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  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous avons caractérisé une nouvelle protéine de kinase utilisant des approches biochimiques robustes : analyse de blot occidental avec un anticorps spécifique consacré sur différentes lignées et tissus de cellules, interactions par des expériences de coimmunoprecipitation, activité de kinase détectée par l'ouest Blot à l'aide d'un anticorps spécifique au phospho et par l'étiquetage ATP de32P.

Résumé

Le séquençage complet du génome entier a permis d'identifier de nombreux cadres de lecture ouverts (ORF) fournissant de nombreuses protéines potentielles. Ces protéines peuvent avoir des rôles importants pour la cellule et peuvent démêler de nouveaux processus cellulaires. Parmi les protéines, les kinases sont des acteurs majeurs car elles appartiennent à des voies de signalisation cellulaire et ont la capacité d'allumer ou d'éteindre de nombreux processus cruciaux pour le sort de la cellule, tels que la croissance cellulaire, la division, la différenciation, la motilité et la mort.

Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur une nouvelle protéine kinase potentielle, LIMK2-1. Nous avons démontré son existence par Western Blot à l'aide d'un anticorps spécifique. Nous avons évalué son interaction avec une protéine régulatrice en amont à l'aide d'expériences de coimmunoprécipitation. La coimmunoprécipitation est une technique très puissante capable de détecter l'interaction entre deux protéines cibles. Il peut également être utilisé pour détecter de nouveaux partenaires d'une protéine d'appât. La protéine d'appât peut être purifiée soit par l'intermédiaire d'une étiquette conçue à sa séquence ou par l'intermédiaire d'un anticorps le ciblant spécifiquement. Ces complexes protéiques peuvent ensuite être séparés par SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) et identifiés à l'aide de la spectrométrie de masse. LimK2-1 immunoprécicé a également été utilisé pour tester son activité kinase in vitro par l'étiquetage ATP de32P. Cet exemple bien établi peut utiliser de nombreux substrats différents, et des versions mutées de l'appât peuvent être utilisées pour évaluer le rôle de résidus spécifiques. Les effets des agents pharmacologiques peuvent également être évalués puisque cette technique est à la fois très sensible et quantitative. Néanmoins, la gestion de la radioactivité exige une prudence particulière. L'activité de Kinase peut également être évaluée avec des anticorps spécifiques ciblant le groupe de phospho de l'acide aminé modifié. Ces types d'anticorps ne sont pas disponibles dans le commerce pour tous les résidus modifiés par le phospho.

Introduction

Pendant de nombreuses décennies, de nombreuses voies de signalisation ont été élucidées et leur implication dans des processus cellulaires cruciaux tels que la division cellulaire, la différenciation, la motilité, la mort cellulaire programmée, l'immunité et la neurobiologie, a été démontrée. Les kinases jouent un rôle important dans ces voies de signalisation car elles régulent souvent finement leur activation ou leur inactivation et font partie de complexes polyvalents transitoires qui répondent aux stimuli externes1,2,3. La mutation et la dysrégulation des kinases conduisent souvent à des maladies chez l'homme, et ils sont donc devenus l'une des cibles les plus importantes de drogue au cours des quarante dernières années4.

