JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نقدم بروتوكول توصيف الفينومينتيك والسيتوكين الناجم عن التمايز من دم الحبل السري المستمدة CD34+ الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف إلى السلالات النقويالأربعة. وتشمل تطبيقات هذا البروتوكول التحقيقات على تأثير طفرات مرض النخاع أو جزيئات صغيرة على تمايز النخاع من CD34+ الخلايا.

Abstract

التمايز السابق للخلايا الجذعية المكونة للدم هو نموذج يستخدم على نطاق واسع لدراسة الهيماتوبويز. البروتوكول الموصوف هنا هو للتفرقة الناجمة عن السيتوكين من CD34+ الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف إلى الخلايا السلالية النخاعية الأربعة. يتم عزل CD34+ الخلايا من دم الحبل السري البشري ومشتركة مع الخلايا سترومال MS-5 في وجود السيتوكينات. يتم وصف التوصيف المناعي للخلايا الجذعية والسلف، وخلايا النسب النخاعية المتمايزة. باستخدام هذا البروتوكول، CD34+ الخلايا قد تكون حاضنة مع جزيئات صغيرة أو تنتقل مع الفيروسات اللينة للتعبير عن طفرات مرض النخاع للتحقيق في تأثيرها على تمايز النخاع.

Introduction

التمايز الطبيعي للخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) أمر بالغ الأهمية للحفاظ على المستويات الفسيولوجية لجميع سلالات خلايا الدم. خلال التمايز، في استجابة منسقة للإشارات خارج الخلية بما في ذلك عوامل النمو والسيتوكينات، HSCs تؤدي أولا إلى خلاياذرية متعددة القوى (MPP) التي لديها إمكانية اللمفاوية النخاعية 1،2،3 ،4 (الشكل1). وتنشأ عن هذه التسميات سلالات النخاعية الشائعة (CMPs) والذرية اللمفاوية الشائعة (CLPs) المقيدة النسب. تُميّز CLPs في السلالات اللمفاوية المكونة من B وT والخلايا القاتلة الطبيعية. وتولد الـ CMPs سلالات النخاع من خلال اثنين من السكان السلف الأكثر تقييداً، وذرية الكريات الحمر ية الضخمة (MEPs)، وذرية الخلايا الأحادية الحبيبية (GMPs). وتنشأ عن هذه الـ MEPs خلايا عملاقة وكريات الدم الحمراء، في حين أن هذه الخلايا تؤدي إلى ظهور المحببات والخلايا الأحادية. بالإضافة إلى أن تنشأ من خلال CMPs، وقد أفيد أن الخلايا الضخمة تنشأ أيضا مباشرة من HSCs أو MPPs في وقت مبكر عن طريق مسارات غير الكنسية5،6.

تتميز الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف (HSPCs) بعلامة السطح CD34 وعدم وجود علامات محددة النسب (لين-). وتشمل العلامات السطحية الأخرى التي تستخدم عادة للتمييز بين HSCs وتجمعات ذرية النخاع CD38 وCD45RA وCD1232 (الشكل1). HSCs وMPPs هي لين-/ CD34+/ CD38- ولين-/CD34+/CD38+، على التوالي. تتميز مجموعات الذرية الملتزمة النخاعية بوجود أو غياب CD45RA وCD123. CMPs هي لين-/ CD34+/ CD38+/ CD45RA-/CD123لو،GMPs هي لين-/CD34+/CD38+/CD45RA+/CD123لو، وأعضاء البرلمان من البمعة لين-/CD34 ++ /CD38+/CD45RA-/CD123-.

يمكن الحصول على إجمالي عدد السكان من CD34+ الخلايا الجذعية والسلف من دم الحبل السري البشري (UCB)، نخاع العظام، والدم المحيطي. CD34+ الخلايا تشكل 0.02٪ إلى 1.46٪ من مجموع الخلايا أحادية النووية (MNCs) في UCB الإنسان، في حين أن نسبتهم تتراوح بين 0.5٪ و 5.3٪ في نخاع العظام وأقل بكثير في ~ 0.01٪ في الدم المحيطي7،8،9 . القدرة التكاثرية وإمكانات التمايز من UCB المستمدة CD34+ الخلايا هي أعلى بكثير من نخاع العظام أو خلايا الدم الطرفية1،10، مما يوفر ميزة متميزة للحصول على مادة كافية للتحليلات الجزيئية في تركيبة مع أداء توصيف المناعية والمورفولوجية للخلايا أثناء التمايز.

