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Resumo

Aqui, nós apresentamos um protocolo para a caracterização immunophenotypic e a diferenciação induzida citocinas do sangue do cabo derivado CD34+ a haste hematopoietic e as pilhas do progenitor às quatro linhagens Myeloid. As aplicações deste protocolo incluem investigações sobre o efeito de mutações da doença Myeloid ou de moléculas pequenas na diferenciação Myeloid das pilhas de CD34+ .

Resumo

A diferenciação ex vivo de células-tronco hematopoiéticas humanas é um modelo amplamente utilizado para estudar a hematopoiese. O protocolo descrito aqui é para a diferenciação induzida citocinas de pilhas da haste e do progenitor de CD34+ hematopoietic às quatro pilhas myeloid da linhagem. As pilhas de CD34+ são isoladas do sangue humano do cabo de cordão umbilical e co-cultivadas com as pilhas STROMAL MS-5 na presença de cytokines. A caracterização de immunophenotypic das pilhas da haste e do progenitor, e as pilhas Myeloid diferenciadas da linhagem são descritas. Usando este protocolo, as pilhas de CD34+ podem ser incubadas com moléculas pequenas ou transadas com lentivirus para expressar mutações myeloid da doença para investigar seu impacto na diferenciação Myeloid.

Introdução

A diferenciação normal de células-tronco hematopoiéticas (HSCs) é fundamental para a manutenção de níveis fisiológicos de todas as linhagens de células sanguíneas. Durante a diferenciação, em uma resposta coordenada às pistas extracelulares, incluindo fatores de crescimento e citocinas, as hscs primeiro dão origem a células de progenitoras multipotentes (MPP) que têm potencial lympho-mielóide1,2,3 ,4 (Figura 1). Os MPPs dão origem a progenitores mielóides comuns (CMPs) e progenitores linfoides comuns (CLPs) que são restritos à linhagem. Os CLPs diferenciam nas linhagens lymphoid compostas de B, T, e de pilhas naturais do assassino. Os CMPS geram as linhagens Myeloid através de duas populações mais restritas do progenitor, dos progenitores Erythroid do megacariócito (deputados), e dos progenitores do monocyte do granulocyte (GMPs). Os eurodeputados dão origem a megacariócitos e eritrócitos, enquanto os GMPs dão origem a granulócitos e monócitos. Além do que levanta-se com CMPS, os megacariócitos foram relatados para levantar-se também diretamente de hscs ou de Mpps adiantados através das vias não-canônicas5,6.

As células tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPCs) são caracterizadas pelo marcador de superfície CD34 e pela falta de marcadores específicos de linhagem (Lin-). Outros marcadores de superfície comumente empregados para distinguir HSCs e populações de progenitoras mielóides incluem CD38, CD45RA e CD1232 (Figura 1). HSCs e MPPs são Lin-/Cd34+/CD38- e Lin-/CD34+/CD38+, respectivamente. As populações de progenitoras comprometidas mielóides distinguem-se pela presença ou ausência de CD45RA e CD123. As CMPS são Lin-/CD34+/CD38+/CD45RA-/CD123lo, os GMPs são Lin-/CD34+/CD38+/CD45RA+/CD123lo, e os eurodeputados são Lin-/CD34+ /Cd38+/Cd45ra-/CD123-.

A população total de células CD34+ Stem e progenitoras pode ser obtida a partir do sangue do cordão umbilical humano (UCB), da medula óssea e do sangue periférico. As células CD34+ constituem 0, 2% a 1,46% das células mononucleares totais (MNCs) em UCB humano, enquanto a sua percentagem varia entre 0,5% e 5,3% na medula óssea e é muito mais baixa em ~ 0, 1% no sangue periférico7,8,9 . A capacidade proliferativa e o potencial de diferenciação das células CD34+ derivadas de UCB é significativamente maior do que a da medula óssea ou das células sanguíneas periféricas1,10, oferecendo assim uma vantagem distinta para obter material suficiente para análises moleculares em combinação com a realização de caracterização imunofenootípica e morfológica das células durante a diferenciação.

