deste ponto, o trabalho deve ser feito em um local de segurança dedicado para manipulações de radioatividade com precaução cautelosa, proteções dedicadas e controles apropriados (escudos radioativos, contador Geiger, coleta de resíduos específicos, peito pessoal e os emblemas do dedo para detectar a exposição radioativa, pontas de filtro).
9. Incubar por 20 min a 30 ° c.
10. Pare a reacção com 6 μL de tampão de 5x Laemmli.
11. Aqueça a 95 ° C por 5 min.
12. Centrifugar a 10.000 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
13. Carregar em um SDS-PAGE. Prossiga para a migração.
    Nota: Tome cuidado para que a linha de frente de livre γ [³²P] ATP não saia do gel para evitar a contaminação do tanque de migração.
14. Manchar o gel à temperatura ambiente.
    1. Retire o gel das placas de vidro.
    2. Prossiga com três banhos em água à temperatura ambiente.
    3. Mancha o gel durante a noite com o azul de Coomassie na temperatura ambiente.
    4. Destain o gel com vários banhos de lavagem com água à temperatura ambiente.
15. Enrole o gel com plástico Wrap.
16. Expor para uma noite ou mais em uma tela do phosphorimager.
17. Leia a tela em um phosphorimager para detectar faixas rotuladas.

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Resultados

A proteína LIMK2-1 é sintetizada
LIMK2-1 é mencionado nos databanks, mas assim distante somente um papel mostrou a existência de seu mRNA¹⁸. Comparado a seus dois homologs, LIMK2a e LIMK2b, LIMK2-1 tem um domínio extra do C-terminal identificado como um domínio Inibidório da proteína phosphatase 1 (PP1i). Nós projetamos um anticorpo que segmenta um peptide deste domínio, ácidos aminados 671-684 (Figura 1a...

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Discussão

Neste documento, utilizamos ferramentas bioquímicas robustas para caracterizar no nível molecular uma nova proteína, LIMK2-1, que se acredita ser uma quinase baseada em sua seqüência e em seus homologs, LIMK2a e LIMK2b²⁰.

Primeiramente, nós Demonstramos a existência de LIMK2-1 no nível da proteína usando a análise ocidental do borrão com um anticorpo específico. Em seguida, avaliamos sua interação com a quinase upstream ROCK1, que é conhecida por regular ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody anti-actin	Sigma-Aldrich	A1978	for Western Blot
Antibody anti-c-Myc	Invitrogen	MA1-21316	for Western Blot
Antibody anti-cofilin	Cell signaling Technology	3312/5175	for Western Blot
Antibody anti-GFP	Santa Cruz	sc-9996	for Western Blot
Antibody anti-HA	Roche Applied Science	11687423001	for Western Blot
Antibody anti-phospho-cofilin	Cell signaling Technology	3313	for Western Blot
Antibody Anti-PP1i	Eurogentec	designed for this study	for Western Blot
Aprotinin	Euromedex	A-162B	for lysis buffer
ATP	Invitrogen	PV3227	for γ[32P] labeling
γ[32P] ATP	Perkin Elmer	NEG502A	for γ[32P] labeling
BES buffered saline	Sigma-Aldrich	14280	for transfection
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422	for lysis and kinase buffer
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	for Laemmli
BSA	Sigma-Aldrich	A3059	for blocking buffer
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126	for Laemmli
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881	for transfection
Centrifuge	Sigma	111-541
Collagen R	Pan Biotech	P06-20166	for transfection
Control siRNA	Ambion	AM4611	for PP1i antibody specificity
Coomassie PageBlue Protein Staining Solution	Thermo-Fisher	24620	for gel staining
EDTA	Sigma-Aldrich	3690	for lysis buffer
Electrophoresis Unit	Biorad	Mini-Protean	for Western Blot
EZview Red anti-HA affinity gel	Sigma-Aldrich	E6779	for immunoprecipitation
GeneSys software	Ozyme		for Western Blot acquisition
GeneTolls software	Ozyme		for Western Blot quantification
GFP-trap beads	Chromtek		for immunoprecipitation
Glycine	Euromedex	26-128-6405	for transfer buffer
GST-cofilin	Upstate Cell signaling	12-556	for γ[32P] labeling
Hamilton syringe 100 mL	Hamilton	710	to remove carefully supernatant from beads without aspirating them
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	for kinase buffer
ImageQuant TL software	GE Healthcare		for radioactivity acquisition and quantification
LIMK2 siRNA	Ambion	s8191	for PP1i antibody specificity
Leupeptin	Sigma-Aldrich	SP-04-2217	for lysis and kinase buffer
MBP	Upstate Cell signaling	13-173	for γ[32P] labeling
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	for kinase buffer
MnCl2	Sigma-Aldrich	244589	for kinase buffer
NaCl	Euromedex	1112	for lysis and kinase buffer
NaF	Sigma-Aldrich	S-1504	for lysis and kinase buffer
Okaidic acid	Euromedex	0-2220	for lysis buffer
PMSF	Sigma-Aldrich	78830	for lysis and kinase buffer
p-nitrophenylphosphate	Euromedex	1026	for lysis buffer
PVDF membrane Immobillon-P	Merck-Millipore	IPVH00010 pore size 0,45 mm	for Western Blot
Rotating wheel	Labinco		for bead incubation
Safe lock eppendorf	Eppendorf	0030120.086	for kinase assay
SDS	Sigma-Aldrich	5030	for Laemmli and migration buffer
Sodium orthovanadate	LC Laboratories	S8507	for lysis and kinase buffer
Sodium pyrophosphate	Fluka	71501	for lysis buffer
Super Signal West Dura	Protein Biology	34075	for Western Blot
Syngene Pxi	Ozyme		for Western Blot
Tissue extracts	Biochain	P1234035 Brain P12345152 Lung P1234149 Liver P1234188 Pancreas P1234260 Testis	for Western Blot analysis
Transfer Unit	Biorad	Mini-Trans-Blot	for Western Blot
Tris	Euromedex	26-128-3094 B	for lysis buffer
Tween-20	Sigma-Aldrich	P7949	for blocking buffer
Typhoon FLA9500	GE Healthcare		to read autoradiography
Typhoon Trio	Amersham Bioscience		to read autoradiography
Whatman paper	GE Healthcare	3030-672	for Western Blot