التمايز السابق للدم السري المستمد من دم الحبل السري CD34+ HSPCs هو نموذج تطبيقي على نطاق واسع للتحقيق في حالات الدم الطبيعية وآليات أمراض الدم. عندما يتم استزراعها مع السيتوكينات المناسبة، يمكن حث UCB CD34+ HSPCs على التمييز على طول السلالات النخاعية أو اللمفاوية11،12،13،14،15 , 16.هنا، ونحن نصف بروتوكولات للعزل وتوصيف المناعية من CD34+ HSPCs من UCB الإنسان، وللتمايز إلى خلايا النسب النخاعي. ويستند هذا النظام الثقافي على التمايز الناجم عن السيتوكين من HSPCs في وجود الخلايا سترومال MS-5 لتقليد البيئة الدقيقة في نخاع العظام. تتسبب ظروف الثقافة في توسع أولي في الخلايا CD34+ ، يليها تمايزها إلى الخلايا التي تعبر عن علامات لخلايا النسب النخاعية الأربعة ، وهي الخلايا الحبيبية (CD66b) ، والخلايا الأحادية (CD14) ، والخلايا الضخمة (CD41) ، و كريات الدم الحمراء (CD235a). وتشمل تطبيقات بروتوكول تمايز الخلايا CD34+ دراسات عن الآليات الجزيئية التي تنظم داء الهيماتوبوي، والتحقيقات في تأثير الطفرات المرتبطة بمرض النخاع والجزيئات الصغيرة على التجديد الذاتي و تمايز HSPCs.

Protocol

تم التبرع بدم الحبل السري البشري للتجريب من قبل الأفراد الأصحاء بعد الموافقة المستنيرة على ماريكوبا النظم الصحية المتكاملة (MIHS)، فينيكس. وتم الحصول على الوحدات التي تم تحديدها من خلال اتفاق لنقل المواد بين وزارة التعليم والشؤون الإنسانية وجامعة أريزونا.

1. الكواشف والمخازن المؤقتة

ملاحظة: إعداد جميع الكواشف والمخازن المؤقتة في ظل ظروف معقمة في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.

  1. إعداد معقمة PBS-BSA-EDTA (PBE) العازلة عن طريق إضافة 7.2 مل من الزلال المصل البقري المعقم 35٪ (BSA؛ استخدام الأنسجة المعقمة الصف 35٪ BSA) و 5 مل من حمض الخليك رباعي الإيثيلين 0.5 م الإيثيلين (EDTA) إلى 487.8 مل من الفوسفات المعقم دولبيكو المخزنة المالحة (DPBS). تصفية تعقيم وإزالة الغاز العازلة عن طريق ترك مرشح تعلق على فراغ في خزانة السلامة البيولوجية لمدة لا تقل عن 2 ح. Aliquot العازلة إزالة الغاز في أحجام أصغر (250 مل) وتخزينها في 4 درجة مئوية.
  2. إعداد 1X هانكس محلول الملح المتوازن (1X HBSS). تخفيف 100 مل من مخزون HBSS 10x في 900 مل من الماء المقطر المعقمة لجعل 1 لتر من HBSS 1x وضبط درجة الحموضة إلى 7.2. قم بتصفية تعقيم HBSS 1x قبل الاستخدام.
  3. إعداد 2٪ محلول حمض الخليك عن طريق إضافة 2 مل من حمض الخليك الجليدي إلى 98 مل من الماء المقطر.
  4. إعداد 20 نانوغرام / مل المؤتلف محلول شظايا فيبرونكتين الإنسان في 1X PBS. جعل 10 مل لكل لوحة 48 جيدا.
  5. إعداد 2٪ BSA. إلى 100 مل 1X PBS، إضافة 2 غرام من كسر BSA V. تصفية تعقيم قبل الاستخدام.
  6. جعل كاملة دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (DMEM) عن طريق إضافة مسحوق DMEM، 3.7 غرام بيكربونات الصوديوم، 100 مل مصل البقر الجنيني (FBS) و 5 مل البنسلين-العقديات (PS) إلى 800 مل من الماء المقطر المعقمة. خلط ويشكلون حجم إلى 1 لتر، وتصفية تعقيم قبل الاستخدام.
  7. إعداد وسيط التجميد عن طريق خلط 90 مل من FBS و 10 مل من كبريتيد ثنائي الميثيل المعقم (DMSO).
  8. إعداد وسائل التحفيز. إلى المصل المتوسط الحر، أضف L-الجلوتامين إلى 2 mM، والسيتوكينات إلى تركيز نهائي قدره 50 نانوغرام/مل لعوامل الخلايا الجذعية (SCF)، ومادة الصفيحات (TPO)، وثيروسين كيناز 3 ليجاند (Flt3L)، و20 نانوغرام/مل للإنترلوكين-3 (IL3) (انظر جدول المواد) لإعداد حلول الأسهم السيتوكين). جعل 5 مل لكل لوحة 48 جيدا.
  9. إعداد 1X النخاع التمايز المتوسطة. لإكمال DMEM، إضافة السيتوكينات إلى تركيز نهائي قدره 5 نانوغرام/مل لـ SCF وFlt3L وIL3 و50 نانوغرام/مل لTPO و4 وحدات/مل للاريثروبويتين (EPO). جعل 5 مل لكل لوحة 48 جيدا.
  10. إعداد 2X النخاع التمايز المتوسطة. لإكمال DMEM، إضافة السيتوكينات إلى تركيز نهائي 10 نانوغرام/مل لSCF، Flt3L، وIL3، 100 نانوغرام/مل لTPO، و 8 وحدات/مل لEPO. جعل 5 مل لكل لوحة 48 جيدا.
  11. إعداد المخزن المؤقت قياس التدفق. إلى 1 لتر من 1x PBS، إضافة 10 غرام من كسر BSA V.
  12. إعداد 1٪ بارافورمالدهايد في 1X PBS (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل).
  13. إعداد بولي-L-يسين الحل عن طريق إضافة 500 درجة مئوية من 10 ملغ / مل بولي-L-يسين إلى 49.5 مل من 1X PBS.