A diferenciação ex vivo do sangue do cordão umbilical CD34+ hspcs é um modelo amplamente aplicado para a investigação de hematopoiese normal e mecanismos de doença hematopoética. Quando cultivadas com as citocinas apropriadas, a UCB CD34+ hspcs pode ser induzida para diferenciar ao longo das linhagens mielóide ou linfoide11,12,13,14,15 , 16. aqui, nós descrevemos protocolos para a isolação e a caracterização immunophenotypic do CD34+ HSPCS do UCB humano, e para sua diferenciação às pilhas myeloid da linhagem. Este sistema da cultura é baseado na diferenciação cytokine-induzida dos HSPCs na presença de pilhas stromal MS-5 para imitar o microambiente na medula. As condições da cultura causam uma expansão inicial das pilhas de CD34+ , seguidas por sua diferenciação às pilhas que expressam marcadores para as quatro pilhas myeloid da linhagem, a saber os granululocytes (CD66b), os monócitos (CD14), os megacariócitos (CD41), e eritrócitos (CD235a). As aplicações do protocolo de diferenciação celular CD34+ incluem estudos sobre mecanismos moleculares que regulam a hematopoiese, e investigações sobre o impacto de mutações associadas à doença mielóide e pequenas moléculas na autorenovação e diferenciação de HSPCs.

Protocolo

O sangue do cordão umbilical humano para experimentação foi doado por indivíduos sadios após consentimento informado para a Maricopa sistemas integrados de saúde (MIHS), Phoenix. As unidades desidentificadas foram obtidas por meio de um acordo de transferência de material entre a MIHS e a Universidade do Arizona.

1. reagentes e amortecedores

Nota: Prepare todos os reagentes e tampões condições estéreis em um armário de segurança biológico.

  1. Prepare o tampão estéril de PBS-BSA-EDTA (PBE) adicionando 7,2 mL da albumina de soro bovina estéril de 35% (BSA; use a classe estéril 35% BSA da cultura do tecido) e 5 mL do ácido tetra acético da diamina do etileno de 0,5 M estéril (EDTA) a 487,8 mL do fosfato de Dulbecco estéril tamponado soro fisiológico (DPBS). O filtro esteriliza e de-gás o amortecedor deixando o filtro anexado ao vácuo em um armário de segurança biológico para pelo menos 2 h. aliquot o tampão de-gabastecido em volumes menores (250 mL) e armazene em 4 ° c.
  2. Prepare a solução de sal equilibrada de 1x Hanks (1x HBSS). Diluir 100 mL de estoque de 10x HBSS em 900 mL de água destilada estéril para fazer 1 L de 1x HBSS e ajustar o pH para 7,2. O filtro Esteriliza o 1x HBSS antes de usar.
  3. Prepare 2% de solução de ácido acético adicionando 2 mL de ácido acético glacial a 98 mL de água destilada.
  4. Prepare 20 ng/mL solução de fragmento de fibronectina humana recombinante em 1X PBS. Faça 10 mL por placa 48-well.
  5. Prepare 2% BSA. Para 100 mL 1X PBS, adicione 2 gramas de fração BSA V. filtro esterilizar antes de usar.
  6. Faça o meio modificado da águia de Dulbecco completo (DMEM) adicionando o pó de DMEM, o bicarbonato de sódio do GM 3,7, o soro fetal do bovino de 100 mL (FBS) e a penicilina-estreptomicina de 5 mL (picosegundo) a 800 mL da água destilada estéril. Misture e compo o volume a 1 L, e esterilize o filtro antes de usar-se.
  7. Prepare o meio de congelação misturando 90 mL de FBS e 10 mL de dimetil sulfóxido estéril (DMSO).
  8. Prepare o meio de estimulação. Ao meio livre do soro, adicione a L-glutamina a 2 milímetros, e as citocinas a uma concentração final de 50 ng/ml para o fator da pilha de haste (SCF), o thrombopoietin (TPO), e o ligante da tirosina quinase 3 de FMS-como (Flt3L), e 20 ng/ml para interleukin-3 ( para a preparação de soluções em estoque de citocinas). Faça 5 mL por placa 48-well.
  9. Prepare o meio de diferenciação mielóide 1x. Para completar DMEM, adicionar citocinas a uma concentração final de 5 ng/mL para SCF, Flt3L, e IL3, 50 ng/mL para TPO, e 4 unidades/mL para eritropoietina (EPO). Faça 5 mL por placa 48-well.
  10. Prepare o meio de diferenciação mielóide 2x. Para completar o DMEM, adicione citocinas a uma concentração final de 10 ng/mL para SCF, Flt3L e IL3, 100 ng/mL para TPO e 8 unidades/mL para EPO. Faça 5 mL por placa 48-well.
  11. Prepare o tampão da citometria do fluxo. Para 1 L de 1X PBS, adicione 10 g de fração BSA V.
  12. Prepare 1% paraformaldeído em 1X PBS (ver tabela de materiais para mais detalhes).
  13. Prepare a solução de poli-L-lisina adicionando 500 μL de 10 mg/mL de poli-L-lisina a 49,5 mL de 1X PBS.

