JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מאופיינים חלבון קינאז חדש באמצעות גישות ביוכימיים חזקים: ניתוח כתמי אבן מערבית עם נוגדן ספציפי ייעודי על קווי תאים שונים ורקמות, אינטראקציות על ידי ניסויים coimmunoprecipitation, הפעילות של קינאז שזוהו על ידי המערב כתם באמצעות נוגדן ספציפי פוספהו ועל ידי γ [32P] ATP תיוג.

Abstract

רצף הגנום השלם נרחב זיהה מסגרות קריאה פתוחות רבות (ORFs) מתן חלבונים פוטנציאליים רבים. חלבונים אלה עשויים להיות תפקידים חשובים לתא ועלול לפענח תהליכים סלולריים חדשים. בין החלבונים, קינסים הם שחקנים גדולים כפי שהם שייכים לתא איתות מסלולים ויש להם את היכולת לעבור או לבטל תהליכים רבים חיוניים לגורל התא, כגון צמיחת תאים, חלוקה, בידול, תנועתיות, ומוות.

במחקר זה התמקדנו בחלבון קינאז חדש, LIMK2-1. הדגמנו את קיומו על ידי אבן החשופה המערבית באמצעות נוגדן ספציפי. הערכנו את האינטראקציה שלה עם חלבון במעלה הזרם באמצעות ניסויים coimmunoprecipitation. Coimmunoprecipitation היא טכניקה רבת עוצמה מסוגל לזהות את האינטראקציה בין שני חלבונים היעד. זה יכול לשמש גם כדי לזהות שותפים חדשים של חלבון פיתיון. ניתן לטהר את חלבון הפיתיון באמצעות תגית המיועדת לרצף שלו או באמצעות נוגדן המכוון אותו במפורש. מכלולי חלבון אלה עשויים להיות מופרדים על-ידי SDS-PAGE (נתרן Dodecyl סולפט PolyAcrylamide ג'ל) ומזוהה באמצעות ספקטרומטר מסה. Immunoprecipitated LIMK2-1 שימש גם כדי לבחון את פעילותה קינאז בתוך מבחנה על ידי γ [32P] ATP תיוג. שיטת מבוסס-היטב זו עשויה להשתמש במספר רב של מצעים שונים, וניתן להשתמש בגרסאות מוטציה של הפיתיון כדי להעריך את התפקיד של שאריות מסוימים. ההשפעות של סוכני תרופתי עשוי גם להיות מוערך מאז טכניקה זו הן רגישות מאוד כמותית. למרות זאת, הטיפול ברדיואקטיביות. דורש זהירות מיוחדת פעילות קינאז עשויה גם להיות מוערך עם נוגדנים ספציפיים מיקוד קבוצת פוספהו של חומצת האמינו ששונתה. סוגים אלה של נוגדנים אינם זמינים מסחרית עבור כל שאריות פוספהו שונה.

Introduction

במשך עשורים רבים, מסלולי איתות רבים כבר הובהר ואת מעורבותם בתהליכים סלולריים מכריע כגון חלוקת תאים, בידול, תנועתיות, מוות תאים מתוכנת, חסינות ונוירוביולוגיה, הוכח. קינסים לשחק תפקיד משמעותי אלה מסלולים איתות כפי שהם לעתים קרובות מווסת את ההפעלה שלהם או איון פעלה הם חלק מתחמי רב-תכליתי ארעי כי להגיב גירויים חיצוניים1,2,3. מוטציה ודיסרגולציה של קינסים לעיתים קרובות להוביל מחלות בבני אדם, ולכן הם הפכו לאחד מטרות הסמים החשובים ביותר במהלך 40 השנים האחרונות4.