2. عزل الخلايا أحادية النوضد من دم الحبل السري

ملاحظة: بالنسبة للبروتوكول الموضح أدناه، تم استخدام كميات دم الحبل السري من 90 إلى 100 مل. يجب أن يتم عزل CD34+ الخلايا في ظل ظروف معقمة في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.

  1. رش الحقيبة التي تحتوي على UCB مع الإيثانول 70٪ لتعقيم السطح الخارجي قبل إدخاله في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. نقل UCB إلى زجاجة بلاستيكية معقمة 250 مل وتخفيفه 1:1 عن طريق إضافة حجم متساو من درجة حرارة الغرفة (RT) 1X HBSS.
  2. الاستغناء عن 15 مل من MNC تجزئة المتوسطة (MFM؛ انظر جدولالمواد) لكل أنبوب في ما يقرب من ستة أنابيب مخروطية معقمة 50 مل. إمالة الأنبوب مع MFM، وصب بلطف 30 مل من UCB المخفف على طبقة MFM دون إزعاج ذلك.
  3. طرد مركزي الأنابيب في 400 × ز لمدة 30 دقيقة في RT مع تسارع بطيء وليس الفرامل.
  4. بعد الطرد المركزي، يستنشق بين 15-20 مل من البلازما فوق طبقة MNC. جمع بلطف MNCs مع ماصة ونقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل جديدة.
    ملاحظة: وتودع الشركات المتعددة الجنسيات كطبقة بيضاء باهي في واجهة البلازما وMFM، ورواسب خلايا الدم الحمراء (RBCs) في الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي.
  5. تجمع MNCs التي تم جمعها من 2-3 أنابيب معا. تشكل حجم كل أنبوب إلى 50 مل مع العازلة PBE الباردة.
  6. طرد مركزي الأنابيب في 300 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية، مع الفرامل على انخفاض.
  7. يستنشق supernatant والاستفادة من الأنبوب بلطف لتخفيف بيليه الخلية.
  8. إعادة تعليق الخلايا الكريات في 5 مل من الجليد الباردPBE العازلة. استخدم نفس 5 مل من الخلايا المعاد تعليقها لجمع الخلايا من أنابيب أخرى. الجمع بين الخلايا من 3 إلى 4 أنابيب معا في أنبوب مخروطي 50 مل واحد.
  9. لجمع أي خلايا المتبقية، وغسل جميع الأنابيب مع 5 مل من العازلة PBE الباردة وإضافة إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
  10. عد MNCs عن طريق تخفيف 10 ميكرولتر من تعليق الخلية في محلول حمض الخليك 490 درجة مئوية.
    ملاحظة: حمض الخليك lyses أي RBCs الملوثة للسماح بسهولة العد من MNCs.
  11. تشكل حجم تعليق الخلية إلى 50 مل مع الجليد الباردة PBE العازلة. طارد الخلايا في 300 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية، مع الفرامل على انخفاض.
    ملاحظة: يمكن معالجة تعليق MNC على الفور لعزل CD34+ الخلايا أو تجميدها للتطبيقات اللاحقة.
  12. لتجميد MNCs، قم بإزالة supernatant وإعادة تعليق بكثافة 2 × 107 خلايا /مل في وسط التجميد في RT.
  13. تجميد الخلايا في -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها في حاوية تجميد الخلية ومن ثم نقلها إلى النيتروجين السائل.