2. isolamento de células mononucleares do sangue do cordão umbilical

Nota: Para o protocolo descrito abaixo, foram utilizados volumes sanguíneos de cordão umbilical de 90 a 100 mL. O isolamento das células CD34+ deve ser realizado condições estéreis em um armário de segurança biológico.

  1. Pulverize o saco que contem UCB com o etanol 70% para esterilizar a superfície exterior antes de introduzi-la no armário de segurança biológico. Transfira o UCB para um frasco de plástico estéril de 250 mL e dilui-o 1:1 adicionando um volume igual de temperatura ambiente (RT) 1x HBSS.
  2. Dispensar 15 mL de meio de fraccionamento MNC (MFM; ver tabela de materiais) por tubo em cerca de seis tubos estéreis 50 ml cônicos. Incline o tubo com MFM e despeje suavemente 30 mL de UCB diluído na camada MFM sem perturbá-lo.
  3. Centrifugue os tubos a 400 x g durante 30 min em RT com aceleração lenta e sem travão.
  4. Após a centrifugação, aspirar entre 15-20 mL do plasma acima da camada de MNC. Recolha suavemente as MNCs com uma pipeta e transfira para um novo tubo cônico de 50 mL.
    Nota: O depósito de MNCs como uma camada branca da Buffy na relação do plasma e do MFM, e os glóbulos vermelhos (RBCs) sedimento na parte inferior do tubo cônico.
  5. Os MNCs da Associação coletaram de 2-3 tubos junto. Compo o volume de cada tubo a 50 mL com o amortecedor frio de PBE.
  6. Centrifugue os tubos a 300 x g durante 10 min a 4 ° c, com o travão em baixo.
  7. Aspirar o sobrenadante e bata o tubo suavemente para soltar o pellet celular.
  8. Resuspender as células peletizadas em 5 mL de tampão PBE gelado. Use as mesmas 5 mL de células resuspensas para coletar células de outros tubos. Combine células de 3 a 4 tubos em conjunto em 1 50 mL de tubo cônico.
  9. Para recolher todas as células restantes, lave todos os tubos com 5 mL de tampão PBE frio e adicione ao tubo cônico de 50 mL.
  10. Conte as MNCs diluindo 10 μL de suspensão celular em 490 μL de solução de ácido acético.
    Nota: O ácido acético lise qualquer contaminando RBCs para permitir a contagem mais fácil de MNCs.
  11. Compo o volume da suspensão da pilha a 50 mL com o amortecedor Ice-Cold de PBE. Centrifugue as pilhas em 300 x g por 10 minutos em 4 ° c, com freio em baixo.
    Nota: A suspensão de MNC pode ser processada imediatamente para o isolamento de células CD34+ ou congelada para aplicações posteriores.
  12. Para congelar as MNCs, retire o sobrenadante e Resuspenda a uma densidade de 2 x 107 células/ml em meio de congelação em RT.
  13. Congele as pilhas em-80 ° c durante a noite em um recipiente de congelação da pilha e transfira-os então ao nitrogênio líquido.