בהקשר זה, חשוב להיות מסוגל לזהות את האינטראקציה של קינאז עם הרגולטורים שלהם במעלה הזרם או מצעים במורד ולזהות שותפים חדשים. טיהור וimmunoprecipitation אהדה הם טכניקות רבות עוצמה לבידוד של מכלולי חלבונים5. חלבון הפיתיון או קינאז עשוי להיות מתויג עם רצף פפטיד מסוים המאפשר שימוש בחרוזים מסחריים בשילוב עם נוגדנים מיקוד הפפטיד. החומר הזה מאפשר הזיית הגדול בניסויים6,7,8. חלבונים אנדוגני עשויים גם להיות immunoprecipitated באמצעות נוגדנים מיקוד ישירות החלבון פיתיון. הנוגדנים יכול להיות מקושרת מקושרת חלבון A או חלבון G agarose חרוזים או פשוט מודבטים עם חרוזים אלה לפני הוספת lysate. מאגרי לליזה חייב להיות ממוטב כדי לאפשר מסיסות חלבונים מבלי לאבד אינטראקציה כדי למנוע השפלה חלבון. החיסרון העיקרי של גישה זו הוא כי האינטראקציה מזוהה על הליזה תאים; לפיכך, אינטראקציות זמניות או חלשות, יחד עם אלה הדורשות הקשר משנה-תאית עלול להיות חסר. טכניקות אחרות עשויות לשמש לעבודה ישירות בתא כגון שיטת הסמיכות הקרבה (PLA)9, ב vivo חוצה קישור-בסיוע לטיהור אהדה (xap)10, ביולומיאנמינציה העברת אנרגיה העברה (ברט) או Förster אנרגיית התהודה העברה (סריג)11,12. יתרה מזאת, הimmunoprecipitation אינו מתאים לקבוע את הקבועים התרמודינמיים של הכריכה, שעליהם טכניקות פיזיות כגון משטח תהודה במשטח, איזותרמי טיטור קלורימטריה או תרמופלאזיס מיקרוסקאלה . 13,14.

פעילות קינאז עשויה להיות מוערך באמצעות טכניקות מרובות. בזאת, אנו התמקדו נוגדנים ספציפיים פוספאו γ [32P] ATP (אדנוזין triphosphate) תיוג. הנוגדנים הספציפיים של פואהו מכוונים לשינוי פוספט של שאריות מסוימים בתוך חלבון. ניתן להשתמש בהם באבן החשופה המערבית או באליסה (השיטה החיסונית המקושרת באמצעות אנזימים) לאחר פירוק תאים, עבור אימונוהיסטוכימיה, וגם על תאים שלמים באמצעות הזרמת cy, או immunofluorescence. החסרונות שלהם עשויים לכלול חוסר ספציפיות, אשר ניתן להעריך באמצעות גרסה מוטציה של חלבון היעד, ושלהם לא להיות זמין מסחרית עבור כל החלבונים. בשנת החוץ γ [32P] תיוג ATP היא חזקה מאוד, שיטה מבוססת היטב ורגישה מאוד15. חלבונים Immunoprecipitated או רקומביננטי ניתן להשתמש, ומצעים שונים עשויים להיבדק. ההשפעות של תרופות ניתן גם להעריך כמו שיטה זו היא כמותית. החיסרון העיקרי שלה הוא כי הרדיואקטיביות הקשורה הגישה דורשת טיפול בזהירות. שיטות חלופיות אפשריות גם על בסיס מדידה של מצעים הפלורסצנט או של פפטיד ומנצלים את המאפיינים של פלורסנט משתנה/זורח על זירחון. שיטות כאלה גם לאפשר תפוקה גבוהה, אשר נדרש, למשל, בהקרנה של מולקולות שעלולות להיות מעכבי פוטנציאליים של קינאז היעד. אכן, הקינסים מייצגים את אחד השיעורים הגדולים ביותר של מטרות הסמים שנרדף על ידי חברות התרופות16.