3. عزل CD34+ الخلايا من الخلايا أحادية النووية

  1. وإذا كان استخدام الشركات المتعددة الجنسيات المعزولة حديثاً ينتقل مباشرة إلى الخطوة 3-3.
  2. إذا كنت تستخدم MNCs المجمدة، تذوب بسرعة الخلايا المجمدة في حمام مائي 37 درجة مئوية ونقلها إلى أنبوب مخروطي 50 مل. جمع أي خلايا المتبقية في قارورة مع 1 مل من الجليد الباردة PBE العازلة ونقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
  3. تشكل حجم تعليق MNC إلى 50 مل مع العازلة PBE الباردة والطرد المركزي في 600 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
  4. إزالة supernatant والاستفادة من الأنبوب بلطف لتخفيف بيليه الخلية. إعادة تعليق MNCs إلى 1 × 108 خلايا في 300 درجة مئوية من المخزن المؤقت PBE الباردة الجليد.
  5. إضافة 100 ميكرولتر من FcR حجب الكاشف من الخلايا المغنطة تنشيط فرز الخلايا (MACS) مجموعة الميكروبيد البشرية CD34 لكل 1 × 108 MNCs وتخلط بلطف.
    ملاحظة: يمنع هذا الربط غير محدد إلى microbeads CD34.
  6. أضف 100 ميكرولتر من الخرز الصغير CD34 لكل 1 × 108 خلايا. يُمزج المزيج برفق ويحتضن في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدّة 30 دقيقة في الثلاجة. لا تحضن على الجليد.
  7. في حين أن الخلايا هي الحضانة، وضع عمود LS ومرشح ما قبل الانفصال في المجال المغناطيسي فاصل MACS. معادلة العمود مع المخزن المؤقت PBE الجليد الباردة عن طريق إضافة 2 مل مباشرة في العمود و 1 مل في مرشح ما قبل الفصل. السماح للعمود لإفراغ في أنبوب مخروطي 15 مل وتجاهل التدفق من خلال.
  8. إزالة MNCs من 4 درجة مئوية، إضافة الجليد الباردة PBE العازلة لتعويض حجم إلى 15 مل، والطرد المركزي الخلايا في 300 × ز لمدة 10 دقيقة عند 4 درجة مئوية، مع الفرامل على انخفاض.
  9. قم بإستقان الـ supernatant وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من المخزن المؤقت PBE البارد.
  10. إضافة تعليق الخلية إلى عامل تصفية ما قبل الفصل وضعت على العمود LS.
    ملاحظة: يقوم عامل تصفية ما قبل الفصل بإزالة أية تجميعات خلايا كبيرة قد تمنع العمود.
  11. شطف الأنبوب مع 3 مل من الجليد الباردة PBE العازلة وإضافته إلى مرشح ما قبل الفصل وضعت على العمود LS. بعد ذلك، تجاهل عامل تصفية ما قبل الفصل.
  12. اغسل عمود LS أربع مرات بإضافة 3 مل من المخزن المؤقت PBE البارد على الجليد، مما يسمح للعمود باستنزاف كل مرة.
    ملاحظة: ستبقى الخلايا CD34+ منضمة إلى العمود وستتدفق الخلايا غير المسماة من خلال العمود.
  13. بعد الغسيل النهائي، قم بإزالة العمود من المجال المغناطيسي فاصل MACS وضعه في أنبوب مخروطي جديد 15 مل، بعيدا عن المغناطيس.
  14. إضافة 5 مل الجليد الباردة PBE العازلة إلى العمود وطرد CD34+ الخلايا ملزمة عن طريق دفع بحزم في الغطاس.
  15. بشكل اختياري، قم بتمرير CD34+ الخلايا المعزولة من العمود الأول عبر عمود LS آخر مع عامل تصفية ما قبل الفصل كما هو موضح أعلاه (الخطوات 3.10−3.13).
  16. عد CD34+ الخلايا المعزولة مع الأزرق تريبان (10 ميكرولتر من الخلايا و 10 ميكرولتر من الأزرق trypan) لتحديد العدد الإجمالي للخلايا الحية.
    ملاحظة: وفي هذه المرحلة، يمكن تجميد خلايا CD34+ المعزولة لاستخدامها في وقت لاحق أو يمكن معالجتها مباشرة لتحليل هذه الخلايا عن طريق قياس التدفق (القسم 4) أو للتمايز مع خلايا النسب النخاعي (القسم 5).
  17. طرد مركزي تعليق الخلية في 600 × ز لمدة 5 دقائق في RT، مع الفرامل على انخفاض.
  18. لتجميد CD34+ الخلايا، يستنشق supernatant وإعادة تعليق ما يصل إلى 5 × 106 خلايا في 1 مل من تجميد المتوسطة وتجميد كما هو موضح أعلاه (الخطوة 2.13). وإلا، انتقل إلى الباب 4 أو 5.