3. isolação de pilhas de CD34+ das pilhas mononuclear

  1. Se o uso de MNCs recém-isolados prosseguir diretamente para a etapa 3,3.
  2. Se estiver usando MNCs congelados, descongele rapidamente as células congeladas em um banho de água de 37 ° c e transfira para um tubo cônico de 50 mL. Colete todas as células restantes nos frascos com 1 mL de tampão PBE gelado e transfira para o tubo cônico de 50 mL.
  3. Compõem o volume da suspensão MNC para 50 mL com tampão PBE frio e centrifugador a 600 x g durante 5 min a 4 ° c.
  4. Retire o sobrenadante e bata o tubo suavemente para soltar o pellet celular. Re-suspender as MNCs para 1 x 108 células em 300 μL de Ice-Cold PBE buffer.
  5. Adicione 100 μL de reagente de bloqueio de FcR do jogo humano do microbead do CD34 da classificação de pilha (MACS) magnética-ativada por 1 x 108 MNCs e misture delicadamente.
    Nota: Isto obstrui a ligação inespecíficos aos microbeads CD34.
  6. Adicionar 100 μL de microesferas CD34 por 1 x 108 células. Misture suavemente e incubar a 4 ° c durante 30 min num frigorífico. Não incubar no gelo.
  7. Enquanto as células estão incubando, coloque uma coluna LS e filtro de pré-separação no campo magnético do separador MACS. Equilibrar a coluna com o tampão PBE gelado adicionando 2 mL directamente na coluna e 1 mL no filtro de pré-separação. Permita que a coluna esvazie em um tubo cônico de 15 mL e descarte o fluxo.
  8. Remova as MNCs de 4 ° c, adicione o amortecedor PBE Ice-Cold para compo o volume a 15 mL, e Centrifugue as pilhas em 300 x g por 10 minutos em 4 ° c, com o freio em baixo.
  9. Aspirar o sobrenadante e resuspender as células em 1 mL de tampão PBE gelado.
  10. Adicione a suspensão da célula ao filtro de pré-separação colocado na coluna LS.
    Nota: O filtro de pré-separação remove quaisquer agregados de células grandes que podem bloquear a coluna.
  11. Enxague o tubo com 3 mL de tampão PBE gelado e adicione-o ao filtro de pré-separação colocado na coluna LS. Depois disso, descarte o filtro de pré-separação.
  12. Lave a coluna LS quatro vezes adicionando 3 mL de tampão PBE gelado, permitindo que a coluna escorra cada vez.
    Nota: As células CD34+ permanecerão vinculadas à coluna e as células sem rótulo fluirão pela coluna.
  13. Após a lavagem final, retire a coluna do campo magnético do separador MACS e coloque-a num novo tubo cônico de 15 mL, longe do íman.
  14. Adicione 5 mL de tampão PBE gelado à coluna e expelir as células CD34+ ligadas empurrando firmemente o êmbolo.
  15. Opcionalmente, passe células CD34+ isoladas da primeira coluna sobre outra coluna ls com o filtro de pré-separação, conforme descrito acima (etapas 3.10 − 3.13).
  16. Conte as células CD34+ isoladas com azul de Tripan (10 μL de células e 10 μL de azul de Tripan) para determinar o número total de células ao vivo.
    Nota: Nesta fase, as células CD34+ isoladas podem ser congeladas para uso posterior ou podem ser processadas diretamente para análise de HSPCs por citometria de fluxo (seção 4) ou para diferenciação em células de linhagem mielóide (seção 5).
  17. Centrifugue a suspensão da pilha em 600 x g por 5 minutos em RT, com freio em baixo.
  18. Para congelar as células CD34+ , aspirar o sobrenadante e re-suspender até 5 x 106 células em 1 ml de congelamento médio e congelar como descrito acima (passo 2,13). Caso contrário, prossiga para a seção 4 ou 5.

