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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Abbiamo caratterizzato una nuova proteina della chinasi utilizzando robusti approcci biochimici: analisi Western Blot con un anticorpo specifico dedicato su diverse linee cellulari e tessuti, interazioni con esperimenti di coimmunoprecipitazioni, attività della chinasi rilevata da Western Blot utilizzando un anticorpo specifico per ilfosforo e con l'etichettatura ATP di z[32 P].

Abstract

L'ampio sequenziamento dell'intero genoma ha identificato molti Open Reading Frame (ORF) che forniscono molte potenziali proteine. Queste proteine possono avere ruoli importanti per la cellula e possono svelare nuovi processi cellulari. Tra le proteine, le chinasi sono i principali attori in quanto appartengono ai percorsi di segnalazione cellulare e hanno la capacità di attivare o disattivare molti processi cruciali per il destino della cellula, come la crescita cellulare, la divisione, la differenziazione, la motilità e la morte.

In questo studio, ci siamo concentrati su una nuova potenziale proteina della chinasi, LIMK2-1. Abbiamo dimostrato la sua esistenza da Western Blot utilizzando un anticorpo specifico. Abbiamo valutato la sua interazione con una proteina a monte che regola utilizzando esperimenti di coimmunoprecipitazioni. La coimmunoprecipitazione è una tecnica molto potente in grado di rilevare l'interazione tra due proteine bersaglio. Può anche essere utilizzato per rilevare nuovi partner di una proteina esca. La proteina esca può essere purificata tramite un tag progettato alla sua sequenza o tramite un anticorpo che la ridestina specificamente. Questi complessi proteici possono quindi essere separati da SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) e identificati utilizzando la spettrometria di massa. Immunoprecipitato LIMK2-1 è stato utilizzato anche per testare la sua attività di chinasi in vitro da z[32P] ETICHETTAtura ATP. Questo saggio ben consolidato può utilizzare molti substrati diversi, e versioni mutate dell'esca possono essere utilizzate per valutare il ruolo di residui specifici. Gli effetti degli agenti farmacologici possono anche essere valutati poiché questa tecnica è sia altamente sensibile che quantitativa. Ciò nonostante, la manipolazione della radioattività richiede particolare cautela. L'attività della chinasi può anche essere valutata con anticorpi specifici che prendono di mira il gruppo di fosforo dell'amminoacido modificato. Questi tipi di anticorpi non sono disponibili in commercio per tutti i residui modificati al fosforo.

Introduzione

Per molti decenni, sono state chiarite numerose vie di segnalazione e il loro coinvolgimento in processi cellulari cruciali come la divisione cellulare, la differenziazione, la motilità, la morte cellulare programmata, l'immunità e la neurobiologia, è stato dimostrato. Le chinasi svolgono un ruolo significativo in questi percorsi di segnalazione in quanto spesso regolano finemente la loro attivazione o inattivazione e fanno parte di complessi versatili transitori che rispondono agli stimoli esterni1,2,3. La mutazione e la disregolazione delle chinasi spesso portano a malattie nell'uomo, e quindi sono diventate uno dei più importanti obiettivi farmacologici negli ultimi quarant'anni4.

In questo contesto, è importante essere in grado di rilevare l'interazione della chinasi con le loro autorità di regolamentazione a monte o conto rizzate a valle e identificare nuovi partner. La purificazione dell'affinità e l'immunoprecipitazioni sono tecniche molto potenti per l'isolamento dei complessi proteici5. La proteina o chinasi dell'esca può essere etichettata con una specifica sequenza di peptidi che consente l'uso di perline commerciali accoppiate covalentmente con anticorpi che colpiscono il peptide. Questo materiale permette un'elevata riproducibilità negli esperimenti6,7,8. Le proteine endogene possono anche essere immunoprecipitate utilizzando anticorpi che colpiscono direttamente la proteina esca. Gli anticorpi possono essere collegati in modo incrociato alle perle proteiche A o Agarose proteiche o semplicemente incubati con queste perline prima di aggiungere il lisato. I buffer di lisi devono essere ottimizzati per consentire la solubilità delle proteine senza perdere l'interazione ed evitare la degradazione delle proteine. Uno svantaggio principale di questo approccio è che l'interazione viene rilevata sulla lisi cellulare; pertanto, le interazioni transitorie o deboli, insieme a quelle che richiedono il contesto subcellulare possono essere perse. Altre tecniche possono essere utilizzate per lavorare direttamente nella cella come Proximity Ligation Assay (PLA)9, in vivo cross-linking-assisted affinity purification (XAP)10, Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) o F Trasferimento (FRET)11,12. Inoltre, l'immunoprecipitazioni non è appropriata per determinare le costanti termodinamiche dell'attacco, per le quali sono necessarie tecniche fisiche come la risonanza del Plasmona di superficie, la calorimetria della frequenza isotermale o la termofore microscala 13,14.