4. تحديد السكان الجذعية والسلف عن طريق قياس التدفق

  1. لتحديد كسور مجموعات الجذعية والذرية في CD34+ HSPCs المعزولة حديثاً، قم بالطرد المركزي لها عند 600 × ز لمدة 5 دقائق وإعادة تعليق 1 × 106 خلايا في 50 ميكرولتر من مخزن قياس الخلايا المتدفق.
  2. إلى 1 x 106 CD34+ الخلايا، إضافة الأجسام المضادة (انظر جدول المواد للتخفيف) إلى علامات النسب (CD3، CD7، CD10، CD11b، CD19 و CD235a - جميع FITC المسمى)، CD34 (APC-Cy7)، CD38 (PE)، CD45RA (PE-Cy7)، CD123 (APC) و 7- أمينواأكتينومايسين D (7-AAD؛ كبقعة حية / ميتة) ويشكلون الحجم الإجمالي إلى 100 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن استخدام أقل من 1 × 106 CD34+ الخلايا للتحليل. إذا تلطيخ خلايا أقل، يجب تقليل الحجم الإجمالي وحجم الأجسام المضادة المضافة وفقا لذلك. وفيما يتعلق بتحليل قياس التدفق، ينبغي استخدام الشركات المتعددة الجنسيات غير الملطخة والملونة الواحدة كضوابط لوضع بوابات إيجابية وسلبية لكل فلوروفور.
  3. بعد الحضانة، اغسل الخلايا بسعة 1 مل من مخزن قياس السيتوميومتر والطرد المركزي بمعدل 600 × ز لمدة 5 دقائق.
  4. اختياريا، إصلاح الخلايا الملونة في 0.5 مل من 1٪ محلول بارافورمالدهايد لمدة 10 دقيقة في الظلام في RT.
  5. الطرد المركزي في 600 × ز لمدة 5 دقائق واستنشاق supernatant.
  6. اغسل الخلايا الثابتة/الملطخة بسعة 1 مل من مخزن قياس الخلايا والطرد المركزي عند 600 × ز لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.
  7. قم بإستقان supernatant، وإعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من تدفق التخزين المؤقتللخلايا، وتحليلها بواسطة مقياس التدفق (جدول المواد).

5. التمايز النخاعي من CD34+ الجذعية المكونة للدم وخلايا السلف

ملاحظة: للتمييز بين CD34+ HSPCs إلى خلايا النسب النخاعي، يتم تحفيزها أولاً في لوحات فيبرونيكتين البشرية المؤتلفة المطلية بجزء من الفيبرونكتين ثم تبذر على طبقة من الخلايا سترومال MS-5 في وسط التمايز النخاعي. ويمكن رصد التمايز كل أسبوع لمدة 3 أسابيع على أساس التعبير عن علامات سطح الخلية الخاصة بالسلالات النخاعية الأربعة. أثناء التحفيز والتمايز، يتم تنفيذ جميع الحضانة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في غرفة رطبة. وينبغي تنفيذ جميع الخطوات في مجلس وزراء السلامة البيولوجية.