Dans ce contexte, il est important de pouvoir détecter l'interaction kinase avec leurs régulateurs en amont ou leurs substrats en aval et d'identifier de nouveaux partenaires. La purification d'affinité et l'immunoprécipitation sont des techniques très puissantes pour l'isolement des complexes protéiques5. La protéine d'appât ou la kinase peut être étiquetée avec une séquence spécifique de peptide permettant l'utilisation des perles commerciales covalently couplées avec des anticorps ciblant le peptide. Ce matériau permet une haute reproductibilité dans les expériences6,7,8. Les protéines endogènes peuvent également être immunoprécipitées à l'aide d'anticorps ciblant directement la protéine d'appât. Les anticorps peuvent être reliés entre les protéines A ou protéines G perles d'agarose ou tout simplement incubé avec ces perles avant d'ajouter du lysate. Les tampons de lysis doivent être optimisés pour permettre la solubilité des protéines sans perdre l'interaction et pour éviter la dégradation des protéines. Un inconvénient majeur de cette approche est que l'interaction est détectée sur la lyse cellulaire; par conséquent, les interactions transitoires ou faibles, ainsi que celles qui nécessitent un contexte subcellulaire peuvent être manquées. D'autres techniques peuvent être utilisées pour travailler directement dans la cellule, comme l'analyse de la liaison de proximité (ApL)9, la purification in vivo d'affinités croisées (XAP)10, le transfert d'énergie par résonance de bioluminescence (BRET) ou l'énergie de résonance de La Transfert (FRET)11,12. En outre, l'immunoprécipitation n'est pas appropriée pour déterminer les constantes thermodynamiques de la liaison, pour lesquelles des techniques physiques telles que la résonance plasmon de surface, la calorimétrie de titration isothermale ou la thermophoresis à microéchelle sont nécessaires 13,14.

L'activité kinase peut être évaluée à l'aide de plusieurs techniques. Ici, nous nous sommes concentrés sur les anticorpsspécifiques au phospho et l'étiquetage in vitro de l'ATP (Adenosine TriPhosphate). Les anticorps spécifiques au phospho ciblent la modification du phosphate d'un résidu particulier dans une protéine. Ils peuvent être utilisés dans Western Blot ou ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) après la lyse cellulaire, pour l'immunohistochimie, et aussi sur les cellules intactes en utilisant la cytométrie du flux ou l'immunofluorescence. Leurs inconvénients peuvent inclure leur manque de spécificité, qui peut être évalué à l'aide d'une version mutée de la protéine cible, et leur absence de commerce disponible pour toutes les protéines. L'étiquetageATP in vitro est une méthode très robuste, bien établie et très sensible15. Des protéines immunoprécipitées ou recombinantes peuvent être utilisées, et différents substrats peuvent être testés. Les effets des médicaments peuvent également être évalués car cette méthode est quantitative. Son principal inconvénient est que la radioactivité associée à l'approche nécessite une manipulation avec prudence. D'autres méthodes sont également possibles sur la base de la mesure des substrats peptidiques fluorescents ou luminescents et en tirant parti des propriétés fluorescentes/luminescentes altérées lors de la phosphorylation. Ces méthodes permettent également un débit élevé, ce qui est nécessaire, par exemple, dans le dépistage de molécules qui peuvent être des inhibiteurs potentiels de la kinase cible. En effet, les kinases représentent l'une des plus grandes catégories de cibles pharmaceutiques poursuivies par les sociétés pharmaceutiques16.

Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur la protéine LIMK2-1 (LIMK2-1 signifie Lin11, Isle1, Mec3 Kinase isoforme 2-1). La protéine LIMK2 kinase a été décrite pour la première fois en 199517. Trois isoformes de LIMK2 sont produits par épissage alternatif : LIMK2a, LIMK2b et LIMK2-1. À l'heure actuelle, LIMK2-1 n'a été décrit qu'au niveau de l'ARNm dans une seule étude18. Ici, nous caractérisons cette nouvelle protéine kinase potentielle au niveau moléculaire en utilisant des approches biochimiques robustes. Tout d'abord, nous démontrons que LIMK2-1 est en effet synthétisé. Semblable à ses deux homologues, LIMK2a et LIMK2b, il interagit avec la kinase ROCK en amont (protéine kinase associée à Rho). Nous montrons LIMK2-1 a une activité kinase sur myéline protéine de base (MBP), mais pas sur la cofiline, le substrat canonique de kinases LIM.

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Protocole

1. Préparation cellulaire pour la transfection

CAUTION: Toutes les étapes de la culture cellulaire doivent être effectuées dans un laboratoire dédié, et les cellules sont manipulées dans un cabinet microbiologique de classe 2.

  1. Seed HEK-293 (Human Embryonic Kidney) cells in '10 cm plates in 10 ml of DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium) complété par 10% de sérum fœtal de veau. Culture pendant 3 à 5 jours sous 5% CO2, à 37 oC, jusqu'à ce que les cellules atteignent la confluence de 90%.
  2. Traiter les plaques de 10 cm avec du collagène R pour augmenter l'adhérence cellulaire aux plaques de plastique.
    1. Ajouter 5 ml d'une solution de Collagène R, diluée 200 fois dans le tampon salin de phosphate (PBS) dans une plaque de 10 cm. Recalibrer le liquide sur toute la surface de la plaque.
    2. Incuber à température ambiante pendant au moins 1 h dans l'armoire de biosécurité.
    3. Retirez la solution de collagène et jetez-la. Ajouter 5 ml de PBS, étaler sur toute la surface de la plaque, l'enlever et le jeter. Répétez ce lavage une fois.
    4. Ajouter 8 ml de DMEM complété par 10% de sérum fœtal de veau. Conservez les plaques préparées dans l'armoire de biosécurité.
  3. Prenez les plaques HEK-293 de l'étape 1.1 dans l'armoire de biosécurité. Retirer le milieu des assiettes et le jeter dans une poubelle dédiée à l'eau de Javel. Ajouter 2 ml de DMEM complété, et rincer les cellules pour les détacher en utilisant le flux d'une micropipette de 1 ml, en prenant soin d'éviter de faire de la mousse.
  4. Recueillir les cellules dans un tube de 15 ml et ajouter 4 ml de DMEM complété. Homogériser avec une pipette de 10 ml, en pipetting de haut en bas 3 fois.
  5. Prenez 2 mL de cette solution cellulaire et ajoutez-les à des plaques traitées au collagène contenant d'autres DMEM complétés à partir de l'étape 1.2.4.
  6. Cultivez pendant 24 heures dans l'incubateur à 5% CO2 et 37 oC. Les cellules doivent être des confluents de 50 à 80 % au moment de la transfection.

2. Transitoires transitoires

  1. Retirer le milieu des assiettes, le jeter dans une poubelle d'eau de Javel dédiée, et ajouter 10 ml de DMEM frais complétés. Remettre les plaques dans l'incubateur à 37 oC tout en préparant le mélange de transfection.
  2. Dans un tube de 15 ml, ajouter 450 oL d'une solution de 10 mM Tris-HCl pH 7,5/1 mM EDTA (Tris signifie Tris (hydroxymethyl)aminométhane, et EDTA pour l'acide éthylènedinitrilotetracetic) et 50 oL d'une solution de 2,5 M CaCl2. Mélanger par inversion.
  3. Ajouter 10 g d'ADN plasmidic (acide désoxyribonucléique) préparé à partir d'une préparation midi sur une culture liquide de bactéries transformées avec le plasmide dédié. Mélanger par inversion.
  4. Sous une agitation lisse sur un vortex, ajouter 500 l de concentré salin salin BES 2x (composition: BES, 10.7 g/L, NaCl, 16.0 g/L, Na2HPO4, 0.27 g/L; BES signifie N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine) goutte lentement par goutte.
  5. Incuber au moins 15 min (jusqu'à 45 min) à température ambiante dans l'armoire de biosécurité. Ne pas vortex, ne pas mélanger! Déplacez les tubes très soigneusement pour ne pas perturber la formation complexe entre l'ADN et le phosphate de calcium.
  6. Prenez les plaques de l'étape 2.1 à l'armoire de sécurité. Ajouter les complexes d'ADN très soigneusement, goutte à goutte, sur les cellules sur toute la surface de la plaque.
  7. Incuber de 24 à 72 heures dans l'incubateur à 37 oC. Habituellement, l'expression maximale des protéines est atteinte dans les 48 heures.

3. Lysis

REMARQUE : Travaillez sur la glace et avec des tampons froids pour prévenir la dégradation des protéines.