במחקר זה, אנו מתמקדים LIMK2-1 חלבון (LIMK2-1 מייצג Lin11, Isle1, Mec3 קינאז isoform 2-1). חלבון LIMK2 קינאז תואר לראשונה ב-199517. שלושה איזוצורות של LIMK2 מיוצרים על ידי שחבור חלופיים: LIMK2a, LIMK2b ו LIMK2 -1. כיום, LIMK2-1 תוארה רק ברמת mRNA במחקר אחד18. להלן, אנו מגדירים את החלבון החדש הזה של קינאז ברמה המולקולרית, תוך שימוש בגישות ביוכימיות חזקות. ראשית, אנו להדגים כי LIMK2-1 אכן מסונתז. בדומה לשני עמיתיהם, LIMK2a ו-LIMK2b, היא מקיימת אינטראקציה עם ROCK קינאז במעלה (Rho-חלבון קינאז). אנו מראים LIMK2-1 יש פעילות קינאז על חלבון המיאלין Basic (MBP), אבל לא על קופפלין, המצע קאנוני של LIM.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנה לתא לתרגום מעגל

התראה: יש לבצע את כל השלבים של תרבות התא במעבדה ייעודית, והתאים מניפולציות בתוך ארון מיקרוביולוגי של Class 2.

  1. זרע HEK-293 (האדם כליה עובריים) תאים ב-Ø 10 ס מ לוחות ב 10 מ ל של DMEM (מדיום הנשרים שונה של Dulbecco) שיושלם עם 10% סרום עגל עוברי. תרבות עבור 3 עד 5 ימים מתחת 5% CO2, ב 37 ° c, עד התאים להגיע ~ 90% המפגש.
  2. לטפל Ø 10 ס מ לוחות עם קולגן R כדי להגדיל את הדבקה התא לצלחות פלסטיק.
    1. הוסף 5 מ ל של פתרון של קולגן R, 200-קיפול מדולל במאגר מלוחים פוספט (PBS) ב-Ø 10 ס מ לוחית. כיסוי הנוזל מעל פני השטח כולו של הצלחת.
    2. דגירה בטמפרטורת החדר עבור לפחות 1 h בתוך הקבינט אבטחה טיחות.
    3. הסר פתרון קולגן, ולמחוק אותו. הוסף 5 מ ל PBS, להפיץ אותו על פני השטח של הצלחת, להסיר אותו ולהשליך אותו. . חזור על הכביסה פעם אחת
    4. הוסף 8 מ ל של DMEM בתוספת עם 10% סרום עגל עוברי. שמרו את הצלחות המוכנות. בתוך ארון הביונצרה
  3. קח את hek-293 צלחות משלב 1.1 בתוך הקבינט אבטחה טיחות. להסיר את המדיום מן הצלחות ולהשליך אותו לפח מלבין ייעודי. הוסף 2 מ ל של DMEM שיושלם, ולשטוף את התאים כדי לנתק אותם באמצעות זרימת של מיקרופיפטה 1 mL, מטפלת כדי להימנע מעשיית קצף.
  4. לאסוף את התאים בצינור 15 מ"ל ולהוסיף 4 מ ל של DMEM שיושלם. הומוגון עם פיפטה באורך 10 מ ל, על ידי ליטוף למעלה ולמטה 3 פעמים.
  5. לקחת 2 מ ל של פתרון זה התא ולהוסיף אותם לוחות מטופלים קולגן המכיל DMEM שיושלם בשלב 1.2.4.
  6. לגדול 24 שעות בחממה ב 5% CO2 ו 37 ° c. התאים צריכים להיות 50-80% שוטפת בזמן ההעברה.

