人脐带血衍生CD34的泛骨髓分化–造血干细胞和祖细胞

摘要

在这里,我们提出了免疫表征表表征和细胞因子诱导分化脐带血衍生CD34^-造血干细胞和祖细胞到四个骨髓系的方案。该协议的应用包括研究骨髓疾病突变或小分子对CD34+细胞骨髓分化的影响。

摘要

人类造血干细胞的体外分化是研究造血干细胞的一个广泛应用的模型。此处描述的方案用于细胞因子诱导的CD34^{分化 -}造血干细胞和祖细胞到四个骨髓体体细胞。CD34^–细胞从人类脐带血中分离出来,在细胞因子存在的情况下与MS-5基质细胞共同培养。描述了干细胞和祖细胞的免疫表征特征,以及分化的骨髓体系细胞。使用该协议,CD34⁺细胞可以用小分子孵育,或用慢病毒转导,以表达骨髓疾病突变,以研究其对骨髓分化的影响。

引言

造血干细胞(HSCs)的正常分化对于维持所有血细胞系的生理水平至关重要。在分化期间,在协调响应细胞外线索(包括生长因子和细胞因子)时,HSCs 首先产生具有淋巴-骨髓电位1、2、3 的多能祖细胞 (MPP) 细胞 ^,4 (图 1)。MpP 产生常见的骨髓祖体 (CmPs) 和常见的淋巴原代后代 (CLP) 受血统限制。CLP分化成由B、T和自然杀伤细胞组成的淋巴状谱系。CmPs 通过两个更受限的祖体群体(巨核细胞红细胞祖(MEPs)和粒细胞单细胞原代 (GMPs) 生成骨髓系。MEP产生巨核细胞和红细胞,而GMP产生粒细胞和单核细胞。除了通过CmPs产生,兆核细胞也报告直接产生于HC或早期的MpPs通过非规范途径5,6。

造血干细胞和祖细胞(HSPCs)的特点是表面标记CD34和缺乏系系特异性标记(Lin-)。其他通常用于区分 HSC 和骨髓祖体群体的表面标记包括 CD38、CD45RA 和 CD123 2(图1)。HSC 和 Mp 分别为林^-/CD34⁺/CD38^-和林^-/CD34⁺/CD38⁺。骨髓已提交祖细胞群体由CD45RA和CD123的存在或不存在区分。CmP 是林^-/CD34⁺/CD38⁺/CD45RA^-/CD123 lo,GMP 是林^-/CD34⁺/CD38⁺/CD45RA⁺/CD123^lo,MEP是林^-/CD34^|/CD38⁼/CD45RA^-/CD123^-.

CD34⁺干细胞和祖细胞的总数可以从人类脐带血 (UCB)、骨髓和外周血获得。CD34^–细胞占人类UCB中单核细胞总数的0.02%至1.46%,而骨髓中细胞的百分比在0.5%至5.3%之间,在外周血7、8、9中,其比例要低得多,为±0.01%.UCB衍生CD34+细胞的增殖能力和分化潜力明显高于骨髓或外周血细胞1、10,为获得足够的材料用于分子分析,结合在分化期间对细胞进行免疫表征和形态表征。

脐带血衍生CD34+HSPCs的体外分化是研究正常造血和造血病机制的一种广泛应用模型。当用适当的细胞因子培养时,UCB CD34⁺ HSPC 可诱导沿骨髓或淋巴体谱11、12、13、14、15进行分化^,16.在这里,我们描述了CD34和HSPCs从人类UCB分离和免疫表征表表征,以及它们分化为骨髓体代细胞的协议。这种培养系统基于在MS-5基质细胞存在的情况下,以细胞因子诱导的HSPCs分化,以模拟骨髓中的微环境。培养条件导致CD34+细胞的初始扩张,随后分化为表达四个骨髓系细胞标记的细胞,即粒细胞(CD66b)、单核细胞(CD14)、巨核细胞(CD41)和红细胞(CD235a)。CD34^®细胞分化协议的应用包括控制造血的分子机制研究,以及研究骨髓疾病相关突变和小分子对自我更新和HSPC的差异化。

研究方案

用于实验的人类脐带血是由健康人捐赠后,知情同意马里科帕综合卫生系统(MIHS),凤凰城。被除名的单位是通过MIHS和亚利桑那大学之间的材料转移协议获得的。

1. 试剂和缓冲液

注:在无菌条件下在生物安全柜中制备所有试剂和缓冲液。

1. 通过加入7.2 mL的无菌35%牛血清白蛋白(BSA;使用无菌组织培养等级35%BSA)和5 mL无菌0.5M乙烯二胺四乙酸(EDTA)至487.8 mL无菌Dulbecco的磷酸盐缓冲液,制备无菌PBS-BSA-EDTA(PBE)缓冲液盐水 (DPBS)。过滤器将过滤器固定在生物安全柜中,将过滤器附在真空中至少2小时,从而对缓冲液进行灭菌和脱气。
2. 准备 1x 汉克斯平衡盐溶液 (1x HBSS)。在 900 mL 的无菌蒸馏水中稀释 100 mL 的 100 mL HBSS 库存,使 1 L 的 1x HBSS,并将 pHH 调整到 7.2。过滤器在使用前对1x HBSS进行消毒。
3. 在98 mL蒸馏水中加入2 mL的冰川醋酸,制备2%醋酸溶液。
4. 在1xPBS中制备20纳克/mL重组人纤维素片段溶液。每 48 孔板生产 10 mL。
5. 准备 2% BSA。至100 mL 1x PBS,在使用前加入2克BSA分数V.过滤器消毒。
6. 将 DMEM 粉末、3.7 gm 碳酸氢钠、100 mL 胎儿牛血清 (FBS) 和 5 mL 青霉素-链霉素 (PS) 添加到 800 mL 的无菌蒸馏水中,制成完整的 Dulbeco 改性鹰培养基 (DMEM)。混合和将体积混入1L,并在使用前过滤消毒。
7. 通过混合 90 mL 的 FBS 和 10 mL 的无菌二甲基亚硫酸盐 (DMSO) 制备冷冻介质。
8. 准备刺激培养基。在无血清介质中,将L-谷氨酰胺添加到2 mM,将细胞因子添加到干细胞因子(SCF)、血栓波霉素(TPO)和Fms类酪氨酸激酶3配体(Flt3L)的最终浓度为50纳克/mL(参见材料表)用于制备细胞因子库存溶液)。每 48 孔板生产 5 mL。
9. 准备1x骨髓分化培养基。要完成DMEM,将细胞因子添加到SCF、Flt3L和IL3的最终浓度5纳克/mL中,为TPO添加50纳克/mL,为红细胞生成素(EPO)添加4单位/mL。每 48 孔板生产 5 mL。
10. 准备2x骨髓分化培养基。要完成 DMEM,将细胞因子添加到 SCF、Flt3L 和 IL3 的最终浓度 10 纳克/mL 中,为 TPO 添加 100 纳克/mL,为 EPO 添加 8 个单位/mL。每 48 孔板生产 5 mL。
11. 准备流式细胞学缓冲液。到 1 l 的 1x PBS 中,添加 10 g BSA 分数 V。
12. 在 1x PBS 中制备 1% 的甲醛(详情请参阅材料表)。
13. 通过将 500 μL 的 10 mg/mL 多L-莱辛添加到 49.5 mL 的 1x PBS 中制备聚L-莱辛溶液。

2. 从脐带血分离单核细胞

注:对于下述协议,使用90至100 mL的脐带血量。CD34⁺细胞的分离必须在生物安全柜的无菌条件下进行。

1. 用 70% 乙醇喷洒含有 UCB 的袋子,在将其引入生物安全柜之前对外表面进行消毒。将 UCB 转移到无菌 250 mL 塑料瓶中,并通过添加同等体积的室温 (RT) 1x HBSS 将其稀释 1:1。
2. 将15 mL的MNC分馏介质(MFM;见材料表)放入大约6个无菌50 mL锥形管中。用 MFM 倾斜管,将 30 mL 的稀释 UCB 轻轻倒入 MFM 层,而不会干扰它。
3. 在 RT 下,在 400 x g下将管离心 30 分钟,速度缓慢且无制动器。
4. 离心后,在MNC层上方的等离子体15-20 mL之间吸气。用移液器轻轻收集 MN,并转移到新的 50 mL 锥形管中。
   注:MNIC在血浆和MFM的界面上沉积为白色布漆层,而红细胞(RBCs)沉积在锥形管的底部。
5. 池 MNIC 从 2-3 管收集在一起。使用冷PBE缓冲液将每根管的体积组成至50 mL。
6. 在 4°C 下将管在 300 x g下离心 10 分钟,制动器处于低位。
7. 吸气上清液,轻轻敲击管以松开细胞颗粒。
8. 在5 mL的冰冷PBE缓冲液中重新悬浮颗粒细胞。使用相同的5 mL的重新悬浮细胞从其他管收集细胞。将3至4个管的细胞结合在一个50 mL锥形管中。
9. 要收集任何剩余的细胞,用5 mL的冷PBE缓冲液清洗所有管,并加入50 mL锥形管。
10. 通过将 10 μL 的细胞悬浮液稀释到 490 μL 醋酸溶液中,对 MMC 进行计数。
    注:醋酸可使任何污染的RBC都发生,从而更容易地计算MN。
11. 使用冰冷的PBE缓冲液将电池悬浮液的体积组成为50 mL。在 4°C 下以 300 x g将细胞离心 10 分钟,制动器处于低位。
    注:MNC 悬浮液可立即处理,以便分离 CD34⁺细胞,或为以后的应用进行冷冻。
12. 要冻结 MNIC,请去除上清液,并在RT的冷冻培养基中以2 x 10⁷细胞/mL的密度重新悬浮。
13. 在-80°C的细胞冷冻容器中过夜,然后将其转移到液氮中。

3. CD34的分离⁺从单核细胞中分离的细胞

1. 如果使用新隔离的跨国公司,则直接转到步骤 3.3。
2. 如果使用冷冻MNC,在37°C水浴中快速解冻冷冻细胞,并转移到50 mL锥形管中。用1 mL的冰冷的PBE缓冲液收集小瓶中剩余的任何细胞,并转移到50 mL锥形管中。
3. 使用冷PBE缓冲液将MNC悬浮液的体积组成至50 mL,并在4°C下以600 x g离心5分钟。
4. 取出上清液,轻轻敲击管以松开细胞颗粒。在300μL的冰冷的PBE缓冲液中,将MMC重新悬浮到1 x 10⁸个细胞。
5. 从磁性活细胞分拣 (MACS) 人 CD34 微珠试剂盒中每 1 x 10⁸ MNC 加入 100 μL FcR 阻断试剂,并轻轻混合。
   注:这阻止与CD34微珠的非特异性结合。
6. 每1 x10⁸细胞加入100μL的CD34微珠。轻轻混合,在4°C下在冰箱中孵育30分钟。不要在冰上孵育。
7. 孵化时,在MACS分离器磁场中放置LS柱和预分离滤波器。将 2 mL 直接添加到柱中,在预分离滤波器中将 2 mL 直接添加到柱中,用冰冷的 PBE 缓冲液对柱进行平衡。允许柱排入 15 mL 锥形管中,并丢弃流过。
8. 从 4°C 中取出 MMC,加入冰冷的 PBE 缓冲液,将体积补至 15 mL,并在 4°C 下以 300 x g将细胞离心 10 分钟,制动器处于低位。
9. 吸出上清液,在1mL的冰冷的PBE缓冲液中重新悬浮细胞。
10. 将电池悬浮液添加到放置在 LS 列上的预分离过滤器。
    注:预分离过滤器将删除任何可能阻塞列的大型单元聚合。
11. 用 3 mL 的冷型 PBE 缓冲液冲洗管,并将其添加到放置在 LS 柱上的预分离过滤器中。在此之后,丢弃预分离过滤器。
12. 通过添加 3 mL 的冷型 PBE 缓冲液,将 LS 柱洗涤四次,使该柱每次排空。
    注:CD34⁺单元格将保持绑定到列,未标记的单元格将流经该列。
13. 最后洗涤后,从 MACS 分离器磁场中取出柱,并将其放入新的 15 mL 锥形管中,远离磁铁。
14. 向柱塞添加 5 mL 冷冷 PBE 缓冲液,并通过在柱塞中用力推出绑定的 CD34⁺细胞。
15. 或者,将从第一列分离的 CD34⁺单元通过另一个 LS 列,使用上述预分离滤波器(步骤 3.10_3.13)。
16. 计数分离的CD34⁺具有锥蓝色(10 μL细胞和10μL的试青)的细胞,以确定活细胞的总数。
    注:在此阶段,分离的CD34+细胞可冷冻供日后使用,或可直接处理,通过流式细胞测定(第4节)或用于对骨髓谱系细胞的分化(第5节)分析HSPCs。
17. 在 RT 下将电池悬架在 600 x g下离心 5 分钟,制动器处于低位。
18. 要冻结CD34+细胞,吸出上清液,在1mL的冷冻培养基中重新悬浮至5 x 10⁶个细胞,并如上文所述冻结(步骤2.13)。否则,继续执行第 4 或第 5 节。

4. 通过流动细胞测定测定干细胞和祖细胞种群

1. 要确定新鲜分离的CD34+ HSPC中茎和祖体群的分量,将其在600 x g下离心5分钟,并在50μL流式细胞学缓冲液中重新悬浮1 x 10⁶个细胞。
2. 至 1 x 10⁶ CD34⁺细胞,向系界线标记(CD3、CD7、CD10、CD11b、CD19 和 CD235a ) 添加抗体(用于稀释的材料表) - 所有 FITC 标签)、CD34(APC-Cy7)、CD38(PE)、CD45RA (PE-Cy7)、CD123 (APC) 和 7氨基霉素D(7-AAD;作为活/死污渍),并组成总体积至100μL。在黑暗中在冰上孵育20分钟。
   注:分析可使用少于 1 x 10⁶ CD34⁺细胞。如果染色较少的细胞,总体积和添加的抗体量应相应减少。对于流式细胞学分析,应使用无染色和单染色 MFC 作为控制,用于为每个荧光团设置正极和负极。
3. 孵育后,用1mL流动细胞学缓冲液清洗细胞,并在600 x g下离心5分钟。
4. 可选择在 RT 的黑暗中将染色细胞固定在 0.5 mL 的 1% 甲醛溶液中 10 分钟。
5. 在 600 x g下离心 5 分钟,吸出上清液。
6. 用1 mL的流式细胞测量缓冲液清洗固定/染色细胞,在600 x g下在4°C下离心5分钟。
7. 吸出上清液,在500μL的流式细胞测定缓冲液中重新悬浮细胞,并通过流动细胞仪(材料表)进行分析。

5. CD34的骨髓分化^–造血干细胞和祖细胞

注:为了将CD34+HSPCs与骨髓体系细胞区分开来,首先在重组的人类纤维素片段涂层板中刺激它们,然后在骨髓分化培养基培养基培养基的MS-5基质细胞层上播种。根据四系骨髓系特有的细胞表面标记的表达,每周可以监测分化3周。在刺激和分化期间,所有孵育在37°C和5%CO₂在加湿室中进行。所有步骤都应在生物安全柜中执行。

1. 在 RT 处将 200 μL/孔重组人纤维素溶液加入 1x PBS 2 小时,在无涂层 48 孔板中涂覆孔。
2. 2小时后,小心地取出重组的人类纤维化溶液并丢弃。
3. 在 RT 处用 200 μL/2% BSA 的井块井 30 分钟。
4. 吸气BSA溶液,用500μL无菌1xPBS洗井两次。
   注:纤维素片段涂层板可在4°C下储存长达2周。
5. 要刺激CD34⁺ HSPCs,在1 x 10⁵细胞/200μL或5 x 10⁵细胞/mL的温热1x刺激培养基的密度下,重新悬浮新分离的细胞(从步骤3.17开始)。
6. 如果使用冷冻CD34+细胞,快速解冻,并将细胞转移到含有温暖完整的DMEM的15 mL锥形管中。在 600 x g下离心 5 分钟,然后重新悬浮步骤 5.5 中所述的细胞。
7. CD34的板200 μL⁼纤维素片段每孔细胞悬浮液涂覆48孔板,孵育48小时。
8. 第二天,种子15,000 MS-5基质细胞在200μL的完整DMEM每孔48孔组织培养处理板和孵育在37°C24小时。
9. 经过48小时的刺激后,通过温和的移液收集CD34+细胞。用500 μL的温DMEM清洗水井,用细胞悬架清洗水池。
10. 用锥蓝色计算单元格。将悬浮液在600 x g下离心5分钟,并在密度为5,000细胞/200μL的1x骨髓分化培养基下重新悬浮。
11. 从48孔组织培养板播种与MS-5基质细胞,轻轻地吸出培养基,而不会干扰细胞。CD34 的200μL层(5,000个细胞)= 板每孔细胞悬浮液,在37°C下孵育。
    注:MS-5细胞的培养可以在完整的DMEM中保持。在CD34+细胞播种的当天,MS-5细胞必须处于均匀的层(80-90%汇合)。建议在CD34+细胞播种前至少24小时对MS-5细胞进行镀层。 如果在CD34+细胞播种前,MS-5细胞要镀48小时或72小时,则应相应地调整细胞密度。还建议48孔板的外围井留空或填充200μL的无菌水,以避免边缘效应。
12. 每 3⁄4 天执行半介质变化,从每口井顶部轻轻去除 100 μL 的介质,并用每口井 100 μL 的 2x 骨髓分化介质替换。
13. 在第21天,收获细胞,通过流细胞测定分析骨髓谱系标记表达。在不干扰 MS-5 层的情况下,轻轻移液介质并将细胞转移到 5 mL 管中。
    注:对于染色和流式细胞学分析,1-2口井的细胞就足够了。第 1 天、第 7 天和第 14 天也可能监测差异。如果在多日内进行免疫分体,则应相应地计算分析所需的井数。
14. 染色5 x10⁵细胞,抗体对CD34(APC-Cy7)、CD66b(PE-Cy7)、CD14(PE)、CD41(PerCP-Cy5.5)和CD235a(APC),总体积为50μL。在黑暗中在冰上孵育20分钟。包括未染色和单染色的MNIC作为设置控制每个荧光酸的正门和负门,以及7-AAD作为活/死染色,从分析中消除死细胞。
15. 如上所述,清洗和修复(可选)染色细胞(步骤 4.3-4.6)。
16. 在500μL的流式细胞测量缓冲液中重新悬浮细胞,并通过流式细胞仪进行分析。

6. 细胞形态评估

1. 通过喷洒乙醇和擦拭,直到吱吱作响,清洁显微镜滑动。
2. 将清洁幻灯片浸入聚L-流酶溶液中,在RT下浸泡5分钟,在RT干燥1小时。
3. 在10μL流式细胞学缓冲液中从步骤3.14中重新悬浮HSPC和从步骤5.13中分化的细胞。
4. 将电池悬架转移到涂布的幻灯片上,使其待风干燥。
   注:从第 1 天和第 21 天的幻灯片可以同时存储在 RT 上并染色。
5. 在幻灯片上倒入 0.5 mL 的赖特-吉姆萨污渍,并在 RT 处站立 3 分钟。
6. 加入相等体积的去离子水,并在RT上再站10分钟。
7. 在去离子水中清洗幻灯片。
8. 用显微镜以60倍或100倍的放大倍率可视化染色细胞。

结果

应用上述协议可产生 5.6 (± 0.5) x 10⁸ MDC 和 1 (± 0.3) x 10⁶ CD34⁺来自脐带血单位 ±100 mL 的细胞。CD34⁺细胞总数的百分比在 80-90% 之间 (图 2A,B)。Manz等人描述方案^的免疫表位分析表明,CD34⁺细胞通常由+20%的HSC和+72%的MpPs组成,即林^-/CD34⁺/CD38^-和林^-/CD34^|/CD38⁼分别 (

讨论

此处所述的协议适用于 UCB 衍生 CD34^和HSPC 到四个骨髓谱系的体外分化。由SCF、TPO、Flt3L和IL3组成的细胞因子混合物的初始孵育刺激CD34+细胞。随后,通过SCF、IL3、Flt3L、EPO和TPO的混合物实现了差异化。在此组合中,SCF、IL3 和 Flt3L 对 CD34⁺ HSC 的生存和增殖非常重要。 EPO 和 TPO 分别促进对红细胞和巨核细胞的分化,IL3 促进早期粒细胞单细胞的分化前体和成熟细胞13,17,18。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue solution	Thermo Fisher Scientific	15250-061	Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS
0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0	Gibco	15575-038
10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14185052	Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2
2.5% Trypsin, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	15090046	Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS
30 µm Pre-separation filters	Miltenyi biotech	130-041-407
35% sterile Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7979
7-AAD	Biolegend	420404	Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis
Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a)	Biolegend	312207	Use 1:20 dilution
Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5)	Biolegend	301403	Use 1:5 dilution
Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6)	Biolegend	306012	Use 1:20 dilution
Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2)	Biolegend	301806	Use 1:20 dilution
Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7)	BD Biosciences	347543	Use 1:5 dilution
Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2))	BD Biosciences	551336	Use 1:20 dilution
Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2)	Biolegend	306609	Use 1:50 dilution
Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581)	Biolegend	343514	Use 1:20 dilution
Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2)	Biolegend	303506	Use 1:20 dilution
Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1)	Biolegend	300405	Use 1:20 dilution
Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8)	Biolegend	303720	Use 1:20 dilution
Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100)	Biolegend	304126	Use 1:20 dilution
Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5)	Biolegend	305116	Use 1:20 dilution
Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7)	Biolegend	343103	Use 1:20 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100	Filter sterilize before use
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine	Gibco	12100046	Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media  with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin
Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated	Omega Scientific	FB-22 Lot #609716
Human CD34 microbead kit	Miltenyi biotech	130-046-702
Human Thrombopoietin (TPO), research grade	Miltenyi biotech	130-094-011	Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium
L-Glutamine	Omega Scientific	GS-60	2 mM concentration in stimulation medium
LS Columns	Miltenyi biotech	130-042-401
MACS Multi stand	Miltenyi biotech	130-042-303
MidiMACS magnetic separator	Miltenyi biotech	130-042-302
MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS)	GE Healthcare Biosciences	17-1440-03
MS-5 cells			Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2.
Penicillin & Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458-100ml
Poly-L lysine	Sigma-Aldrich	P2636	Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS
Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α)	BioBasic	RC213-15	Make a stock of 2,000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation
Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin)	Takara	T100B	Use 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs.
Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L)	BioBasic	RC214-16	Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium
Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3)	BioBasic	RC212-14	Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium
Recombinant human stem cell factor (rHu SCF)	BioBasic	RC213-12	Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium
Serum free medium (X-Vivo-15)	Lonza	04-418Q
Sodium bicarbonate	Fisher Scientific	BP328-500
Wright-Giemsa stain, modified	Sigma-Aldrich	WG16-500	Use according to manufacturer's instructions
Equipment
BD LSR II flow cytometer	BD Biosciences
Centrifuge	Sorvall Legend RT
Light microscope	Olympus