L'attività della chinasi può essere valutata utilizzando più tecniche. Qui, ci siamo concentrati sugli anticorpi specifici per il fosforo e in vitro:[32P] ATP (Adenosine TriPhosphate) etichettatura. Gli anticorpi specifici per il fosforo prendono di mira la modifica del fosfato di un particolare residuo all'interno di una proteina. Possono essere utilizzati in Western Blot o ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) dopo la lisi cellulare, per l'immunohistochimica, e anche su cellule intatte utilizzando citometria di flusso o immunofluorescenza. I loro inconvenienti possono includere la loro mancanza di specificità, che può essere valutata utilizzando una versione mutata della proteina bersaglio, e non sono disponibili commercialmente per tutte le proteine. L'etichettaturaATP in vitro[32 P] è un metodo molto robusto, consolidato e altamente sensibile15. Possono essere utilizzate proteine immunoprecipitate o ricombinanti e possono essere testati diversi substrati. Gli effetti delle droghe possono anche essere valutati in quanto questo metodo è quantitativo. Il suo principale inconveniente è che la radioattività associata all'approccio richiede una gestione con cautela. Sono possibili anche metodi alternativi basati sulla misurazione dei substrati peptidi fluorescenti o luminescenti e sfruttando le proprietà fluorescenti/luminescenti alterate al fosforo. Tali metodi consentono anche un'elevata produttività, che è necessaria, ad esempio, nello screening di molecole che possono essere potenziali inibitori della chinasi bersaglio. Infatti, le chinasi rappresentano una delle più grandi classi di bersagli farmacologici perseguiti dalle aziende farmaceutiche16.

In questo studio, ci siamo concentrati sulla proteina LIMK2-1 (LIMK2-1 sta per Lin11, Isle1, Mec3 Kinase isoform 2-1). La proteina della chinasi LIMK2 è stata descritta per la prima volta nel 199517. Tre isoformi di LIMK2 sono prodotti da giunzioni alternative: LIMK2a, LIMK2b e LIMK2-1. Attualmente, LIMK2-1 è stato descritto solo a livello di mRNA in un singolo studio18. Qui, caratterizziamo questa potenziale nuova proteina della chinasi a livello molecolare usando approcci biochimici robusti. In primo luogo, dimostriamo che LIMK2-1 è effettivamente sintetizzato. Simile alle sue due controparti, LIMK2a e LIMK2b, interagisce con la chinasi a monte ROCK (chinasi proteica associata a Rho). Mostriamo che LIMK2-1 ha un'attività di chinasi sulle proteine di base mielina (MBP), ma non sulla cofilina, il substrato canonico delle chinasi LIM.

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Protocollo

1. Preparazione cellulare per la trasfezione

DESTRA: Tutti i passi della coltura cellulare devono essere eseguiti in un laboratorio dedicato e le cellule vengono manipolate all'interno di un mobile microbiologico di classe 2.

  1. Cellule di semi HEK-293 (Rene embrionale umano) in piastre da 10 cm in 10 mL di DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium) completate con siero di vitello fetale al 10%. Coltura per 3-5 giornisotto il 5% di CO 2, a 37 gradi centigradi, fino a raggiungere il 90% di confluenza.
  2. Trattare le lastre di 10 cm con il collagene R per aumentare l'adesione cellulare alle piastre di plastica.
    1. Aggiungere 5 mL di una soluzione di Collagen R, 200 volte diluita in Fosfato Saline Buffer (PBS) in una piastra di 10 cm. Sovrapporre il liquido su tutta la superficie della piastra.
    2. Incubare a temperatura ambiente per almeno 1 h all'interno dell'armadio di biosicurezza.
    3. Rimuovere la soluzione di collagene e scartarla. Aggiungere 5 mL di PBS, stenderlo su tutta la superficie della piastra, rimuoverlo e scartarlo. Ripetere questo lavaggio una volta.
    4. Aggiungere 8 mL di DMEM integrato con 10% siero di vitello fetale. Mantenere le piastre preparate all'interno dell'armadio di biosicurezza.
  3. Prendere le piastre HEK-293 dal punto 1.1 all'interno dell'armadio di biosicurezza. Togliere il mezzo dai piatti e scartarlo in un cestino candeggina dedicato. Aggiungere 2 mL di DMEM integrato e scovare le cellule per staccarle utilizzando il flusso di una micropipetta da 1 mL, avendo cura di evitare di produrre schiuma.
  4. Raccogliere le celle in un tubo da 15 mL e aggiungere 4 mL di DMEM integrato. Omogeneizzare con una pipetta da 10 mL, pipettando su e giù 3 volte.
  5. Prendere 2 mL di questa soluzione cellulare e aggiungerli a piatti trattati con collagene contenenti DMEM integrati dal passaggio 1.2.4.
  6. Crescere per 24 ore in incubatrice al 5% di CO2 e 37 gradi centigradi. Le cellule devono essere 50-80% confluente al momento della trasfezione.

2. Trafetti transitori

  1. Rimuovere il mezzo dalle piastre, scartarlo in un cestino candeggina dedicato e aggiungere 10 mL di DMEM fresco integrato. Rimettere le piastre nell'incubatrice a 37 gradi centigradi mentre si prepara la miscela di trasfezione.
  2. In un tubo da 15 mL, aggiungere 450 gradi di una soluzione di 10 m Tris-HCl pH 7,5/1 mM EDTA (Tris sta per Tris(idxymethyl)aminomethane, e EDTA per l'acido etiletilinitrilotetraacetica) e 50 -L di una soluzione CaCl2 da 2,5 M. Mescolare per inversione.
  3. Aggiungere 10 g di DNA plasmidico (acido deossiribonucleico) preparati da una preparazione midi su una coltura liquida di batteri trasformati con il plasmide dedicato. Mescolare per inversione.
  4. Sotto agitazione liscia su un vortice, aggiungere 500 L di BES tampomato concentrato salina 2x (composizione: BES, 10,7 g/L, NaCl, 16.0 g/L, Na2HPO4, 0.27 g/L; BES è l'acronimo di N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurina) lentamente goccia dopo goccia.
  5. Incubare per almeno 15 min (fino a 45 min) a temperatura ambiente all'interno dell'armadio di biosicurezza. Non vortice, non mescolare! Spostare i tubi con molta attenzione per non disturbare la formazione complessa tra DNA e fosfato di calcio.
  6. Portare le piastre dal punto 2.1 all'armadietto di sicurezza. Aggiungere i complessi di DNA con molta attenzione, goccia dopo goccia, sulle cellule su tutta la superficie della piastra.
  7. Incubare per 24-72 ore in incubatrice a 37 gradi centigradi. Di solito la massima espressione proteica viene raggiunta entro 48 ore.

3. Lisi

NOTA: Lavorare sul ghiaccio e con tamponi freddi per prevenire la degradazione delle proteine.

  1. Preparare il buffer di lisi: 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50 mM NaF, 10 mM di sodio pirofosfato, 1 mM 4 VO4, 20 mM p-nitrophenyl fosfato, 20 mM -glycerofosfato, 10 g/mL aprotinin, 0.05 acido/mL okadic , 1 legaeptina g/mL e 1 mM PMSF (fluoruro di fenilmethylsulfonyl). Per ogni piastra trastratta sono necessari circa 4 mL di tampone di lisi.
  2. Rimuovere le piastre con cellule trasfette dall'incubatrice. Mettili sul ghiaccio.
    NOTA: Da questo passaggio, è possibile lavorare su una panca "normale".
  3. Rimuovere il supporto e eliminarlo in un cestino candeggina dedicato.
  4. Lavare due volte con 3 mL di PBS freddo: aggiungere 3 mL di PBS sul lato della piastra cadere a goccia per evitare di staccare le cellule trasfette, diffondersi su tutta la superficie della piastra, rimuovere PBS e scartarlo; ripetere questo passaggio ancora una volta. Alla fine, rimuovere con attenzione il resto del PBS inclinando la piastra per evitare la diluizione del tampone di lisi per la fase successiva.
  5. Aggiungere 500 l di lisi fredda tampone sulle cellule lavate trasinate. Stendere su tutta la superficie della piastra.
  6. Incubare per 10 min sul ghiaccio. Di tanto in tanto (almeno due volte), stendere nuovamente il buffer su tutta la superficie della piastra.
  7. Raschiare le cellule e raccoglierle in un tubo di microcentrismo.
  8. Centrifuga per 10 min a 10.000 x g a 4 gradi centigradi.
  9. Raccogliere supernatali in un nuovo tubo di microcentrifuga. Questa frazione corrisponde al lisato (estratto di cella intera). Scartare il pellet che corrisponde ai detriti della membrana cellulare.
  10. Raccogliere un'aliquota di questa frazione in un nuovo tubo di microcentrifuga (circa 50 -L). Questa frazione corrisponde alla "frazione TOTALE" o "Cell Lysate" o "Whole Cell Extract" permettendo l'analisi se le proteine trasfette sono espresse da Blot occidentale.
    NOTA: A questo punto, i campioni possono essere utilizzati direttamente per le analisi Western Blot. Il buffer Laemmli deve essere aggiunto al campione, che viene poi riscaldato a 95 gradi centigradi per 5 min, centrifugato a 10.000 x g per 5 min e caricato su SDS-PAGE appropriato. I campioni possono anche essere conservati a -80 gradi centigradi.

4. Immunoprecipitazioni

  1. Revista delicatamente le perline di agarose accoppiate con l'anticorpo appropriato: HA (Human influenza emagglutinin), Flag, or GFP (Green Fluorescent Protein) per inversione liscia.
  2. Tagliare la fine di una punta di 200 l'l da una micropipetta per consentire alle perline di entrare nella punta. Pipette le perline su e giù più volte per saturare la punta per garantire di prendere il volume corretto di perline.
  3. Prendere 40 l di perline in un tubo di microcentrifuga.
  4. Aggiungere 500 l di TENET (30 mM Tris-HCl pH 7,5, 120 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100) buffer. Mescolare per inversione. Centrifuga per 2 min a 1.000 x g a 4 gradi centigradi. Rimuovere con attenzione supernatante e scartarlo. Aggiungere 500 l di TENET. Incubare per almeno 1 ora a 4 gradi centigradi su una ruota rotante.
    NOTA: questa fase di pre-incubazione in TENET consente di ridurre le interazioni non specifiche e quindi di ridurre il segnale di fondo.
  5. Lavare le perline due volte con 500 l di lis tampone.
    1. Centrifuga 2 min a 1.000 x g a 4 gradi centigradi.
    2. Rimuovere con attenzione buffer supernatante, e scartarlo.
      NOTA: Non fare attenzione a non aspirare perline durante questi passaggi di lavaggio.
    3. Aggiungere 500 l di buffer di lisi. Omogeneizzare invertendo il tubo.
    4. Ripetere i passaggi da 4.5.1 a 4.5.3.
  6. Centrifuga per 2 min a 1.000 x g a 4oC. Rimuovere con attenzione il buffer supernatante e scartarlo.
  7. Incubare perline con il lisa dal passo 3.9 per 2 a 4 ore a 4 gradi centigradi su una ruota rotante.
  8. Lavare perline immunoprecipitate.
    NOTA: A questo punto, le perle immuno precipitate possono essere lavate cinque volte con il buffer di lisi e quindi eluite con buffer Laemmli. L'eluato può essere utilizzato per l'analisi Western Blot o immagazzinato a -80 gradi centigradi. In alternativa, le perline possono essere lavate due volte con il tampone dilisi e poi tre volte con il tampone di chinasi per eseguire l'etichettatura ATP.

5. Analisi della coimmunoprecipitazioni

  1. Lavare le perle immunoprecipitate dal punto 4.7 con il tampone di lisi.
    1. Centrifuga per 2 min a 1.000 x g in una centrifuga refrigerata a 4 gradi centigradi.
    2. Rimuovere con attenzione il supernatante e scartarlo.
    3. Aggiungere 500 l di buffer di lisi. Omogeneizzare invertendo il tubo.
    4. Ripetere i passaggi 5.1.1.1-5.1.3 quattro volte.
  2. Eluizione
    1. Centrifuga per 2 min a 1.000 x g in una centrifuga refrigerata a 4 gradi centigradi.
    2. Rimuovere con attenzione il supernatante e scartarlo. Rimuovere le ultime gocce di supernatante con una siringa Hamilton al fine di evitare l'aspirazione delle perline, e scartare il super-attardato.
    3. Aggiungere 40 l di 4x Laemmli buffer (200 mMM Tris/HCl pH 6,8, 4% SDS, 40% glicerolo, 0,5 M-mercaptoetanolo, 0,02% blu bromophenolo). Omogeneizzare toccando delicatamente il tubo.
    4. Incubare per 5 min a temperatura ambiente.
    5. Centrifuga per 5 min a 10.000 x g a temperatura ambiente.
    6. Con una siringa Hamilton, rimuovere il supernatante e raccoglierlo in un nuovo tubo di microcentrifuga. Questa frazione corrisponde al "Eluate", che può essere immagazzinato a -80 gradi centigradi, o analizzato direttamente da Western Blot.

6. Assay di Kinase

  1. Preparare il buffer di chinasi: 50 mM HEPES-NaOH pH 7.5 (HEPES sta per 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanethanethanfonic acid), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM MnCl2, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 20 mM MM-glicerofossfato, 1 g/mL leupeptina e 1 mM PMSF. Per ogni condizione di immunoprecipitazioni è necessario circa 2 mL del tampone di chinasi.
  2. Lavare le perle immunoprecipitate dal punto 4,7 due volte con 500 l di lis tampone.
    1. Centrifuga per 2 min a 1.000 x g in una centrifuga refrigerata a 4 gradi centigradi.
    2. Rimuovere con attenzione il supernatante e scartarlo. Aggiungere 500 l di buffer di lisi. Omogeneizzare per inversione.
    3. Ripetere i passaggi 6.2.1 e 6.2.2.
  3. Lavare le perle immunoprecipitate tre volte con 500 litri di tampone di chinasi.
    1. Centrifuga per 2 min a 1.000 x g in una centrifuga refrigerata a 4 gradi centigradi.
    2. Rimuovere con attenzione il supernatante e scartarlo. Aggiungere 500 l di tampone di chinasi. Omogeneizzare per inversione.
    3. Ripetere i passaggi 6.3.1 e 6.3.2 due volte.
  4. Centrifuga per 2 min a 1.000 x g in una centrifuga refrigerata a 4 gradi centigradi.
  5. Rimuovere con attenzione il supernatante e scartarlo. Rimuovere le ultime gocce di supernatante con una siringa Hamilton al fine di evitare l'aspirazione delle perline, e scartare il super-attardato.
  6. Aggiungere 40 l di tampone di chinasi alle perline immunoprecipitate. Risospendere le perline toccando delicatamente il tubo.
  7. Preparare il mix perl'etichettatura ATP (il volume finale è di 22,5 l, completo di cuscinetto di chinasi) in un tubo di blocco sicuro.
    1. Aggiungere il volume richiesto del buffer di chinasi per raggiungere un volume finale di 22,5 l.
    2. Tagliare l'estremità di una punta di 20 l di una micropipetta. Risospendere le perline immunoprecipitate dal passaggio 6.6 pipetting su e giù più volte. Raccogliere 10 l di queste perline nel tubo di sicurezza.
    3. Aggiungere l'ATP da una soluzione di 10 M per raggiungere i 50 mM di concentrazione finale. In base al numero di campioni trattati, viene suggerita una diluizione della soluzione di riserva di ATP nel tampone della chinasi per consentire la pipetta da 1 a 2 - per essere sicuri che il volume sia corretto.
    4. Aggiungete 2,5 g di substrato (cofilina o proteine di base della mielina, MBP nel caso di studio attuale).
  8. Aggiungete 5 -Ci di ATP (3.000 Ci/mmol) per avviare la reazione. Mescolare pipetting su e giù lentamente.
    AVVISO: Da questo punto, il lavoro deve essere svolto in un luogo di sicurezza dedicato alle manipolazioni della radioattività con cautela precauzione, protezioni dedicate e controlli appropriati (scudi radioattivi, contatore Geiger, raccolta differenziata dei rifiuti, impronte per rilevare l'esposizione radioattiva, le punte dei filtri).
  9. Incubare per 20 min a 30 gradi centigradi.
  10. Fermare la reazione con 6 l'l di 5x buffer Laemmli.
  11. Riscaldare a 95o C per 5 minuti.
  12. Centrifuga a 10.000 x g per 5 min a temperatura ambiente.
  13. Caricare su un SDS-PAGE. Procedere alla migrazione.
    NOTA: Fare attenzione che la prima linea di libero - [32P] ATP non esce dal gel per evitare la contaminazione del serbatoio di migrazione.
  14. Macchiare il gel a temperatura ambiente.
    1. Rimuovere il gel dalle lastre di vetro.
    2. Procedere con tre bagni in acqua a temperatura ambiente.
    3. Macchiare il gel durante la notte con Coomassie Blue a temperatura ambiente.
    4. Demacchiare il gel con diversi bagni di lavaggio con acqua a temperatura ambiente.
  15. Avvolgere il gel con pellicola trasparente.
  16. Esporre per una notte o più su uno schermo fosforpoimmagine.
  17. Leggere lo schermo su un fosforoimmagine per rilevare bande etichettate.

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Risultati

LA proteina LIMK2-1 è sintetizzata
LIMK2-1 è menzionato nelle banche dati, ma finora solo un documento ha dimostrato l'esistenza del suo mRNA18. Rispetto ai suoi due omologhi, LIMK2a e LIMK2b, LIMK2-1 ha un dominio aggiuntivo di terminale C identificato come dominio inibitorio della proteina fosfogio 1 (PP1i). Abbiamo progettato un anticorpo che si rivolge a un peptide di questo dominio, aminoacidi 671-684 (Figura 1A

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Discussione

Qui, abbiamo usato robusti strumenti biochimici per caratterizzare a livello molecolare una nuova proteina, LIMK2-1, che si ritiene sia una chinasi basata sulla sua sequenza e sui suoi omologhi, LIMK2a e LIMK2b20.

In primo luogo, abbiamo dimostrato l'esistenza di LIMK2-1 a livello proteico usando l'analisi Western Blot con un anticorpo specifico. In seguito, abbiamo valutato la sua interazione con la chinasi a monte ROCK1, che è nota per regolare LIMK2a e LIMK2b, gli o...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto da La Ligue contre le Cancer, l'Association Neurofibromatoses et Recklinghausen e il Région Centre Val de Loire. Molte grazie ad Aurélie Cosson e Déborah Casas per i dati sulla citometria di flusso, e a Keyron Hickman-Lewis per una lettura approfondita del manoscritto.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibody anti-actinSigma-AldrichA1978for Western Blot
Antibody anti-c-MycInvitrogenMA1-21316for Western Blot
Antibody anti-cofilinCell signaling Technology3312/5175for Western Blot
Antibody anti-GFPSanta Cruzsc-9996for Western Blot
Antibody anti-HARoche Applied Science11687423001for Western Blot
Antibody anti-phospho-cofilinCell signaling Technology3313for Western Blot
Antibody Anti-PP1iEurogentecdesigned for this studyfor Western Blot
AprotininEuromedexA-162Bfor lysis buffer
ATPInvitrogenPV3227for γ[32P] labeling
γ[32P] ATPPerkin ElmerNEG502Afor γ[32P] labeling
BES buffered salineSigma-Aldrich14280for transfection
β-glycerophosphateSigma-AldrichG9422for lysis and kinase buffer
β-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148for Laemmli
BSASigma-AldrichA3059for blocking buffer
Bromophenol BlueSigma-AldrichB0126for Laemmli
CaCl2Sigma-AldrichC3881for transfection
CentrifugeSigma111-541
Collagen RPan BiotechP06-20166for transfection
Control siRNAAmbionAM4611for PP1i antibody specificity
Coomassie PageBlue Protein Staining SolutionThermo-Fisher24620for gel staining
EDTASigma-Aldrich3690for lysis buffer
Electrophoresis UnitBioradMini-Proteanfor Western Blot
EZview Red anti-HA affinity gelSigma-AldrichE6779for immunoprecipitation
GeneSys softwareOzymefor Western Blot acquisition
GeneTolls softwareOzymefor Western Blot quantification
GFP-trap beadsChromtekfor immunoprecipitation
GlycineEuromedex26-128-6405for transfer buffer
GST-cofilinUpstate Cell signaling12-556for γ[32P] labeling
Hamilton syringe 100 mLHamilton710to remove carefully supernatant from beads without aspirating them
HEPESSigma-AldrichH3375for kinase buffer
ImageQuant TL softwareGE Healthcarefor radioactivity acquisition and quantification
LIMK2 siRNAAmbions8191for PP1i antibody specificity
LeupeptinSigma-AldrichSP-04-2217for lysis and kinase buffer
MBPUpstate Cell signaling13-173for γ[32P] labeling
MgCl2Sigma-AldrichM8266for kinase buffer
MnCl2Sigma-Aldrich244589for kinase buffer
NaClEuromedex1112for lysis and kinase buffer
NaFSigma-AldrichS-1504for lysis and kinase buffer
Okaidic acidEuromedex0-2220for lysis buffer
PMSFSigma-Aldrich78830for lysis and kinase buffer
p-nitrophenylphosphateEuromedex1026for lysis buffer
PVDF membrane Immobillon-PMerck-MilliporeIPVH00010 pore size 0,45 mmfor Western Blot
Rotating wheelLabincofor bead incubation
Safe lock eppendorfEppendorf0030120.086for kinase assay
SDSSigma-Aldrich5030for Laemmli and migration buffer
Sodium orthovanadateLC LaboratoriesS8507for lysis and kinase buffer
Sodium pyrophosphateFluka71501for lysis buffer
Super Signal West DuraProtein Biology34075for Western Blot
Syngene PxiOzymefor Western Blot
Tissue extracts

 		Biochain

 		P1234035 Brain
P12345152 Lung
P1234149 Liver
P1234188 Pancreas
P1234260 Testis		for Western Blot analysis

 
Transfer UnitBioradMini-Trans-Blotfor Western Blot
TrisEuromedex26-128-3094 Bfor lysis buffer
Tween-20Sigma-AldrichP7949for blocking buffer
Typhoon FLA9500GE Healthcareto read autoradiography
Typhoon TrioAmersham Bioscienceto read autoradiography
Whatman paperGE Healthcare3030-672for Western Blot

Riferimenti

  1. Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).
  2. Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. 298, Science. New York, N.Y. 1912-1934 (2002).
  3. Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling. Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).
  4. Bhullar, K. S., et al. Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions. Molecular Cancer. 17, 48(2018).
  5. Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, Clifton, N.J. 349-364 (2008).
  6. Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).
  7. Wood, D. W. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).
  8. Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).
  9. Greenwood, C., et al. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
  10. Wang, X., Huang, L. Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1844, Clifton, N.J. 401-410 (2018).
  11. Raykova, D., et al. Let There Be Light! Proteomes. 4, (2016).
  12. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).
  13. Podobnik, M., et al. How to Study Protein-protein Interactions. Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).
  14. Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648(2014).
  15. Peck, S. C. Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).
  16. Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format. Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).
  17. Okano, I., et al. Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs. The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).
  18. Croft, D. R., et al. p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton. Cell Research. 21, 666-682 (2011).
  19. Tastet, J., et al. LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability. Neuroscience. 399, 199-210 (2019).
  20. Vallee, B., et al. LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b. The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).
  21. Lee, Y. C., et al. Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation. Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).

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