  1. Préparer le tampon de lyse : 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 50 mM NaF, 10 mM de pyrophosphate de sodium, 1 mM Na3VO4, 20 mM p-nitrophenyl phosphate, 20 mM-glycérophosphate, 10 g/mL aprotinin, 0,05 g/mLd , 1 leupeptin de 1 g/mL et 1 mM de PMSF (fluorure de phénylmethylsullsulfonyl). Environ 4 ml de tampon de lyse sont nécessaires pour chaque plaque transfectée.
  2. Retirer les plaques avec les cellules transfectées de l'incubateur. Mettez-les sur la glace.
    REMARQUE : À partir de cette étape, il est possible de travailler sur un banc « normal ».
  3. Retirez le support et jetez-le dans une poubelle dédiée à l'eau de Javel.
  4. Laver deux fois avec 3 ml de PBS froid : ajouter 3 ml de PBS sur le côté de la plaque goutte à goutte pour éviter de détacher les cellules transfectées, répartir sur toute la surface de la plaque, enlever le PBS et le jeter; répéter cette étape une fois de plus. À la fin, retirer soigneusement le reste de PBS en inclinant la plaque pour éviter la dilution tampon de lyse pour l'étape suivante.
  5. Ajouter 500 l de tampon de lyse froide sur les cellules lavées transfectées. Étendre sur toute la surface de la plaque.
  6. Incuber 10 min sur glace. De temps en temps (au moins deux fois), répartir à nouveau le tampon sur toute la surface de la plaque.
  7. Mettre les cellules au rebut et les recueillir dans un tube de microcentrifuge.
  8. Centrifugeuse de 10 min à 10 000 x g à 4 oC.
  9. Recueillir supernatant dans un nouveau tube de microcentrifuge. Cette fraction correspond au lysate (extrait de cellule entière). Jeter la pastille qui correspond aux débris de membrane cellulaire.
  10. Recueillir un aliquot de cette fraction dans un nouveau tube de microcentrifuge (environ 50 l). Cette fraction correspond à la « fraction TOTAL » ou à la « lysate cellulaire » ou à l'« extrait de cellules entières » permettant d'analyser si les protéines transfectées sont exprimées par Western Blot.
    REMARQUE : À ce stade, les échantillons peuvent être directement utilisés pour les analyses western Blot. Le tampon Laemmli doit être ajouté à l'échantillon, qui est ensuite chauffé à 95 oC pendant 5 min, centrifugé à 10 000 x g pendant 5 min, et chargé sur le SDS-PAGE approprié. Les échantillons peuvent également être stockés à -80 oC.

4. Immunoprécipitation

  1. Resuspendre doucement les perles d'agarose couplées à l'anticorps approprié : HA (hémagglutinine de la grippe humaine), drapeau, ou GFP (protéine fluorescente verte) par inversion lisse.
  2. Couper l'extrémité d'une pointe de 200 l à partir d'une micropipette pour permettre aux perles d'entrer dans la pointe. Pipette les perles de haut en bas plusieurs fois pour saturer la pointe pour s'assurer de prendre le volume correct de perles.
  3. Prendre 40 ll de perles dans un tube de microcentrifuge.
  4. Ajouter 500 oL de tampon TENET (30 mM Tris-HCl pH 7,5, 120 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 % Triton X-100). Mélanger par inversion. Centrifugeuse de 2 min à 1 000 x g à 4 oC. Retirer soigneusement le supernatant et le jeter. Ajouter 500 l de TENET. Incuber pendant au moins 1 heure à 4 oC sur une roue tournante.
    REMARQUE : Cette étape de pré-incubation dans TENET permet de réduire les interactions non spécifiques et ainsi de diminuer le signal de fond.
  5. Laver les perles deux fois avec 500 l l de tampon de lyse.
    1. Centrifugeuse 2 min à 1 000 x g à 4 oC.
    2. Retirez soigneusement le tampon supernatant et jetez-le.
      REMARQUE : Veillez à ne pas aspirer les perles pendant ces étapes de lavage.
    3. Ajouter 500 l de tampon de lyse. Homogénéiser en inversant le tube.
    4. Répéter les étapes 4.5.1- 4.5.3.
  6. Centrifugeuse de 2 min à 1 000 x g à 4 oC. Retirez soigneusement le tampon supernatant et jetez-le.
  7. Incuber les perles avec le lysate de l'étape 3.9 pendant 2 à 4 heures à 4 oC sur une roue tournante.
  8. Laver les perles immunoprécipitées.
    REMARQUE : À ce stade, les perles immunoprécipitées peuvent être lavées cinq fois avec le tampon de lyse, puis élucées avec le tampon de Laemmli. L'éluate peut être utilisé pour les analyses western Blot ou stocké à -80 oC. Alternativement, les perles peuvent être lavées deux fois avec le tampon de lyse, puis trois fois avec le tampon de kinase pour effectuer l'étiquetage ATP de32P.

5. Analyses de coimmunoprécipitation

  1. Laver les perles immunoprécipitées de l'étape 4.7 avec le tampon de lyse.
    1. Centrifugeuse de 2 min à 1 000 x g dans une centrifugeuse réfrigérée à 4 oC.
    2. Retirez soigneusement le supernatant et jetez-le.
    3. Ajouter 500 l de tampon de lyse. Homogénéiser en inversant le tube.
    4. Répétez les étapes 5.1.1-5.1.3 quatre fois.
  2. Élution
    1. Centrifugeuse de 2 min à 1 000 x g dans une centrifugeuse réfrigérée à 4 oC.
    2. Retirez soigneusement le supernatant et jetez-le. Retirez les dernières gouttes de supernatant avec une seringue Hamilton afin d'éviter l'aspiration des perles, et jetez le supernatant.
    3. Ajouter 40 l de tampon Laemmli 4x (200 mM Tris/HCl pH 6,8, 4 % SDS, 40 % de glycérol, 0,5 M de mercaptoéthanol, 0,02 % de bleu bromophénol). Homogénéiser en tapant doucement sur le tube.
    4. Incuber 5 min à température ambiante.
    5. Centrifugeuse de 5 min à 10 000 x g à température ambiante.
    6. À l'utilisation d'une seringue Hamilton, retirez le supernatant et collectez-le dans un nouveau tube de microcentrifuge. Cette fraction correspond à l'"Eluate", qui peut être stocké à -80 oC, ou directement analysé par Western Blot.

6. Kinase d'assay

  1. Préparer le tampon de kinase: 50 mM HEPES-NaOH pH 7.5 (HEPES est pour 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acide), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM MnCl2, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 20 mM -glycérophosphate, 1 g/mL la leupeptine, et 1 mM PMSF. Environ 2 ml de tampon de kinase sont nécessaires pour chaque condition d'immunoprécipitation.
  2. Laver les perles immunoprécipitées de l'étape 4.7 deux fois avec 500 l de tampon de lyse.
    1. Centrifugeuse de 2 min à 1 000 x g dans une centrifugeuse réfrigérée à 4 oC.
    2. Retirez soigneusement le supernatant et jetez-le. Ajouter 500 l de tampon de lyse. Homogénéiser par inversion.
    3. Répétez les étapes 6.2.1 et 6.2.2.
  3. Laver les perles immunoprécipitées trois fois avec 500 ll de tampon de kinase.
    1. Centrifugeuse de 2 min à 1 000 x g dans une centrifugeuse réfrigérée à 4 oC.
    2. Retirez soigneusement le supernatant et jetez-le. Ajouter 500 l de tampon kinase. Homogénéiser par inversion.
    3. Répétez les étapes 6.3.1 et 6.3.2 deux fois.
  4. Centrifugeuse de 2 min à 1 000 x g dans une centrifugeuse réfrigérée à 4 oC.
  5. Retirez soigneusement le supernatant et jetez-le. Retirez les dernières gouttes de supernatant avec une seringue Hamilton afin d'éviter l'aspiration des perles, et jetez le supernatant.
  6. Ajouter 40 ll de tampon de kinase aux perles immunoprécipitées. Resuspendre les perles en tapant doucement sur le tube.
  7. Préparer le mélange pour l'étiquetage ATP de32P (volume final est de 22,5 l, avec tampon kinase) dans un tube de verrouillage sûr.
    1. Ajouter le volume requis de tampon kinase pour atteindre un volume final de 22,5 L.
    2. Couper l'extrémité d'une pointe de 20 l d'une micropipette. Resuspendre les perles immunoprécipitées de l'étape 6.6 en faisant monter et descendre plusieurs fois. Recueillir 10 L de ces perles dans le tube de verrouillage de coffre-fort.
    3. Ajouter l'ATP d'une solution de stock de 10 M pour atteindre 50 mm de concentration finale. Selon le nombre d'échantillons traités, une dilution de la solution de stock de l'ATP dans le tampon kinase est suggérée pour permettre à la pipette 1 à 2 L, pour s'assurer que le volume est correct.
    4. Ajouter 2,5 g de substrat (cofilin ou myéline, MBP dans le cas d'étude actuel).
  8. Ajouter 5 'Ci de'[32P] ATP (3 000 Ci/mmol) pour initier la réaction. Mélanger en faisant monter et descendre lentement.
    ATTENTION: À partir de ce point, le travail doit être fait dans un lieu de sécurité dédié aux manipulations de radioactivité avec précaution prudente, des protections dédiées et des contrôles appropriés (boucliers radioactifs, compteur Geiger, collecte spécifique des déchets, sein personnel et badges pour détecter l'exposition radioactive, conseils de filtre).
  9. Incuber pendant 20 min à 30 oC.
  10. Arrêtez la réaction avec 6 l de tampon Laemmli 5x.
  11. Chauffer à 95o C pendant 5 min.
  12. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 5 min à température ambiante.
  13. Chargez sur un SDS-PAGE. Procédez à la migration.
    REMARQUE : Veillez à ce que la ligne de front de l'ATP libre de32P ne sorte pas du gel pour éviter la contamination du réservoir de migration.
  14. Tachez le gel à température ambiante.
    1. Retirer le gel des plaques de verre.
    2. Procéder avec trois bains dans l'eau à température ambiante.
    3. Tainer le gel toute la nuit avec Coomassie Blue à température ambiante.
    4. Destain le gel avec plusieurs bains de lavage avec de l'eau à température ambiante.
  15. Envelopper le gel d'une pellicule plastique.
  16. Exposer pendant une nuit ou plus sur un écran phosphorimager.
  17. Lisez l'écran sur un phosphorimager pour détecter les bandes étiquetées.

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Résultats

La protéine LIMK2-1 est synthétisée
LIMK2-1 est mentionné dans les banques de données, mais jusqu'à présent un seul document a montré l'existence de son ARNm18. Par rapport à ses deux homologs, LIMK2a et LIMK2b, LIMK2-1 a un domaine C-terminal supplémentaire identifié comme un domaine inhibiteur de la phosphatase de protéine 1 (PP1i). Nous avons conçu un anticorps qui cible un peptide de ce domaine, les acides aminés 671-684 (

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Discussion

Ici, nous avons utilisé des outils biochimiques robustes pour caractériser au niveau moléculaire une nouvelle protéine, LIMK2-1, considérée comme une kinase basée sur sa séquence et sur ses homologs, LIMK2a et LIMK2b20.

Tout d'abord, nous avons démontré l'existence de LIMK2-1 au niveau des protéines en utilisant l'analyse Western Blot avec un anticorps spécifique. Par la suite, nous avons évalué son interaction avec la kinase ROCK1 en amont, qui est connue...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par La Ligue contre le Cancer, l'Association Neurofibromatoses et Recklinghausen, et la Région Centre Val de Loire. Un grand merci à Aurélie Cosson et Déborah Casas pour les données de cytométrie des flux, et à Keyron Hickman-Lewis pour la relecture approfondie du manuscrit.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibody anti-actinSigma-AldrichA1978for Western Blot
Antibody anti-c-MycInvitrogenMA1-21316for Western Blot
Antibody anti-cofilinCell signaling Technology3312/5175for Western Blot
Antibody anti-GFPSanta Cruzsc-9996for Western Blot
Antibody anti-HARoche Applied Science11687423001for Western Blot
Antibody anti-phospho-cofilinCell signaling Technology3313for Western Blot
Antibody Anti-PP1iEurogentecdesigned for this studyfor Western Blot
AprotininEuromedexA-162Bfor lysis buffer
ATPInvitrogenPV3227for γ[32P] labeling
γ[32P] ATPPerkin ElmerNEG502Afor γ[32P] labeling
BES buffered salineSigma-Aldrich14280for transfection
β-glycerophosphateSigma-AldrichG9422for lysis and kinase buffer
β-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148for Laemmli
BSASigma-AldrichA3059for blocking buffer
Bromophenol BlueSigma-AldrichB0126for Laemmli
CaCl2Sigma-AldrichC3881for transfection
CentrifugeSigma111-541
Collagen RPan BiotechP06-20166for transfection
Control siRNAAmbionAM4611for PP1i antibody specificity
Coomassie PageBlue Protein Staining SolutionThermo-Fisher24620for gel staining
EDTASigma-Aldrich3690for lysis buffer
Electrophoresis UnitBioradMini-Proteanfor Western Blot
EZview Red anti-HA affinity gelSigma-AldrichE6779for immunoprecipitation
GeneSys softwareOzymefor Western Blot acquisition
GeneTolls softwareOzymefor Western Blot quantification
GFP-trap beadsChromtekfor immunoprecipitation
GlycineEuromedex26-128-6405for transfer buffer
GST-cofilinUpstate Cell signaling12-556for γ[32P] labeling
Hamilton syringe 100 mLHamilton710to remove carefully supernatant from beads without aspirating them
HEPESSigma-AldrichH3375for kinase buffer
ImageQuant TL softwareGE Healthcarefor radioactivity acquisition and quantification
LIMK2 siRNAAmbions8191for PP1i antibody specificity
LeupeptinSigma-AldrichSP-04-2217for lysis and kinase buffer
MBPUpstate Cell signaling13-173for γ[32P] labeling
MgCl2Sigma-AldrichM8266for kinase buffer
MnCl2Sigma-Aldrich244589for kinase buffer
NaClEuromedex1112for lysis and kinase buffer
NaFSigma-AldrichS-1504for lysis and kinase buffer
Okaidic acidEuromedex0-2220for lysis buffer
PMSFSigma-Aldrich78830for lysis and kinase buffer
p-nitrophenylphosphateEuromedex1026for lysis buffer
PVDF membrane Immobillon-PMerck-MilliporeIPVH00010 pore size 0,45 mmfor Western Blot
Rotating wheelLabincofor bead incubation
Safe lock eppendorfEppendorf0030120.086for kinase assay
SDSSigma-Aldrich5030for Laemmli and migration buffer
Sodium orthovanadateLC LaboratoriesS8507for lysis and kinase buffer
Sodium pyrophosphateFluka71501for lysis buffer
Super Signal West DuraProtein Biology34075for Western Blot
Syngene PxiOzymefor Western Blot
Tissue extracts

 		Biochain

 		P1234035 Brain
P12345152 Lung
P1234149 Liver
P1234188 Pancreas
P1234260 Testis		for Western Blot analysis

 
Transfer UnitBioradMini-Trans-Blotfor Western Blot
TrisEuromedex26-128-3094 Bfor lysis buffer
Tween-20Sigma-AldrichP7949for blocking buffer
Typhoon FLA9500GE Healthcareto read autoradiography
Typhoon TrioAmersham Bioscienceto read autoradiography
Whatman paperGE Healthcare3030-672for Western Blot

Références

  1. Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).
  2. Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. 298, Science. New York, N.Y. 1912-1934 (2002).
  3. Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling. Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).
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  5. Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, Clifton, N.J. 349-364 (2008).
  6. Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).
  7. Wood, D. W. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).
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