2. העברה ארעית

  1. להסיר את המדיום מן הצלחות, להשליך אותו לפח מלבין ייעודי, ולהוסיף 10 מ ל של DMEM שנוספו טרי. הכניסו את הצלחות לתוך החממה ב-37 ° צ' בזמן הכנת תערובת הזיהום.
  2. בתוך שפופרת 15 מ"ל, להוסיף 450 μL של 10 מ"מ-HCl-היפר-ethylenedinitrilotetraacetic pH 7.5/1 מ"מ EDTA (טריס מעמדים טריס (הידרוקסימתיל), ו EDTA עבור חומצה) פתרון 50 μL של 2.5 M CaCl2 פתרון. מערבבים באמצעות היפוך.
  3. הוסף 10 μg של ה-DNA פלמינדית (חומצה דיאוקסיריוונקלאית) הכין מתוך הכנת midi על תרבות נוזלית של חיידקים שהפכו עם הפלביניים המסור. מערבבים באמצעות היפוך.
  4. תחת עצבנות חלקה על מערבולת, להוסיף 500 μL של BES מלוחים באגירה 2x להתרכז (קומפוזיציה: BES, 10.7 g/L, הנאל, 16.0 g/L, Na2hpo4, 0.27 g/l; בס מייצג N, N-Bis (2-הידרוקסיל) -2-עמינח החומצה הגופרתית, N, N-Bis (2-הידרוקסיל) taurine) ירידה איטית בירידה.
  5. מודטה לפחות 15 דקות (עד 45 דקות) בטמפרטורת החדר בתוך הקבינט אבטחה טיחות. לא מערבולת, לא לערבב! להזיז את הצינורות בזהירות רבה לא להפריע היווצרות מורכבים בין DNA ו סידן פוספט.
  6. קחו את הצלחות משלב 2.1. לארון הבטיחות הוסף את מכלולי ה-DNA בזהירות רבה, ירידה בירידה, על התאים בכל רחבי המשטח של הצלחת.
  7. דגירה של 24 עד 72 שעות בחממה ב 37 ° c. בדרך כלל מקסימום ביטוי חלבון הוא הגיע בתוך 48 שעות.

3. לוליזיס

הערה: עבודה על קרח, עם מאגרים קרים כדי למנוע השפלה בחלבון.

  1. להכין מאגר לפירוק: 50 mM טריס-HCl, pH 7.5, 100 מ"מ מילימטר, 5 מ"מ EDTA, 0.1% טריטון X-100, 50 mM NaF, 10 מ"מ פירופוספט נתרן, 1 מ"מ Na3VO4, 20 מ"מ p-ניטרופניק פוספט, 20 מ"מ β-glycerophosphate, 10 μg/ml aprotinin 0.05 μg/ml חומצה okaidic , 1 μg/mL ליופטין, ו-1 מ"מ PMSF (פנילמתיל פלולוניל פלואוריד). סביב 4 מ ל של מאגר הליזה נדרשים עבור כל צלחת המשגר.
  2. להסיר צלחות עם תאים מזוהמים מהאינקובטור. . שים אותם על קרח
    הערה: משלב זה, ניתן לעבוד על ספסל "רגיל".
  3. הסר את המדיה והתעלם ממנו בזבל מלבין ייעודי.
  4. לשטוף פעמיים עם 3 מ ל של התאים הקרים: להוסיף 3 מ ל של PBS בצד של ירידה לוחית על ידי ירידה כדי להימנע מניתוק תאים מזוהמים, להתפשט בכל רחבי המשטח של הצלחת, להסיר PBS ולהשליך אותו; חזור על שלב זה פעם נוספת. בסופו של דבר, הסר בזהירות את שאר ה-PBS על ידי הטיית הצלחת כדי למנוע דילול מאגר הליזה לשלב הבא.
  5. הוסף 500 μL של מאגר לפירוק קר על התאים שטף מנוכר. . תפיץ את זה על פני הצלחת
  6. מודקון למשך 10 דקות על הקרח. מפעם לפעם (לפחות פעמיים), הפיצו שוב את החוצץ על פני המשטח של הצלחת.
  7. לגנוז את התאים ולאסוף אותם בצינור מיקרוצנטריפוגה.
  8. צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 10,000 x g ב 4 ° c.
  9. אספו את הסופרנטאנט. בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש שבר זה מקביל לליפוסט (תמצית התא השלם). להיפטר הגלולה אשר מתאים פסולת קרום התא.
  10. לאסוף סדרת מחלקים של שבר זה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש (סביב 50 μl). שבר זה מקביל ל "השבר הכולל" או "תא ליפוסט" או "תמצית תא שלם" המאפשר ניתוח של חלבונים מוגברים מבוטא על ידי אבן החשופה המערבית.
    הערה: בשלב זה ניתן להשתמש בדגימות ישירות לניתוחי כתמי אבן מערביים. מאגר laemmli יש להוסיף למדגם, אשר מחומם אז ב 95 ° c עבור 5 דקות, centrifuged ב 10,000 x g עבור 5 דקות, ו נטען על sds המתאים-עמוד. ניתן לאחסן דגימות גם ב-80 ° c.