  1. معطف الآبار من لوحة غير مغلفة معقمة 48 جيدا عن طريق إضافة 200 درجة مئوية / جيدا من محلول فيبرونيكتين الإنسان المؤتلف في 1X PBS لمدة 2 ساعة في RT.
  2. بعد 2 ح، إزالة بعناية محلول فيبرونكتين الإنسان المؤتلف وتجاهل.
  3. سد الآبار مع 200 درجة مئوية / جيدا من 2٪ BSA لمدة 30 دقيقة في RT.
  4. قم بإستنشق محلول BSA واغسل الآبار مرتين بـ 500 ميكرولتر من PBS المعقمة 1x.
    ملاحظة: يمكن تخزين لوحات فيبرونيكتين المغلفة بجزء في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
  5. لتحفيز CD34+ HSPCs، إعادة تعليق الخلايا المعزولة حديثا (من الخطوة 3.17) في كثافة 1 × 105 خلايا / 200 ميكرولتر أو 5 × 105 خلايا / مل من وسائل التحفيز الدافئة 1X.
  6. إذا كنت تستخدم CD34+ خلايا مجمدة، قم بذوبان الخلايا ونقلها بسرعة إلى أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على DMEM كامل دافئ. الطرد المركزي في 600 × ز لمدة 5 دقائق وإعادة تعليق الخلايا كما هو موضح في الخطوة 5.5.
  7. لوحة 200 درجة مئوية من CD34+ تعليق الخلية لكل بئر من جزء فيبرونيكتين المغلفة لوحة 48 جيدا وحضانة لمدة 48 ساعة.
  8. في اليوم التالي، البذور 15،000 خلايا سترومال MS-5 في 200 درجة مئوية من DMEM كاملة لكل بئر من 48 جيدا معالجة ثقافة الأنسجة لوحة وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  9. بعد 48 ساعة من التحفيز، وجمع CD34+ الخلايا عن طريق الأنابيب لطيف. اغسل الآبار بـ 500 درجة مئوية من DMEM الدافئة ومسبح مع تعليق الخلية.
  10. عد الخلايا باللون الأزرق تريبان. طرد مركزي التعليق في 600 × ز لمدة 5 دقائق وإعادة تعليق في كثافة 5000 خلية / 200 درجة مئوية من 1X النخاع التمايز المتوسطة.
  11. من لوحة زراعة الأنسجة 48 جيدا البذر مع الخلايا سترومال MS-5، يستنشق بلطف المتوسطة دون إزعاج الخلايا. طبقة 200 درجة مئوية (5000 خلية) من CD34+ تعليق الخلية لكل بئر من لوحة وحضانة في 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن الحفاظ على ثقافة الخلايا MS-5 في DMEM كاملة. في اليوم الذي يتم فيه زرع الخلايا CD34+ ، يجب أن تكون الخلايا MS-5 في طبقة موحدة (التقاء 80-90٪). من المستحسن أن يتم طلاء الخلايا MS-5 قبل 24 ساعة على الأقل من البذر من CD34+ الخلايا.  إذا كانت خلايا MS-5 مطلية 48 ساعة أو 72 ساعة قبل زرع الخلايا CD34+ ، يجب تعديل كثافة الخلية وفقا لذلك. ومن المستحسن أيضا أن تترك الآبار الطرفية من لوحة 48 جيدا فارغة أو مليئة 200 درجة مئوية من الماء المعقم لتجنب آثار الحافة.
  12. قم بإجراء تغيير نصف متوسط كل 3-4 أيام عن طريق إزالة 100 ميكرولتر من المتوسط بلطف من أعلى كل بئر واستبداله بـ 100 ميكرولتر من 2x متوسط تمايز النخاعي لكل بئر.
  13. في اليوم 21، حصاد الخلايا لتحليل التعبير علامة النسب النخاعي عن طريق قياس التدفق. دون إزعاج طبقة MS-5، ماصة بلطف المتوسطة ونقل الخلايا إلى أنبوب 5 مل.
    ملاحظة: للتلطيخ وتدفق تحليل قياس الخلايا، والخلايا من 1-2 الآبار كافية. ويمكن أيضا رصد التمايز في الأيام 1 و 7 و 14. إذا كان إجراء علم الفينومينة المناعية في عدة أيام، ينبغي حساب أعداد الآبار اللازمة للتحليل وفقا لذلك.
  14. وصمة عار 5 × 105 خلايا مع الأجسام المضادة إلى CD34 (APC-Cy7)، CD66b (PE-Cy7)، CD14 (PE)، CD41 (PerCP-Cy5.5)، وCD235a (APC) في حجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر. بوابات إيجابية وسلبية لكل فلوروفور، و7-AAD كوصمة عار حية / ميتة للقضاء على الخلايا الميتة من التحليل.
  15. غسل وإصلاح (اختياري) الخلايا الملونة كما هو موضح أعلاه (الخطوات 4.3-4.6).
  16. إعادة تعليق الخلايا في 500 درجة مئوية من تدفق قياس الخلايا العازلة وتحليلها بواسطة مقياس التدفق.

6. تقييم المورفولوجيا الخلوية

  1. تنظيف الشرائح المجهر عن طريق رش الإيثانول ومسح حتى صرير.
  2. تزج الشرائح نظيفة في حل بولي-L-يسين لمدة 5 دقائق في RT وجافة لمدة 1 ساعة في RT.
  3. إعادة تعليق HSPCs من الخطوة 3.14 والخلايا المتمايزة من الخطوة 5.13 في 10 μL من المخزن المؤقت قياس التدفق.
  4. نقل تعليق الخلية إلى الشرائح المغلفة وتركها لتجفيف الهواء.
    ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح من اليوم 1 واليوم 21 في RT وملطخة في وقت واحد.
  5. صب 0.5 مل من وصمة عار رايت غيمسا على الشريحة والسماح الوقوف لمدة 3 دقائق في RT.
  6. إضافة كمية متساوية من الماء منزوع الأيونات والسماح الوقوف لمدة 10 دقيقة إضافية في RT.
  7. اغسل الشريحة في الماء منزوع الأيونات.
  8. تصور الخلايا الملونة في التكبير من 60x أو 100x بواسطة المجهر.