4. determinação de populações de caule e progenitoras por citometria de fluxo

  1. Para determinar as frações das populações de tronco e progenitoras no recém-isolado CD34+ hspcs, centrifugue-os a 600 x g por 5 min e Resuspenda 1 x 106 células em 50 μL de tampão de citometria de fluxo.
  2. Para 1 x 106 células CD34+ , adicione anticorpos (ver tabela de materiais para diluições) a marcadores de linhagem (CD3, CD7, CD10, CD11b, CD19 e CD235a — todos os FITC rotulados), CD34 (APC-Cy7), CD38 (PE), CD45RA (PE-Cy7), CD123 (APC) e 7- aminoactinomicina D (7-AAD; como uma mancha viva/morta) e compõem o volume total para 100 μL. Incubar no gelo no escuro por 20 min.
    Nota: Menos de 1 x 106 células CD34+ podem ser empregadas para análise. Se manchar menos células, o volume total e o volume de anticorpos adicionados devem ser reduzidos em conformidade. Para a análise de citometria de fluxo, as MNCs não manchadas e únicas devem ser usadas como controles para a fixação de portões positivos e negativos para cada fluoróforo.
  3. Após a incubação, lave as células com 1 mL de tampão de citometria de fluxo e centrifugue a 600 x g durante 5 min.
  4. Opcionalmente, fixar as células manchadas em 0,5 mL de 1% solução paraformaldeído por 10 min no escuro em RT.
  5. Centrifugar a 600 x g durante 5 min e aspirar o sobrenadante.
  6. Lave as células fixas/manchadas com 1 mL de tampão de citometria de fluxo e centrifugue a 600 x g durante 5 min a 4 ° c.
  7. Aspirar o sobrenadante, re-suspender as células em 500 μL de tampão de citometria de fluxo, e analisar por um citometro de fluxo (tabela de materiais).

5. diferenciação mielóide da haste hematopoiética CD34+ e células progenitoras

Nota: Para diferenciar o CD34+ hspcs às pilhas myeloid da linhagem, são estimulados primeiramente em placas revestidas humanas de recombinação do fragmento do fibronectina e semeadas então em uma camada de pilhas STROMAL MS-5 no meio myeloid da diferenciação. A diferenciação pode ser monitorada a cada semana durante 3 semanas com base na expressão de marcadores de superfície celular específicos para as quatro linhagens mielóides. Durante a estimulação e a diferenciação, todas as incubações são executadas em 37 ° c e em 5% CO2 em uma câmara humidificada. Todas as etapas devem ser executadas em um armário de segurança biológico.

  1. Cubra os poços de uma placa 48-well estéril não revestida adicionando 200 μL/poço da solução humana de recombinação do fibronectina em 1X PBS para 2 h em RT.
  2. Após 2 h, Retire cuidadosamente a solução de fibronectina humana recombinante e elimine-a.
  3. Bloqueie os poços com 200 μL/poço de 2% de BSA por 30 min em RT.
  4. Aspirar a solução de BSA e lave os poços duas vezes com 500 μL de 1X PBS estéril.
    Nota: As placas revestidas do fragmento de fibronectin podem ser armazenadas em 4 ° c por até 2 semanas.
  5. Para estimular o CD34+ hspcs, re-suspender as células recém-isoladas (a partir do passo 3,17) em uma densidade de 1 x 105 células/200 μl ou 5 x 105 células/ml de meio de estimulação quente 1x.
  6. Se estiver usando células CD34+ congeladas, descongele e transfira rapidamente as células para um tubo cônico de 15 ml contendo DMEM completo quente. Centrifugue a 600 x g durante 5 min e Resuspenda as células conforme descrito no passo 5,5.
  7. Placa 200 μL da suspensão de células CD34+ por poço do fragmento de fibronectina revestido placa de 48 poços e incubar para 48 h.
  8. No dia seguinte, sementes 15.000 MS-5 células estromais em 200 μL de DMEM completo por poço de uma cultura de tecido 48 bem tratada e incubar a 37 ° c por 24 h.
  9. Após 48 h da estimulação, colete as pilhas de CD34+ pela pipetagem delicada. Lave os poços com 500 μL de DMEM quente e piscina com a suspensão celular.
  10. Conte as células com azul de Tripan. Centrifugue a suspensão a 600 x g durante 5 min e Resuspenda a uma densidade de 5.000 células/200 μL de meio de diferenciação mielóide 1x.
  11. Da placa da cultura do tecido 48-well semeado com as pilhas stromal MS-5, Aspire delicadamente o meio sem perturbar as pilhas. Camada 200 μL (5.000 células) da suspensão de células CD34+ por poço da placa e incubar a 37 ° c.
    Nota: A cultura das células MS-5 pode ser mantida em DMEM completo. No dia em que as células CD34+ são semeadas, as células MS-5 devem estar em uma camada uniforme (80-90% de confluência). Recomenda-se que as pilhas MS-5 estejam chapeadas pelo menos 24 horas antes da semeadura das pilhas de CD34+ .  Se as pilhas MS-5 devem ser chapeadas 48 h ou 72 h antes de semear as pilhas CD34+ , a densidade da pilha deve ser ajustada conformemente. Recomenda-se também que os poços periféricos da placa 48-well sejam deixados em branco ou preenchidos com 200 μL de água estéril para evitar efeitos de aresta.
  12. Realize uma mudança meio-média a cada 3 − 4 dias, removendo suavemente 100 μL do meio da parte superior de cada poço e substituindo-o por 100 μL de meio de diferenciação mielóide 2x por poço.
  13. No 21º dia, colher as células para análise da expressão do marcador da linhagem mielóide por citometria de fluxo. Sem perturbar a camada MS-5, pipete suavemente o meio e transfira as células para um tubo de 5 mL.
    Nota: Para a análise de coloração e citometria de fluxo, as células de 1-2 poços são suficientes. A diferenciação também pode ser monitorada nos dias 1, 7 e 14. Se executar imunofenotipagem em dias múltiplos, os números dos poços necessários para a análise devem ser calculados conformemente.
  14. Mancha 5 x 105 células com anticorpos para CD34 (APC-Cy7), CD66B (PE-Cy7), CD14 (PE), CD41 (percp-Cy 5.5), e CD235A (APC) em um volume total de 50 ΜL. Incubar no gelo no escuro por 20 min. inclua MNCs manchados e únicos manchado como controles para ajustar portas positivas e negativas para cada fluoróforo, e 7-AAD como uma mancha viva/inoperante para eliminar pilhas inoperantes da análise.
  15. Lave e fixe (opcional) as células manchadas como descrito acima (etapas 4.3-4.6).
  16. Re-suspender as células em 500 μL de tampão de citometria de fluxo e analisar por um citometro de fluxo.

6. avaliação da morfologia celular

  1. Limpe as lâminas do microscópio pulverizando o etanol e limpando até Squeaky.
  2. Mergulhe os slides limpos em solução de poli-L-lisina por 5 min em RT e seque por 1 h em RT.
  3. Ressuscitem os HSPCs da etapa 3,14 e células diferenciadas do passo 5,13 em 10 μL de tampão de citometria de fluxo.
  4. Transfira a suspensão da célula para as lâminas revestidas e deixe-as secar ao ar.
    Nota: Os slides do dia 1 e do dia 21 podem ser armazenados em RT e manchados simultaneamente.
  5. Despeje 0,5 mL da mancha Wright-Giemsa no slide e deixe ficar por 3 min em RT.
  6. Adicione o volume igual de água deionizada e deixe-se levantar para 10 minutos adicionais em RT.
  7. Lave a lâmina em água desionizada.
  8. Visualize células manchadas em uma ampliação de 60x ou 100x por um microscópio.

Resultados

A aplicação dos protocolos acima rende 5,6 (± 0,5) x 108 MNCs e 1 (± 0,3) x 106 células CD34+ de uma unidade de sangue do cabo de ~ 100 ml. A percentagem de células CD34+ totais varia entre 80-90% (Figura 2A, B). A análise imunofenotípica pelo esquema descrito por Manz et al.5 demonstra que as células CD34+ tipicamente consistem em ~ 20% hscs e ~ 72% Mpps que são Lin-/Cd34

Discussão

O protocolo descrito aqui é apropriado para a diferenciação ex vivo de UCB derivado CD34+ hspcs às quatro linhagens Myeloid. A incubação inicial com uma mistura de citocina consistindo de SCF, TPO, Flt3L e IL3 estimula as células CD34+ . Subseqüentemente, a diferenciação é conseguida com um cocktail de SCF, de IL3, de Flt3L, de EPO, e de TPO. Nesta mistura, o SCF, o IL3, e o Flt3L são importantes para a sobrevivência e a proliferação de CD34+ hscs. ePO e TPO promovem a dife...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Wendy Barrett, Rachel Caballero, e Gabriella Ruiz de Maricopa sistemas integrados de saúde para as unidades de sangue de cabo de-identificado e doado, Mrinalini Kala para assistência com citometria de fluxo, e bandidos gays e Christopher seet para aconselhamento sobre diferenciação mielóide ex vivo. Este trabalho foi apoiado por fundos para S.S. dos institutos nacionais de saúde (R21CA170786 e R01GM127464) e da sociedade americana de câncer (a pesquisa institucional Grant 74-001-34-IRG). O conteúdo é unicamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente os pontos de vista oficiais dos institutos nacionais de saúde.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.4% Trypan blue solutionThermo Fisher Scientific15250-061Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS
0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0Gibco 15575-038
10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Invitrogen14185052Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2
2.5% Trypsin, no phenol redThermo Fisher Scientific15090046Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS
30 µm Pre-separation filtersMiltenyi biotech130-041-407
35% sterile Bovine serum albuminSigma-AldrichA7979
7-AADBiolegend420404Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis
Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a)Biolegend312207Use 1:20 dilution
Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5)Biolegend301403Use 1:5 dilution
Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6)Biolegend306012Use 1:20 dilution
Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2)Biolegend301806Use 1:20 dilution
Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7)BD Biosciences347543Use 1:5 dilution
Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2))BD Biosciences551336Use 1:20 dilution
Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2)Biolegend306609Use 1:50 dilution
Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581)Biolegend343514Use 1:20 dilution
Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2)Biolegend303506Use 1:20 dilution
Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1)Biolegend300405Use 1:20 dilution
Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8)Biolegend303720Use 1:20 dilution
Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100)Biolegend304126Use 1:20 dilution
Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5)Biolegend305116Use 1:20 dilution
Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7)Biolegend343103Use 1:20 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher ScientificBP231-100Filter sterilize before use
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine Gibco12100046Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media  with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin 
Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivatedOmega ScientificFB-22 Lot #609716
Human CD34 microbead kit Miltenyi biotech130-046-702
Human Thrombopoietin (TPO), research gradeMiltenyi biotech130-094-011Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium
L-GlutamineOmega ScientificGS-602 mM concentration in stimulation medium
LS ColumnsMiltenyi biotech130-042-401
MACS Multi standMiltenyi biotech130-042-303
MidiMACS magnetic separatorMiltenyi biotech130-042-302
MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS)GE Healthcare Biosciences17-1440-03
MS-5 cellsGift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. 
Penicillin & StreptomycinSigma-AldrichP4458-100ml
Poly-L lysineSigma-AldrichP2636Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS
Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α)BioBasicRC213-15Make a stock of 2,000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation
Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin)Takara T100BUse 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs.
Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L)BioBasicRC214-16Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium
Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3)BioBasicRC212-14Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium
Recombinant human stem cell factor (rHu SCF)BioBasicRC213-12Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium
Serum free medium (X-Vivo-15)Lonza 04-418Q
Sodium bicarbonateFisher ScientificBP328-500
Wright-Giemsa stain, modifiedSigma-AldrichWG16-500Use according to manufacturer's instructions
Equipment 
BD LSR II flow cytometerBD Biosciences
CentrifugeSorvall Legend RT
Light microscopeOlympus

Referências

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