4. Immunoprecipitation

  1. השעיה מחדש בעדינות חרוזים בשילוב עם הנוגדן המתאים: HA (hemagglutinin שפעת האדם), דגל, או GFP (חלבון פלורסנט ירוק) על ידי היפוך חלק.
  2. חותכים את סופו של קצה 200 μL ממיקרו-פיפטה כדי לאפשר לחרוזים להזין את הקצה. פיפטה את החרוזים למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להרוות את הקצה כדי להבטיח לקחת את הנפח הנכון של חרוזים.
  3. קח 40 μL של חרוזים בצינור מיקרוצנטריפוגה.
  4. הוסף 500 μL של טנט (30 mM טריס-HCl pH 7.5, 120 mM הנאקל, 5 מ"מ EDTA, 1% טריטון X-100) מאגר. מערבבים באמצעות היפוך. צנטריפוגה עבור 2 דקות ב 1,000 x g ב 4 ° c. הסר בזהירות supernatant ולמחוק אותו. הוסף 500 μL של טנט. מודטה לפחות שעה אחת ב -4 ° c על גלגל מסתובב.
    הערה: שלב טרום הדגירה ב-טנט מאפשר להפחית אינטראקציות שאינן ספציפיות ולכן כדי להקטין את אות הרקע.
  5. לשטוף את החרוזים פעמיים עם 500 μL של מאגר הליזה.
    1. צנטריפוגה 2 דקות ב 1,000 x g ב 4 ° c.
    2. הסר את מאגר הסופרנטנט היטב והשמט אותו.
      הערה: שימו לב שלא לשים חרוזים במהלך שלבי הכביסה האלה.
    3. הוסף 500 μL של מאגר הליזה. הומוגון על-ידי היפוך השפופרת.
    4. חזור על שלבים 4.5.1-4.5.3.
  6. צנטריפוגה עבור 2 דקות ב 1,000 x g ב 4 ° c. הסר בזהירות את מאגר הסופרנטאנט והשמט אותו.
  7. מחרוזת מודטה עם הליפוסט משלב 3.9 במשך 2 עד 4 שעות ב -4 ° c על גלגל מסתובב.
  8. שטוף immunoprecipitated חרוזים.
    הערה: בשלב זה ניתן לשטוף את החרוזים הimmunoprecipitated חמש פעמים עם מאגר הליזה, ולאחר מכן להתחמק עם מאגר Laemmli. ניתן להשתמש באפשרות לניתוח כתמי אבן מערבית או לאחסנו ב-80 ° c. לחילופין, חרוזים ניתן לשטוף פעמיים עם מאגר הליזה ולאחר מכן שלוש פעמים עם מאגר קינאז לבצע γ [32P] ATP תיוג.

5. ניתוח Coimmunoprecipitation

  1. שטוף immunoprecipitated חרוזים משלב 4.7 עם מאגר הליזה.
    1. צנטריפוגה עבור 2 דקות ב 1,000 x g בצנטריפוגה בקירור ב 4 ° c.
    2. הסר בזהירות את הסופרנטאנט והשמט אותו.
    3. הוסף 500 μL של מאגר הליזה. הומוגון על-ידי היפוך השפופרת.
    4. חזור על הצעדים 5.1.1-5.1.3 ארבע פעמים.
  2. אלוציה
    1. צנטריפוגה עבור 2 דקות ב 1,000 x g בצנטריפוגה בקירור ב 4 ° c.
    2. הסר בזהירות את הסופרנטאנט והשמט אותו. הסר את הטיפות האחרונות של סופרנטנט עם מזרק המילטון כדי להימנע משאיפה של החרוזים, ולהשליך את הסופרנטאנט.
    3. להוסיף 40 μL של מאגר 4x Laemmli (200 mM טריס/HCl pH 6.8, 4% SDS, 40% גליצרול, 0.5 M β-mercaptoethanol, 0.02% ברומרופנול כחול). הומוגון על-ידי הקשה בעדינות על השפופרת.
    4. דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 10,000 x g בטמפרטורת החדר.
    6. בעזרת מזרק המילטון, הסר את הסופרנטאנט. ואסוף אותו בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש שבר זה מתייחס למילה "הללויה", העשויה להיות מאוחסנת ב-80 ° c, או מנותח ישירות על-ידי אבן החשופה המערבית.

6. שיטת קינאז

  1. הכינו את מאגר קינאז: 50 מ"מ HEPES-NaOH pH 7.5 (HEPES מייצג 4-(2-הידרולוקסיל) -1-חומצה פיפראזאנייאנייאנייאניוני, 150 mM הנאקל, 5 מ"מ MgCl2, 5 מ"מ Mgcl2, 50 mm Naoh, 1 מ"מ Na3VO4, 20 מ"מ β-glycerophosphate, 1 μg/mL לוקיטין, ו-1 מ"מ PMSF. סביב 2 מ ל של מאגר קינאז נדרש עבור כל תנאי immunoprecipitation.
  2. לשטוף immunoprecipitated חרוזים משלב 4.7 פעמיים עם 500 μL של מאגר הליזה.
    1. צנטריפוגה עבור 2 דקות ב 1,000 x g בצנטריפוגה בקירור ב 4 ° c.
    2. הסר בזהירות את הסופרנטאנט והשמט אותו. הוסף 500 μL של מאגר הליזה. . הומוגון ע י היפוך
    3. חזור על שלבים ה6.2.1 וה6.2.2.
  3. שטוף immunoprecipitated חרוזים שלוש פעמים עם 500 μL של מאגר קינאז.
    1. צנטריפוגה עבור 2 דקות ב 1,000 x g בצנטריפוגה בקירור ב 4 ° c.
    2. הסר בזהירות את הסופרנטאנט והשמט אותו. הוסף 500 μL של מאגר קינאז. . הומוגון ע י היפוך
    3. חזור על הצעדים 6.3.1 ו-6.3.2 פעמיים.
  4. צנטריפוגה עבור 2 דקות ב 1,000 x g בצנטריפוגה בקירור ב 4 ° c.
  5. הסר בזהירות את הסופרנטאנט והשמט אותו. הסר את הטיפות האחרונות של סופרנטנט עם מזרק המילטון כדי להימנע משאיפה של החרוזים, ולהשליך את הסופרנטאנט.
  6. הוסף 40 μL של מאגר קינאז לחרוזי immunoprecipitated. השהה מחדש את החרוזים על-ידי הקשה בעדינות על השפופרת.
  7. להכין את התערובת עבור γ [32P] ATP תיוג (הנפח הסופי הוא 22.5 μl, להשלים עם מאגר קינאז) בתוך מנעול בטוח-צינור.
    1. הוסף את הנפח הנדרש של מאגר קינאז כדי להגיע לנפח הסופי של 22.5 μL.
    2. חותכים את הקצה של 20 Μa של מיקרופיפטה. להשעות את immunoprecipitated חרוזים משלב 6.6 על ידי ליטוף למעלה ולמטה מספר פעמים. לאסוף 10 μL של חרוזים אלה לתוך הצינור בטוח לנעול.
    3. הוסף ATP מ 10 μM פתרון מניות כדי להגיע 50 mM של ריכוז הפינאלה. על פי מספר המדגם שטופלו, דילול של פתרון המניה של ATP במאגר קינאז מוצעת לאפשר פיפטה 1 כדי 2 μL, כדי להיות בטוח שעוצמת הקול נכונה.
    4. הוסף 2.5 μg של מצע (קופלין או חלבון מיאלין בסיסי, MBP במקרה המחקר הנוכחי).
  8. הוסף 5 μCi של γ [32P] ATP (3,000 Ci/ממול) כדי ליזום את התגובה. מערבבים על ידי ליטוף למעלה ולמטה לאט.
    התראה: מנקודה זו, יש לעשות את העבודה במקום בטיחות המוקדש למניפולציות רדיואקטיביות בזהירות זהירה, הגנות ייעודיות ובקרות מתאימות (מגינים רדיואקטיביים, מונה גייגר, איסוף פסולת ספציפית, חזה אישי ו תגי אצבע כדי לזהות חשיפה רדיואקטיבית, עצות סינון.
  9. דגירה של 20 דקות ב 30 ° c.
  10. עצור את התגובה עם 6 μL של מאגר Laemmli 5x.
  11. חום ב 95 ° C עבור 5 דקות.
  12. צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  13. העמסה על SDS-דף. . המשך להעברה
    הערה: שמור על השורה הקדמית של γ חינם [32P] ATP אינו יוצא מהג כדי למנוע זיהום של מיכל ההגירה.
  14. הכתם את הג'ל בטמפרטורת החדר.
    1. . הסירי את הג מלוחות הזכוכית
    2. המשיכו עם שלוש אמבטיות במים בטמפרטורת החדר.
    3. הכתם את הג לילה עם Coomassie כחול כחול בטמפרטורת החדר.
    4. הדכתם את הג עם מספר אמבטיות כביסה עם מים בטמפרטורת החדר.
  15. עטפו את הג בעטיפת ניילון.
  16. לחשוף ללילה אחד או יותר על המסך פוספרואורימנגר.
  17. קרא את המסך על זרחן כדי לזהות להקות המסומנות בתווית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

חלבון LIMK2-1 הוא מסונתז
LIMK2-1 מוזכר מאגר נתונים, אבל עד כה רק נייר אחד הראה את קיומו של mRNA שלה18. לעומת שלה שני הומויומנים שלה, LIMK2a ו LIMK2b, LIMK2-1 יש מתחם C-terminal נוסף המזוהה כמו חלבון פוספספטאז 1 תחום מעכבות (PP1i). עיצבנו נוגדן המטרה פפטיד של תחום זה, חומצות אמינו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כאן, השתמשנו בכלים ביוכימיים חזקים כדי לאפיין ברמה המולקולרית חלבון חדש, LIMK2-1, האמינו להיות קינאז מבוסס על הרצף שלה ועל יומני ההומויום שלה, LIMK2a ו LIMK2b20.

ראשית, הדגמנו את קיומו של LIMK2-1 ברמת החלבון באמצעות ניתוח כתמי אבן מערבית עם נוגדן ספציפי. בעקבות זאת, הערכנו את ה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי La ligue דשנה סרטן, l ' האגודה נוירופיבאטוטוסס ורקלינגהאוזן, ואת מרכז העיר וואל דה לואר. תודות לAurélie קסון ולדבוראה קסס לגבי מידע מעמיק של כתבי היד ולקיירון היקמן-לואיס.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibody anti-actinSigma-AldrichA1978for Western Blot
Antibody anti-c-MycInvitrogenMA1-21316for Western Blot
Antibody anti-cofilinCell signaling Technology3312/5175for Western Blot
Antibody anti-GFPSanta Cruzsc-9996for Western Blot
Antibody anti-HARoche Applied Science11687423001for Western Blot
Antibody anti-phospho-cofilinCell signaling Technology3313for Western Blot
Antibody Anti-PP1iEurogentecdesigned for this studyfor Western Blot
AprotininEuromedexA-162Bfor lysis buffer
ATPInvitrogenPV3227for γ[32P] labeling
γ[32P] ATPPerkin ElmerNEG502Afor γ[32P] labeling
BES buffered salineSigma-Aldrich14280for transfection
β-glycerophosphateSigma-AldrichG9422for lysis and kinase buffer
β-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148for Laemmli
BSASigma-AldrichA3059for blocking buffer
Bromophenol BlueSigma-AldrichB0126for Laemmli
CaCl2Sigma-AldrichC3881for transfection
CentrifugeSigma111-541
Collagen RPan BiotechP06-20166for transfection
Control siRNAAmbionAM4611for PP1i antibody specificity
Coomassie PageBlue Protein Staining SolutionThermo-Fisher24620for gel staining
EDTASigma-Aldrich3690for lysis buffer
Electrophoresis UnitBioradMini-Proteanfor Western Blot
EZview Red anti-HA affinity gelSigma-AldrichE6779for immunoprecipitation
GeneSys softwareOzymefor Western Blot acquisition
GeneTolls softwareOzymefor Western Blot quantification
GFP-trap beadsChromtekfor immunoprecipitation
GlycineEuromedex26-128-6405for transfer buffer
GST-cofilinUpstate Cell signaling12-556for γ[32P] labeling
Hamilton syringe 100 mLHamilton710to remove carefully supernatant from beads without aspirating them
HEPESSigma-AldrichH3375for kinase buffer
ImageQuant TL softwareGE Healthcarefor radioactivity acquisition and quantification
LIMK2 siRNAAmbions8191for PP1i antibody specificity
LeupeptinSigma-AldrichSP-04-2217for lysis and kinase buffer
MBPUpstate Cell signaling13-173for γ[32P] labeling
MgCl2Sigma-AldrichM8266for kinase buffer
MnCl2Sigma-Aldrich244589for kinase buffer
NaClEuromedex1112for lysis and kinase buffer
NaFSigma-AldrichS-1504for lysis and kinase buffer
Okaidic acidEuromedex0-2220for lysis buffer
PMSFSigma-Aldrich78830for lysis and kinase buffer
p-nitrophenylphosphateEuromedex1026for lysis buffer
PVDF membrane Immobillon-PMerck-MilliporeIPVH00010 pore size 0,45 mmfor Western Blot
Rotating wheelLabincofor bead incubation
Safe lock eppendorfEppendorf0030120.086for kinase assay
SDSSigma-Aldrich5030for Laemmli and migration buffer
Sodium orthovanadateLC LaboratoriesS8507for lysis and kinase buffer
Sodium pyrophosphateFluka71501for lysis buffer
Super Signal West DuraProtein Biology34075for Western Blot
Syngene PxiOzymefor Western Blot
Tissue extracts

 		Biochain

 		P1234035 Brain
P12345152 Lung
P1234149 Liver
P1234188 Pancreas
P1234260 Testis		for Western Blot analysis

 
Transfer UnitBioradMini-Trans-Blotfor Western Blot
TrisEuromedex26-128-3094 Bfor lysis buffer
Tween-20Sigma-AldrichP7949for blocking buffer
Typhoon FLA9500GE Healthcareto read autoradiography
Typhoon TrioAmersham Bioscienceto read autoradiography
Whatman paperGE Healthcare3030-672for Western Blot

References

  1. Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).
  2. Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. 298, Science. New York, N.Y. 1912-1934 (2002).
  3. Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling. Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).
  4. Bhullar, K. S., et al. Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions. Molecular Cancer. 17, 48(2018).
  5. Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, Clifton, N.J. 349-364 (2008).
  6. Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).
  7. Wood, D. W. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).
  8. Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).
  9. Greenwood, C., et al. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
  10. Wang, X., Huang, L. Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1844, Clifton, N.J. 401-410 (2018).
  11. Raykova, D., et al. Let There Be Light! Proteomes. 4, (2016).
  12. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).
  13. Podobnik, M., et al. How to Study Protein-protein Interactions. Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).
  14. Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648(2014).
  15. Peck, S. C. Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).
  16. Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format. Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).
  17. Okano, I., et al. Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs. The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).
  18. Croft, D. R., et al. p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton. Cell Research. 21, 666-682 (2011).
  19. Tastet, J., et al. LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability. Neuroscience. 399, 199-210 (2019).
  20. Vallee, B., et al. LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b. The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).
  21. Lee, Y. C., et al. Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation. Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

148immunoprecipitation32P ATP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved