使用新激酶蛋白的强生化方法在分子水平上进行表征

摘要

我们使用强大的生化方法对一种新的激酶蛋白进行了定性:用特殊抗体对不同细胞系和组织进行西带体分析,通过共免疫沉淀实验相互作用,由西方检测到的激酶活性使用磷特异性抗体和由 β+³²P+ ATP 标记的斑点。

摘要

广泛的全基因组测序已经确定了许多开放阅读框架(ORFs),提供了许多潜在的蛋白质。这些蛋白质可能对细胞有重要作用,并可能解开新的细胞过程。在蛋白质中,激酶是主要参与者,因为它们属于细胞信号通路,能够打开或关闭许多对细胞命运至关重要的过程,如细胞生长、分裂、分化、运动和死亡。

在这项研究中,我们重点研究了一种新的潜在激酶蛋白LIMK2-1。我们用特定的抗体证明了它的存在。我们使用共免疫沉淀实验评估其与上游调节蛋白的相互作用。共免疫沉淀是一种非常强大的技术,能够检测两个目标蛋白之间的相互作用。它也可以用来检测诱饵蛋白的新伙伴。诱饵蛋白可以通过设计到其序列的标签进行纯化,或者通过专门针对它的抗体进行纯化。然后,这些蛋白质复合物可以通过SDS-PAGE(硫酸二苯基苯甲酸钠聚丙烯酰胺凝胶)分离,并使用质谱法进行鉴定。免疫沉淀LIMK2-1也用于通过β+³²P+ ATP标签在体外测试其激酶活性。这种成熟的测定可能使用许多不同的基质,诱饵的突变版本可用于评估特定残留物的作用。药理剂的作用也可以评估,因为这种技术是高度敏感和定量的。尽管如此,放射性处理需要特别小心。激酶活性也可以评估与特定抗体针对改性氨基酸的磷组。这些类型的抗体并非适用于所有磷改性残留物。

引言

几十年来,许多信号通路已被阐明,并表明它们参与关键的细胞过程,如细胞分裂、分化、运动、程序化细胞死亡、免疫和神经生物学。激酶在这些信号通路中起着重要作用,因为它们经常精细地调节其激活或失活,是响应外部刺激1,2,3的瞬态多功能复合物的一部分。激酶的突变和调节障碍经常导致人类疾病,因此在过去四十年中,它们已成为最重要的药物靶点之^一。

在此背景下,能够检测激酶与其上游稳压器或下游基板的相互作用并识别新的合作伙伴非常重要。亲和纯化和免疫沉淀是分离蛋白质复合物5的非常强大的技术。诱饵蛋白或激酶可以标记与特定的肽序列允许使用商业珠子共价结合抗体针对肽。这种材料允许在实验6,7,8中具有很高的可重复性。内源性蛋白也可以使用直接靶饵蛋白的抗体进行免疫沉淀。抗体可能与蛋白A或蛋白GAagagarose珠子交联,或在添加赖沙之前用这些珠子孵育。莱沙缓冲液必须经过优化,使蛋白质溶解而不失去相互作用,并避免蛋白质降解。这种方法的一个主要缺点是相互作用在细胞赖沙时被检测到;因此,瞬态或弱相互作用,以及那些需要亚细胞上下文可能错过。其他技术可用于直接在细胞中工作,如接近结扎测定(PLA)9、体内交联辅助亲亲纯化(XAP)10、生物发光共振能量转移(BRET)或Fürster共振能量转移 (FRET)^11,12。此外,免疫沉淀不适合确定结合的热力学常数,需要表面质原共振、等温分滴热量测定或微尺度热泳^{等物理技术13,14}.

可使用多种技术评估激酶活性。在此,我们专注于磷特异性抗体和体外β=³²P+ ATP(腺苷三磷酸)标签。磷特异性抗体针对蛋白质中特定残留物的磷酸盐修饰。它们可用于细胞裂解后西布洛特或ELISA(酶链接免疫吸附测定),用于免疫组织化学,以及使用流细胞学或免疫荧光的完整细胞。其缺点可能包括缺乏特异性,可以使用目标蛋白的突变版本进行评估,并且它们不能用于所有蛋白质。体外β=³²P+ ATP标签是一种非常健壮、成熟和高度敏感^{的方法15。}可使用免疫沉淀蛋白或重组蛋白,并测试不同的基质。药物的影响也可以评估,因为这种方法是定量的。其主要缺点是,与该方法相关的放射性需要谨慎处理。根据荧光或发光肽基质的测量,利用荧光/发光特性在磷酸化上改变的特性,也可以采用替代方法。这些方法还允许高通量,例如,在筛选可能成为目标激酶潜在抑制剂的分子时,这是必要的。事实上,激酶是制药公司追求的最大药物目标类别之^一。

在这项研究中,我们重点研究了LIMK2-1蛋白(LIMK2-1代表Lin11,岛1,Mec3激酶等形2-1)。LIMK2激酶蛋白于1995年首次被^描述17。通过替代拼接产生三种 LIMK2 等形:LIMK2a、LIMK2b 和 LIMK2-1。目前,LIMK2-1仅在一^项研究18中描述了mRNA水平。在此,我们使用强大的生化方法在分子水平上描述这种潜在的新激酶蛋白。首先,我们证明了LIMK2-1确实是合成的。与LIMK2a和LIMK2b的两种对应物类似,它与上游激酶ROCK(Rho相关蛋白激酶)相互作用。我们显示LIMK2-1在Myelin基本蛋白(MBP)上有激酶活性,但在LIM激酶的规范基质cofilin上没有。

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研究方案

1. 转染的细胞制备

注意:细胞培养的所有步骤必须在专门的实验室中执行,并且细胞在2类微生物柜内操作。

1. 种子HEK-293(人类胚胎肾)细胞在10 mL的DMEM(Dulbeco的改性鹰中等)的10厘米板中,辅以10%的胎儿小牛血清。在5%CO₂下培养3至5天,在37°C下,直到细胞达到+90%的汇合。
2. 使用胶原蛋白 R 处理 ± 10 厘米板,以增加细胞对塑料板的附着力。
   1. 加入5 mL的胶原蛋白R溶液,在±10 cm的板中稀释磷酸盐盐碱缓冲液(PBS)200倍。将液体覆盖在板的整个表面上。
   2. 在室温下在生物安全柜内孵育至少1小时。
   3. 去除胶原蛋白溶液,并丢弃它。加入 5 mL 的 PBS,将其铺在板面上,取出并丢弃。重复此洗涤一次。
   4. 加入8 mL的DMEM补充10%胎儿小牛血清。将准备好的盘子放在生物安全柜内。
3. 从生物安全柜内的步骤 1.1 中取取 HEK-293 板。从盘子中取出介质,并将其丢弃在专用漂白垃圾中。加入2 mL的补用DMEM,用1 mL微管的流量冲洗细胞以分离它们,注意避免产生泡沫。
4. 收集细胞在15 mL管,并添加4 mL的补充DMEM。使用 10 mL 移液器进行均匀化,向上和向下移液 3 次。
5. 取2 mL的这种细胞溶液,并把它们添加到胶原蛋白处理板含有补充DMEM从步骤1.2.4。
6. 在 5% CO₂和 37 °C 下在培养箱中生长 24 小时。细胞在转染时应为50-80%的结对。

2. 瞬态转染

1. 从盘子中取出介质,将其丢弃在专用漂白垃圾桶中,并加入 10 mL 的新鲜补充 DMEM。在制备转染混合物时,在37°C下将板放回培养箱中。
2. 在 15 mL 管中,加入 450 μL 的 10 mM Tris-HCl pH 7.5/1 mM EDTA(Tris 代表 Tris(羟基甲基)氨基甲烷,EDTA 用于乙烯四乙酸溶液和 50 μL 的 2.5 M CaCl₂溶液。通过反转混合。
3. 在用专用质粒转化的液体培养体上加入10μg的质质DNA(脱氧核糖核酸)。通过反转混合。
4. 在涡旋下平滑搅拌下,加入500 μL的BES缓冲盐水2x浓缩物(成分:BES,10.7 g/L,NaCl,16.0 g/L,Na₂HPO₄, 0.27 g/L;BES 代表 N、N-Bis(2-羟基乙醚)-2-氨基硫酸、N、N-Bis(2-羟基乙醚)牛磺酸)缓慢地滴落。
5. 在生物安全柜内室温下孵育至少15分钟(最多45分钟)。不要涡旋,不要混合!非常小心地移动管子,以免干扰DNA和磷酸钙之间的复杂形成。
6. 将板从步骤 2.1 带到安全柜。非常小心地加入DNA复合物,一滴一滴地加入板表面的细胞上。
7. 在37°C的培养箱中孵育24至72小时。通常在48小时内达到最大的蛋白质表达。

3. 莱西斯

注:在冰上工作,用冷缓冲液防止蛋白质降解。

1. 制备莱沙缓冲液:50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 50 mM NaF, 10 mM 焦磷酸钠, 1 mM Na₃VO₄, 20 mM p-硝基磷酸, 20 mM β-乙二醇, 10 μg/mL 丙氨酸, 0.05 μg/m l okiaid 酸,1 μg/mL 白蛋白和1 mM PMSF(苯基硫磺酸氟化物)。每个转染板需要大约 4 mL 的莱沙缓冲液。
2. 从培养箱中取出具有转染细胞的板。把它们放在冰上
   注: 从此步骤中,可以在"正常"工作台上工作。
3. 取出介质,并将其丢弃在专用漂白垃圾桶中。
4. 用3 mL的冷PBS清洗两次:在板侧滴加入3mL的PBS,以避免分离转染细胞,铺在板的表面,取出PBS并丢弃;再次重复此步骤。最后,通过倾斜板来小心地去除 PBS 的其余部分,以防止下一步的液化缓冲液稀释。
5. 在转染过用的洗涤细胞上加入500μL的冷液化缓冲液。把它铺在盘子的表面。
6. 在冰上孵育10分钟。不时(至少两次),再次将缓冲液铺在板的表面。
7. 将细胞报废,并收集在微离心管中。
8. 在 4 °C 下在 10,000 x g下离心 10 分钟。
9. 在新的微离心管中收集上清液。此分数对应于解物(整个细胞提取物)。丢弃与细胞膜碎片对应的颗粒。
10. 将此分数的等分收集到新的微离心管(约 50 μL)。此分数对应于"TOTAL 分数"或"细胞解酶"或"全细胞提取物",允许分析转染的蛋白质是否由西布洛特表示。
    注:此时,样品可直接用于西布洛特分析。Laemmli 缓冲液必须添加到样品中,然后在 95°C 加热 5 分钟,在 10,000 x g下离心 5 分钟,并加载到适当的 SDS-PAGE 上。样品也可储存在-80°C。

4. 免疫沉淀

1. 通过平滑反转轻轻重新悬浮抗胶珠与适当的抗体:HA(人类流感血凝素)、旗或GFP(绿色荧光蛋白)。
2. 从微移液器中切下 200 μL 尖端的末端,让珠子进入尖端。上下多次移珠,使尖端饱和,以确保取正确体积的珠子。
3. 在微离心管中取40μL的珠子。
4. 添加 500 μL 的 TENET(30 mM Tris-HCl pH 7.5、120 mM NaCl、5 mM EDTA、1% Triton X-100)缓冲液。通过反转混合。在 4 °C 下在 1,000 x g下离心 2 分钟。小心地取出上清液并丢弃它。添加 500 μL 的 TENET。在旋转的车轮上在 4°C 下孵育至少 1 小时。
   注:TENET 中的此预孵化步骤可减少非特定相互作用,从而减少背景信号。
5. 用500 μL的莱沙缓冲液清洗珠子两次。
   1. 在 4°C 下在 1,000 x g下离心 2 分钟。
   2. 小心地取出上清缓冲液,然后丢弃它。
      注意:在这些洗涤步骤中,注意不要吸珠。
   3. 添加500 μL的莱沙缓冲液。通过反转管进行均质化。
   4. 重复步骤 4.5.1- 4.5.3。
6. 在 4°C 下在 1,000 x g下离心 2 分钟。小心地删除上清缓冲液,并丢弃它。
7. 在旋转轮上4°C下用步骤3.9中的解酶孵育珠2至4小时。
8. 清洗免疫沉淀珠子。
   注:此时,免疫沉淀的珠子可用溶酶缓冲液洗涤五次,然后用莱姆利缓冲液洗净。洗液可用于西布洛特分析或储存在-80°C。或者,珠子可以使用交相缓冲液洗涤两次,然后用激酶缓冲液洗涤三次,以执行β=³²P+ ATP标签。

5. 共免疫沉淀分析

1. 使用莱沙缓冲液从步骤 4.7 中清洗免疫沉淀珠子。
   1. 在4°C的冷冻离心机中,在1,000 x g下离心2分钟。
   2. 小心地取出上清液,然后丢弃它。
   3. 添加500 μL的莱沙缓冲液。通过反转管进行均质化。
   4. 重复步骤 5.1.1-5.1.3 四次。
2. 洗 脱
   1. 在4°C的冷冻离心机中,在1,000 x g下离心2分钟。
   2. 小心地取出上清液,然后丢弃它。用汉密尔顿注射器取出最后一滴上清液,以避免珠子的吸入,并丢弃上清液。
   3. 加入40μL的4x莱姆利缓冲液(200 mM Tris/HCl pH 6.8,4%SDS,40%甘油,0.5M β-甲基苯丙醇,0.02%溴酚蓝色)。轻轻敲击管子,使同质化。
   4. 在室温下孵育5分钟。
   5. 在室温下在10,000 x g下离心5分钟。
   6. 使用汉密尔顿注射器,取出上清液,并将其收集到新的微离心管中。此分数对应于"Eluate",它可以存储在-80°C,或由西布洛特直接分析。

6. 激酶测定

1. 准备激酶缓冲液: 50 mM HEPES-NaOH pH 7.5 (HEPES 代表 4-(2-羟基乙)-1-管乙酸, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 5 mM MnCl₂, 50 mM M M NaF, 1 mM Na₃VO_4,20 mM M = -乙酸, 1μg利肽和 1 mM PMSF。每个免疫沉淀条件需要大约 2 mL 的激酶缓冲液。
2. 用500μL的莱沙缓冲液两次从步骤4.7洗涤免疫沉淀珠子。
   1. 在4°C的冷冻离心机中,在1,000 x g下离心2分钟。
   2. 小心地去除上清液,并丢弃它。添加500 μL的莱沙缓冲液。通过反转进行均质化。
   3. 重复步骤 6.2.1 和 6.2.2。
3. 用500μL的激酶缓冲液清洗免疫沉淀珠三次。
   1. 在4°C的冷冻离心机中,在1,000 x g下离心2分钟。
   2. 小心地去除上清液,并丢弃它。加入500μL的激酶缓冲液。通过反转进行均质化。
   3. 重复步骤 6.3.1 和 6.3.2 两次。
4. 在4°C的冷冻离心机中,在1,000 x g下离心2分钟。
5. 小心地去除上清液,并丢弃它。用汉密尔顿注射器取出最后一滴上清液,以避免珠子的吸入,并丢弃上清液。
6. 向免疫沉淀珠中加入40μL激酶缓冲液。轻轻敲击管子,重新悬挂珠子。
7. 在安全锁管中准备用于 +³²P+ ATP 标签的混合物(最终体积为 22.5 μL,带激酶缓冲液)。
   1. 添加所需的激酶缓冲液体积,最终体积达到22.5 μL。
   2. 切割微管20μL尖端的末端。通过上下移液,从步骤6.6中重新悬浮免疫沉淀珠子。将这些珠子收集到安全锁管中。
   3. 从 10 μM 库存溶液中添加 ATP,达到 50 mM 的尾数浓度。根据处理的样本数量,建议稀释激酶缓冲液中的ATP库存溶液,以允许移液器1至2μL,以确保体积正确。
   4. 加入2.5μg基质(蛋白或骨髓基本蛋白,MBP,在本研究案例中)。
8. 加入5[Ci]+32 P+ATP(3,000 Ci/mmol)以启动反应。缓慢上下移液混合。
   注意:从此时起,工作必须在专用于放射性操作的安全场所进行,并谨慎防范、专门保护和适当的控制(放射性防护罩、盖革计数器、特定废物收集、个人乳房和手指徽章检测放射性暴露,过滤提示)。
9. 在30°C下孵育20分钟。
10. 用 6 μL 的 5x 莱姆利缓冲液停止反应。
11. 在 95°C 下加热 5 分钟
12. 在室温下以10,000 x g离心5分钟。
13. 加载到 SDS-PAGE 上。继续迁移。
    注:请注意,自由 +³²P+ ATP 的前端不会退出凝胶,以避免迁移罐受到污染。
14. 在室温下染色凝胶。
    1. 从玻璃板上取出凝胶。
    2. 在室温下在水中洗三个澡。
    3. 在室温下用库马西蓝染色凝胶过夜。
    4. 在室温下用水冲洗凝胶。
15. 用塑料包装包裹凝胶。
16. 在荧光仪屏幕上曝光一晚或更长时间。
17. 读取荧光仪上的屏幕以检测标记的带。

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结果

合成LIMK2-1蛋白
LIMK2-1在数据库中被提及,但到目前为止只有一篇论文表明其mRNA18的存在。与LIMK2a和LIMK2b的两个同源体相比,LIMK2-1有一个额外的C端域,被识别为蛋白磷酸酶1抑制域(PP1i)。我们设计了一种针对该领域的肽的抗体,氨基酸671-684(图1A)。
针对人类蛋白质数据库的BLAST研究表明,只有一种蛋白质,PHI-1(磷酸酶全酶抑制...

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讨论

在这里,我们使用了强大的生化工具,在分子水平上描述一种新的蛋白质LIMK2-1,它被认为是基于其序列和同源性、LIMK2a和LIMK2b20的激酶。

首先,利用西布洛特与特定抗体的分析,在蛋白质水平上证明了LIMK2-1的存在。之后,我们评估了它与上游激酶ROCK1的相互作用,后者已知调节LIMK2a和LIMK2b,LIMK2-1的同源。最后,我们通过体外β32 P+ ATP标签和西布洛特在纤维素中使...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody anti-actin	Sigma-Aldrich	A1978	for Western Blot
Antibody anti-c-Myc	Invitrogen	MA1-21316	for Western Blot
Antibody anti-cofilin	Cell signaling Technology	3312/5175	for Western Blot
Antibody anti-GFP	Santa Cruz	sc-9996	for Western Blot
Antibody anti-HA	Roche Applied Science	11687423001	for Western Blot
Antibody anti-phospho-cofilin	Cell signaling Technology	3313	for Western Blot
Antibody Anti-PP1i	Eurogentec	designed for this study	for Western Blot
Aprotinin	Euromedex	A-162B	for lysis buffer
ATP	Invitrogen	PV3227	for γ[32P] labeling
γ[32P] ATP	Perkin Elmer	NEG502A	for γ[32P] labeling
BES buffered saline	Sigma-Aldrich	14280	for transfection
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422	for lysis and kinase buffer
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	for Laemmli
BSA	Sigma-Aldrich	A3059	for blocking buffer
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126	for Laemmli
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881	for transfection
Centrifuge	Sigma	111-541
Collagen R	Pan Biotech	P06-20166	for transfection
Control siRNA	Ambion	AM4611	for PP1i antibody specificity
Coomassie PageBlue Protein Staining Solution	Thermo-Fisher	24620	for gel staining
EDTA	Sigma-Aldrich	3690	for lysis buffer
Electrophoresis Unit	Biorad	Mini-Protean	for Western Blot
EZview Red anti-HA affinity gel	Sigma-Aldrich	E6779	for immunoprecipitation
GeneSys software	Ozyme		for Western Blot acquisition
GeneTolls software	Ozyme		for Western Blot quantification
GFP-trap beads	Chromtek		for immunoprecipitation
Glycine	Euromedex	26-128-6405	for transfer buffer
GST-cofilin	Upstate Cell signaling	12-556	for γ[32P] labeling
Hamilton syringe 100 mL	Hamilton	710	to remove carefully supernatant from beads without aspirating them
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	for kinase buffer
ImageQuant TL software	GE Healthcare		for radioactivity acquisition and quantification
LIMK2 siRNA	Ambion	s8191	for PP1i antibody specificity
Leupeptin	Sigma-Aldrich	SP-04-2217	for lysis and kinase buffer
MBP	Upstate Cell signaling	13-173	for γ[32P] labeling
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	for kinase buffer
MnCl2	Sigma-Aldrich	244589	for kinase buffer
NaCl	Euromedex	1112	for lysis and kinase buffer
NaF	Sigma-Aldrich	S-1504	for lysis and kinase buffer
Okaidic acid	Euromedex	0-2220	for lysis buffer
PMSF	Sigma-Aldrich	78830	for lysis and kinase buffer
p-nitrophenylphosphate	Euromedex	1026	for lysis buffer
PVDF membrane Immobillon-P	Merck-Millipore	IPVH00010 pore size 0,45 mm	for Western Blot
Rotating wheel	Labinco		for bead incubation
Safe lock eppendorf	Eppendorf	0030120.086	for kinase assay
SDS	Sigma-Aldrich	5030	for Laemmli and migration buffer
Sodium orthovanadate	LC Laboratories	S8507	for lysis and kinase buffer
Sodium pyrophosphate	Fluka	71501	for lysis buffer
Super Signal West Dura	Protein Biology	34075	for Western Blot
Syngene Pxi	Ozyme		for Western Blot
Tissue extracts	Biochain	P1234035 Brain P12345152 Lung P1234149 Liver P1234188 Pancreas P1234260 Testis	for Western Blot analysis
Transfer Unit	Biorad	Mini-Trans-Blot	for Western Blot
Tris	Euromedex	26-128-3094 B	for lysis buffer
Tween-20	Sigma-Aldrich	P7949	for blocking buffer
Typhoon FLA9500	GE Healthcare		to read autoradiography
Typhoon Trio	Amersham Bioscience		to read autoradiography
Whatman paper	GE Healthcare	3030-672	for Western Blot