النتائج

تطبيق البروتوكولات المذكورة أعلاه ينتج 5.6 (± 0.5) × 108 MNCs و 1 (± 0.3) × 106 CD34+ خلايا من وحدة دم الحبل السري من ~ 100 مل. وتتراوح النسبة المئوية لمجموع CD34+ الخلايا بين 80-90٪ (الشكل2A،B). التحليل المناعي من قبل المخطط الذي وصفه Manz وآخرون5 يدل على ...

Discussion

البروتوكول الموضح هنا مناسب للتمايز في الجسم الحي السابق من UCB المستمدة CD34+ HSPCs إلى السلالات النخاعية الأربعة. الحضانة الأولية مع مزيج السيتوكين تتكون من SCF، TPO، Flt3L وIL3 يحفز CD34+ الخلايا. في وقت لاحق، يتم تحقيق التمايز مع كوكتيل من SCF، IL3، Flt3L، EPO، وTPO. في هذا المزيج، SCF، IL3، وFlt3L مهمة ل...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يشكروا ويندي باريت، وراشيل كاباييرو، وغابرييلا رويز من ماريكوبا للأنظمة الصحية المتكاملة على وحدات دم الحبل السري التي تم تحديدها والتبرع بها، ومريناليني كالا للمساعدة في قياس التدفق، وغاي كروكس وكريستوفر ريت من أجل المشورة بشأن التمايز النخاعي السابق. وقد تم دعم هذا العمل بأموال إلى S.S. من المعاهد الوطنية للصحة (R21CA170786 و R01GM127464) والجمعية الأمريكية للسرطان (منحة البحوث المؤسسية 74-001-34-IRG). والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.4% Trypan blue solutionThermo Fisher Scientific15250-061Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS
0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0Gibco 15575-038
10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Invitrogen14185052Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2
2.5% Trypsin, no phenol redThermo Fisher Scientific15090046Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS
30 µm Pre-separation filtersMiltenyi biotech130-041-407
35% sterile Bovine serum albuminSigma-AldrichA7979
7-AADBiolegend420404Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis
Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a)Biolegend312207Use 1:20 dilution
Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5)Biolegend301403Use 1:5 dilution
Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6)Biolegend306012Use 1:20 dilution
Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2)Biolegend301806Use 1:20 dilution
Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7)BD Biosciences347543Use 1:5 dilution
Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2))BD Biosciences551336Use 1:20 dilution
Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2)Biolegend306609Use 1:50 dilution
Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581)Biolegend343514Use 1:20 dilution
Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2)Biolegend303506Use 1:20 dilution
Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1)Biolegend300405Use 1:20 dilution
Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8)Biolegend303720Use 1:20 dilution
Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100)Biolegend304126Use 1:20 dilution
Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5)Biolegend305116Use 1:20 dilution
Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7)Biolegend343103Use 1:20 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher ScientificBP231-100Filter sterilize before use
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine Gibco12100046Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media  with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin 
Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivatedOmega ScientificFB-22 Lot #609716
Human CD34 microbead kit Miltenyi biotech130-046-702
Human Thrombopoietin (TPO), research gradeMiltenyi biotech130-094-011Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium
L-GlutamineOmega ScientificGS-602 mM concentration in stimulation medium
LS ColumnsMiltenyi biotech130-042-401
MACS Multi standMiltenyi biotech130-042-303
MidiMACS magnetic separatorMiltenyi biotech130-042-302
MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS)GE Healthcare Biosciences17-1440-03
MS-5 cellsGift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. 
Penicillin & StreptomycinSigma-AldrichP4458-100ml
Poly-L lysineSigma-AldrichP2636Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS
Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α)BioBasicRC213-15Make a stock of 2,000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation
Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin)Takara T100BUse 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs.
Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L)BioBasicRC214-16Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium
Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3)BioBasicRC212-14Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium
Recombinant human stem cell factor (rHu SCF)BioBasicRC213-12Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium
Serum free medium (X-Vivo-15)Lonza 04-418Q
Sodium bicarbonateFisher ScientificBP328-500
Wright-Giemsa stain, modifiedSigma-AldrichWG16-500Use according to manufacturer's instructions
Equipment 
BD LSR II flow cytometerBD Biosciences
CentrifugeSorvall Legend RT
Light microscopeOlympus

References

  1. Hao, Q. L., Shah, A. J., Thiemann, F. T., Smogorzewska, E. M., Crooks, G. M. A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow. Blood. 86 (10), 3745-3753 (1995).
  2. Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
  3. Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91 (5), 661-672 (1997).
  4. Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 2 (6), 640-653 (2010).
  5. Haas, S., et al. Inflammation-Induced Emergency Megakaryopoiesis Driven by Hematopoietic Stem Cell-like Megakaryocyte Progenitors. Cell Stem Cell. 17 (4), 422-434 (2015).
  6. Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
  7. Bender, J. G., et al. Phenotypic analysis and characterization of CD34+ cells from normal human bone marrow, cord blood, peripheral blood, and mobilized peripheral blood from patients undergoing autologous stem cell transplantation. Clinical Immunology and Immunopathology. 70 (1), 10-18 (1994).
  8. Fritsch, G., et al. The composition of CD34 subpopulations differs between bone marrow, blood and cord blood. Bone Marrow Transplantation. 17 (2), 169-178 (1996).
  9. Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem Cells. 13 (2), 158-166 (1995).
  10. Hordyjewska, A., Popiolek, L., Horecka, A. Characteristics of hematopoietic stem cells of umbilical cord blood. Cytotechnology. 67 (3), 387-396 (2015).
  11. Bapat, A., et al. Myeloid Disease Mutations of Splicing Factor SRSF2 Cause G2-M Arrest and Skewed Differentiation of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. Stem Cells. 36, 1-13 (2018).
  12. Yip, B. H., et al. The U2AF1S34F mutation induces lineage-specific splicing alterations in myelodysplastic syndromes. Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2206-2221 (2017).
  13. Yoo, E. S., et al. Myeloid differentiation of human cord blood CD34+ cells during ex vivo expansion using thrombopoietin, flt3-ligand and/or granulocyte-colony stimulating factor. British Journal of Haematology. 105 (4), 1034-1040 (1999).
  14. Hao, Q. L., Smogorzewska, E. M., Barsky, L. W., Crooks, G. M. In vitro identification of single CD34+CD38- cells with both lymphoid and myeloid potential. Blood. 91 (11), 4145-4151 (1998).
  15. Moretta, F., et al. The generation of human innate lymphoid cells is influenced by the source of hematopoietic stem cells and by the use of G-CSF. European Journal of Immunology. 46 (5), 1271-1278 (2016).
  16. Sanz, E., et al. Ordering human CD34+CD10-CD19+ pre/pro-B-cell and CD19- common lymphoid progenitor stages in two pro-B-cell development pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5925-5930 (2010).
  17. Egeland, T., et al. Myeloid differentiation of purified CD34+ cells after stimulation with recombinant human granulocyte-monocyte colony-stimulating factor (CSF), granulocyte-CSF, and interleukin-3. Blood. 78 (12), 3192-3199 (1991).
  18. Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81 (11), 2844-2853 (1993).
  19. Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).
  20. Palii, C. G., Pasha, R., Brand, M. Lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (53), e2813 (2011).
  21. Davies, C., et al. Silencing of ASXL1 impairs the granulomonocytic lineage potential of human CD34(+) progenitor cells. British Journal of Haematology. 160 (6), 842-850 (2013).
  22. Caceres, G., et al. TP53 suppression promotes erythropoiesis in del(5q) MDS, suggesting a targeted therapeutic strategy in lenalidomide-resistant patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16127-16132 (2013).
  23. Shi, H., et al. ASXL1 plays an important role in erythropoiesis. Scientific Reports. 6, 28789 (2016).
  24. Mazumdar, C., et al. Leukemia-Associated Cohesin Mutants Dominantly Enforce Stem Cell Programs and Impair Human Hematopoietic Progenitor Differentiation. Cell Stem Cell. 17 (6), 675-688 (2015).
  25. Chung, K. Y., et al. Enforced expression of an Flt3 internal tandem duplication in human CD34+ cells confers properties of self-renewal and enhanced erythropoiesis. Blood. 105 (1), 77-84 (2005).
  26. Ambrosini, P., et al. IL-1beta inhibits ILC3 while favoring NK-cell maturation of umbilical cord blood CD34(+) precursors. European Journal of Immunology. 45 (7), 2061-2071 (2015).
  27. Batard, P., et al. TGF-(beta)1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycle and induces CD34 antigen up-modulation. Journal of Cell Science. 113, 383-390 (2000).
  28. Huang, N., Lou, M., Liu, H., Avila, C., Ma, Y. Identification of a potent small molecule capable of regulating polyploidization, megakaryocyte maturation, and platelet production. Journal of Hematology & Oncology. 9 (1), 136 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

150CD34megakaryocyte

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved