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Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para la caracterización inmunophenotípica y la diferenciación inducida por citoquinas de la sangre de cordón umbilical derivada CD34+ células madre hematopoyéticas y células progenitoras a los cuatro linajes mieloides. Las aplicaciones de este protocolo incluyen investigaciones sobre el efecto de mutaciones de la enfermedad mieloide o moléculas pequeñas en la diferenciación mieloide de las células CD34+.

Resumen

La diferenciación ex vivo de células madre hematopoyéticas humanas es un modelo ampliamente utilizado para estudiar la hematopoyesis. El protocolo descrito aquí es para la diferenciación inducida por citoquinas de CD34+ células madre hematopoyéticas y células progenitoras a las cuatro células de linaje mieloides. CD34+ células están aisladas de la sangre del cordón umbilical humano y co-cultivadas con células estromales MS-5 en presencia de citoquinas. Se describe la caracterización inmunofenotípica de las células madre y progenitora, y las células de linaje mieloides diferenciadas. Usando este protocolo, las células CD34+ pueden ser incubadas con moléculas pequeñas o transducidas con lentivirus para expresar mutaciones de la enfermedad mieloide para investigar su impacto en la diferenciación mieloide.

Introducción

La diferenciación normal de las células madre hematopoyéticas (HSC) es fundamental para el mantenimiento de los niveles fisiológicos de todos los linajes de células sanguíneas. Durante la diferenciación, en una respuesta coordinada a las señales extracelulares, incluidos los factores de crecimiento y las citoquinas, los HSC dan lugar primero a células progenitoras multipotentes (MPP) que tienen potencial linfo-mieloides1,2,3 ,4 (Figura 1). Los PMP dan lugar a progenitores mieloides comunes (CMP) y progenitores linfoides comunes (CLP) que están restringidos al linaje. Los CLP se diferencian en los linajes linfoides compuestos por Células, T y células asesinas naturales. Los CMP generan los linajes mieloides a través de dos poblaciones de progenitores más restringidas, progenitores de eritroides de megacarilocitos (MEP) y progenitores de monocitos granulocitos (GMP). Los eurodiputados dan lugar a megacariocitos y eritrocitos, mientras que los GMP dan lugar a granulocitos y monocitos. Además de surgir a través de los CMP, se ha informado que los megacariocitostambién surgen directamente de los HSC o de los primeros PMP a través de vías no canónicas 5,6.

Las células hematopoyéticas del tallo y del progenitor (HSPC) se caracterizan por el marcador de superficie CD34 y la falta de marcadores específicos de linaje (Lin-). Otros marcadores de superficie que se emplean comúnmente para distinguir las poblaciones de Progenitores DeSC y mieloides incluyen CD38, CD45RA y CD1232 (Figura1). Los HSC y los MPP son Lin-/CD34+/CD38- y Lin-/CD34+/CD38+, respectivamente. Las poblaciones de progenitores comprometidos mieloides se distinguen por la presencia o ausencia de CD45RA y CD123. Los CMP son Lin-/CD34+/CD38+/CD45RA-/CD123lo, los GMP son Lin-/CD34+/CD38+/CD45RA+/CD123lo, y los MEP son Lin-/CD34+ /CD38+/CD45RA-/CD123-.

La población total decélulas madre y progenitora CD34 se puede obtener de la sangre del cordón umbilical humano (UCB), la médula ósea y la sangre periférica. CD34+ células constituyen 0.02% a 1.46% del total de células mononucleares (MNC) en UCB humano, mientras que su porcentaje varía entre 0.5% y 5.3% en la médula ósea y es mucho menor a 0.01% en sangre periférica7,8,9 . La capacidad proliferativa y el potencial de diferenciación de las células UCB derivadas CD34+ es significativamente mayor que la de la médula ósea o las células sanguíneas periféricas1,10, ofreciendo así una clara ventaja para obtener material suficiente para los análisis moleculares en combinación con la realización de caracterización inmunofenotípica y morfológica de las células durante la diferenciación.

La diferenciación ex vivo de la sangre del cordón umbilical derivada de CD34+ HSPCs es un modelo ampliamente aplicado para investigar los mecanismos normales de la hematopoyesis y la enfermedad hematopoyética. Cuando se cultiva con las citoquinas apropiadas, los UCB CD34+ HSCCP pueden ser inducidos a diferenciar a lo largo de los linajes mieloides o linfoides11,12,13,14,15 , 16. Aquí, describimos protocolos para el aislamiento y la caracterización inmunofenotípica de los CD34+ HSCCP de UCB humano, y para su diferenciación a las células de linaje mieloides. Este sistema de cultivo se basa en la diferenciación inducida por citoquinas de los HSCCP en presencia de células estromales MS-5 para imitar el microambiente en la médula ósea. Las condiciones de cultivo causan una expansión inicial de las células CD34 +, seguidas de su diferenciación a las células que expresan marcadores para las cuatro células de linaje mieloides, a saber, granulocitos (CD66b), monocitos (CD14), megacariocitos (CD41) y eritrocitos (CD235a). Las aplicaciones del protocolo CD34+ diferenciación celular incluyen estudios sobre mecanismos moleculares que regulan la hematopoyesis, y investigaciones sobre el impacto de mutaciones asociadas a la enfermedad mieloide y moléculas pequeñas en la auto-renovación y la auto-renovación y diferenciación de los HSCCP.

Protocolo

La sangre del cordón umbilical humano para la experimentación fue donada por individuos sanos después del consentimiento informado a Maricopa Integrated Health Systems (MIHS), Phoenix. Las unidades desidentificadas se obtuvieron a través de un Acuerdo de Transferencia de Materiales entre MIHS y la Universidad de Arizona.

1. Reactivos y búferes

NOTA: Preparar todos los reactivos y tampones en condiciones estériles en un gabinete de seguridad biológica.

  1. Preparar un tampón estéril de PBS-BSA-EDTA (PBE) añadiendo 7,2 ml de albúmina sérica estéril 35% bovina (BSA; utilizar el cultivo de tejido estéril 35% BSA) y 5 ml de ácido tetra acético de etileno estéril de 0,5 M (EDTA) a 487,8 ml de fosfato estéril de Dulbecco tamponado salina (DPBS). Filtrar esterilizar y desgasificaciónr el tampón dejando el filtro unido al vacío en un armario de seguridad biológica durante al menos 2 h. Aliquot el tampón desgasilizado en volúmenes más pequeños (250 ml) y almacenar a 4 oC.
  2. Preparar 1 solución salina balanceada Hanks (1x HBSS). Diluir 100 ml de 10x HBSS en 900 ml de agua destilada estéril para hacer 1 L de 1x HBSS y ajustar el pH a 7.2. El filtro esteriliza el 1x HBSS antes de su uso.
  3. Preparar una solución de ácido acético al 2% añadiendo 2 ml de ácido acético glacial a 98 ml de agua destilada.
  4. Preparar 20 ng/ml solución de fragmento de fibronectina humana recombinante en 1x PBS. Hacer 10 ml por placa de 48 pocillos.
  5. Preparar 2% BSA. A 100 mL 1x PBS, añadir 2 gramos de fracción BSA V. Filtrar esterilizar antes de su uso.
  6. Haga un medio de águila modificada (DMEM) completo de Dulbecco añadiendo el polvo DMEM, bicarbonato sódico de 3,7 gm, suero bovino fetal de 100 ml (FBS) y 5 ml de penicilina-estreptomicina (PS) a 800 ml de agua destilada estéril. Mezclar y componer el volumen a 1 L, y filtrar esterilizar antes de su uso.
  7. Preparar el medio de congelación mezclando 90 ml de FBS y 10 ml de dimetilsulfóxido estéril (DMSO).
  8. Prepare el medio de estimulación. Para el medio libre de suero, añadir L-glutamina a 2 mM, y citoquinas a una concentración final de 50 ng/mL para factor de células madre (SCF), trombopoietina (TPO), y Fms-como tirosina quinasa 3 ligand(Flt3L), y 20 ng/mL para interleukin-3 (IL3) (ver Tabla de Materiales 3 ligandro (Flt3L), y 20 ng/ml para interleucina-3 (IL3) (ver Tabla de Materiales 3 ligando (Flt3L), y 20 ng/ml para interleucina-3 (IL3) (ver Tabla de Materiales 3 ligando (Flt3L), y 20 ng/ml para interleucina-3 (IL3) (ver Tabla de Materiales 3 ligando (Flt3L), y 20 ng/ml para interleucina-3 (IL3) (ver Tabla de Materiales 3 ligar (Flt3L), y 20 ng/ml para interleucina-3 (IL3) (ver Tabla de Materiales 3 ligando (Flt3L), y 20 ng/ml para interleucina- para la preparación de soluciones de stock de citoquinas). Hacer 5 mL por placa de 48 pocillos.
  9. Preparar 1x medio de diferenciación mieloide. Para completar DMEM, añada citoquinas a una concentración final de 5 ng/ml para SCF, Flt3L e IL3, 50 ng/mL para TPO y 4 unidades/ml para eritropoyetina (EPO). Hacer 5 mL por placa de 48 pocillos.
  10. Preparar 2x medio de diferenciación mieloide. Para completar DMEM, añada citoquinas a una concentración final de 10 ng/ml para SCF, Flt3L e IL3, 100 ng/mL para TPO y 8 unidades/ml para EPO. Hacer 5 mL por placa de 48 pocillos.
  11. Prepare el búfer de citometría de flujo. A 1 L de 1x PBS, agregue 10 g de fracción BSA V.
  12. Prepare 1% de paraformaldehyde en 1x PBS (ver Tabla de Materiales para más detalles).
  13. Preparar la solución de poli-L-lisina mediante la adición de 500 l de 10 mg/ml poli-L-lisina a 49,5 ml de 1x PBS.

2. Aislamiento de células mononucleares de la sangre del cordón umbilical

NOTA: Para el protocolo descrito a continuación, se utilizaron volúmenes de sangre de cordón umbilical de 90 a 100 ml. El aislamiento de las células CD34+ debe realizarse en condiciones estériles en un armario de seguridad biológica.

  1. Rocíe la bolsa que contiene UCB con 70% de etanol para esterilizar la superficie exterior antes de introducirla en el gabinete de seguridad biológica. Transfiera el UCB a una botella de plástico estéril de 250 ml y diluya 1:1 añadiendo un volumen igual de temperatura ambiente (RT) 1x HBSS.
  2. Dispensar 15 ml de medio de fraccionamiento MNC (MFM; ver Tabla de Materiales)por tubo en aproximadamente seis tubos cónicos estériles de 50 ml. Incline el tubo con MFM, y vierta suavemente 30 ml de UCB diluido sobre la capa de MFM sin molestarlo.
  3. Centrifugar los tubos a 400 x g durante 30 min a RT con aceleración lenta y sin freno.
  4. Después de la centrifugación, aspirar entre 15-20 mL del plasma por encima de la capa MNC. Recoja suavemente los MNC con una pipeta y transfiera a un nuevo tubo cónico de 50 ml.
    NOTA: Los MNC se depositan como una capa blanca y pulsada en la interfaz del plasma y el MFM, y el sedimento de los glóbulos rojos (RBR) en la parte inferior del tubo cónico.
  5. Piscina MNCs recogidos de 2-3 tubos juntos. Componer el volumen de cada tubo a 50 ml con tampón PBE frío.
  6. Centrifugar los tubos a 300 x g durante 10 min a 4oC, con el freno bajo.
  7. Aspirar el sobrenadante y toque el tubo suavemente para aflojar el pellet celular.
  8. Vuelva a suspender las células peletadas en 5 ml de tampón PBE helado. Utilice los mismos 5 ml de células resuspendidas para recoger células de otros tubos. Combine las células de 3 a 4 tubos en un tubo cónico de 50 ml.
  9. Para recoger las células restantes, lave todos los tubos con 5 ml de tampón PBE frío y agréguelos al tubo cónico de 50 ml.
  10. Cuente los MNC diluyendo 10 ml de suspensión celular en una solución de ácido acético de 490 l.
    NOTA: El ácido acético lide cualquier glóbulo contaminante para permitir un recuento más fácil de los MNC.
  11. Componer el volumen de la suspensión celular a 50 ml con tampón PBE frío con hielo. Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min a 4oC, con freno bajo.
    NOTA: La suspensión MNC puede procesarse inmediatamente para el aislamiento de células CD34+ o congelada para aplicaciones posteriores.
  12. Para congelar los MNC, retire el sobrenadante y vuelva a suspender a una densidad de 2 x 107 células/ml en medio de congelación en RT.
  13. Congele las células a -80 oC durante la noche en un recipiente de congelación celular y luego transfieralas a nitrógeno líquido.

3. Aislamiento de CD34+ Células de células mononucleares

  1. Si utiliza MNCs recién aislados proceda directamente al paso 3.3.
  2. Si utiliza MNCcongelados congelados, descongele rápidamente las células congeladas en un baño de agua de 37 oC y transfiera a un tubo cónico de 50 ml. Recoger las células restantes en los viales con 1 ml de tampón PBE helado y transferirlas al tubo cónico de 50 ml.
  3. Hacer el volumen de la suspensión MNC a 50 ml con tampón PBE frío y centrífuga a 600 x g durante 5 min a 4 oC.
  4. Retire el sobrenadante y toque suavemente el tubo para aflojar el pellet celular. Vuelva a suspender los MNC a 1 x 108 células en 300 ml de tampón PBE helado.
  5. Agregue 100 l de reactivo de bloqueo de FcR del kit de microperlas de células de activación magnética (MACS) por cada 1 x 108 MNCs y mezcle suavemente.
    NOTA: Esto bloquea la unión inespecífica a los microperlas CD34.
  6. Agregue 100 l de los microperlas CD34 por cada 1 x 108 celdas. Mezcle suavemente e incubar a 4oC durante 30 min en nevera. No incubar sobre hielo.
  7. Mientras las celdas están incubando, coloque una columna LS y un filtro de preseparación en el campo magnético del separador MACS. Equilibrar la columna con búfer PBE frío mediante la adición de 2 ml directamente en la columna y 1 ml en el filtro de separación previa. Deje que la columna se vacíe en un tubo cónico de 15 ml y deseche el flujo a través.
  8. Retire los MNC s de 4 oC, añada un tampón PBE helado para aumentar el volumen a 15 ml y centrifugar las células a 300 x g durante 10 minutos a 4 oC, con el freno bajo.
  9. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en 1 ml de tampón PBE helado.
  10. Agregue la suspensión de celda al filtro de preseparación colocado en la columna LS.
    NOTA: El filtro de separación previa elimina los agregados de celdas grandes que pueden bloquear la columna.
  11. Enjuague el tubo con 3 ml de tampón PBE helado y agréguelo al filtro de preseparación colocado en la columna LS. Después de esto, deseche el filtro de separación previa.
  12. Lave la columna LS cuatro veces agregando 3 ml de tampón PBE helado, permitiendo que la columna drene cada vez.
    NOTA: Las celdas CD34+ permanecerán enlazadas a la columna y las celdas sin etiquetar fluirán a través de la columna.
  13. Después del lavado final, retire la columna del campo magnético del separador MACS y colóquela en un nuevo tubo cónico de 15 ml, lejos del imán.
  14. Agregue un búfer PBE helado de 5 ml a la columna y expulse las células CD34+ enlazadas presionando firmemente el émbolo.
  15. Opcionalmente, pase CD34+ celdas aisladas de la primera columna sobre otra columna LS con el filtro de preseparación como se describió anteriormente (pasos 3.10-3.13).
  16. Cuente el CD34+ celdas aislados con trippan azul (10 l de células y 10 l de trippan azul) para determinar el número total de células vivas.
    NOTA: En esta etapa, las células aisladas CD34+ pueden congelarse para su uso posterior o pueden procesarse directamente para el análisis de hSCCP mediante citometría de flujo (sección 4) o para la diferenciación a las células de linaje mieloides (sección 5).
  17. Centrifugar la suspensión de la celda a 600 x g durante 5 min a RT, con freno bajo.
  18. Para congelar las células CD34 +, aspirar el sobrenadante y volver a suspender hasta 5 x 106 células en 1 ml de medio de congelación y congelar como se describió anteriormente (paso 2.13). De lo contrario, proceda a la sección 4 o 5.

4. Determinación de las poblaciones de tallo y progenitores por citometría de flujo

  1. Para determinar las fracciones de las poblaciones de tallo y progenitor en los CD34+ HSPC recién aislados, centrirítelas a 600 x g durante 5 min y vuelva a suspender 1 x 106 células en 50 ml de tampometría de citometría de flujo.
  2. A 1 x 106 células CD34 +, añada anticuerpos (ver Tabla de Materiales para diluciones) a los marcadores de linaje (CD3, CD7, CD10, CD11b, CD19 y CD235a — todos los FITC etiquetados), CD34 (APC-Cy7), CD38 (PE), CD45RA (PE-Cy7), CD123 (APC) y 7- aminoactinomicina D (7-AAD; como una mancha viva / muerta) y conforman el volumen total a 100 ol. Incubar sobre hielo en la oscuridad durante 20 minutos.
    NOTA: Menos de 1 x 106 CD34+ células pueden ser empleadas para el análisis. Si se tiñen menos células, el volumen total y el volumen de anticuerpos añadidos deben reducirse en consecuencia. Para el análisis de citometría de flujo, se deben utilizar MNC sin manchas y de una sola mancha como controles para establecer puertas positivas y negativas para cada fluoróforo.
  3. Después de la incubación, lave las células con 1 ml de tampón de citometría de flujo y centrífuga a 600 x g durante 5 min.
  4. Opcionalmente, fije las células manchadas en 0,5 ml de solución de paraformaldehído al 1% durante 10 minutos en la oscuridad en RT.
  5. Centrífuga a 600 x g durante 5 min y aspirar al sobrenadante.
  6. Lavar las células fijas/teñidas con 1 ml de tampón de citometría de flujo y centrífuga a 600 x g durante 5 min a 4 oC.
  7. Aspirar el sobrenadante, volver a suspender las células en 500 s de tampometría de flujo y analizarlas mediante un citómetro de flujo (Tablade materiales).

5. Diferenciación mieloide del CD34+ Células hematopoyéticas del tallo y del progenitor

NOTA: Para diferenciar los CD34+ HSpCs a las células del linaje mieloide, primero se estimulan en placas recombinantes recombinantes recombinantes recombinantes de fragmentos de fibronectina humana y luego se sembran en una capa de células estromales MS-5 en el medio de diferenciación mieloide. La diferenciación se puede controlar cada semana durante 3 semanas en función de la expresión de marcadores de superficie celular específicos de los cuatro linajes mieloides. Durante la estimulación y la diferenciación, todas las incubaciones se realizan a 37 oC y 5% deCO2 en una cámara humidificada. Todos los pasos deben realizarse en un armario de seguridad biológica.

  1. Recubrir los pozos de una placa estéril sin recubrir de 48 pocillos añadiendo 200 l/pozo de solución recombinante de fibronectina humana en 1x PBS durante 2 horas a RT.
  2. Después de 2 h, retire cuidadosamente la solución recombinante de fibronectina humana y deseche.
  3. Bloquear los pozos con 200 l/bien de 2% De BSA durante 30 min a RT.
  4. Aspirar la solución de BSA y lavar los pozos dos veces con 500 ml de PBS estéril 1x.
    NOTA: Las placas recubiertas de fragmentos de fibronectina pueden almacenarse a 4 oC durante un máximo de 2 semanas.
  5. Para estimular los CD34+ HSCCP, vuelva a suspender las células recién aisladas (del paso 3.17) a una densidad de 1 x 105 células/200 l o 5 x 105 células/ml de medio de estimulación 1x caliente.
  6. Si utiliza CD34+ células congeladas, descongele y transfiera rápidamente las células a un tubo cónico de 15 ml que contenga DMEM caliente y completo. Centrifugar a 600 x g durante 5 min y volver a suspender las células como se describe en el paso 5.5.
  7. Placa 200 l del CD34+ suspensión celular por pozo del fragmento de fibronectina recubierto de placa de 48 pocillos e incubar durante 48 h.
  8. Al día siguiente, la semilla 15.000 células estromales MS-5 en 200 ol de DMEM completo por pozo de una placa tratada con cultivo de tejido de 48 pocillos e incubar a 37 oC durante 24 horas.
  9. Después de 48 h de estimulación, recoger el CD34+ células mediante pipeteo suave. Lave los pozos con 500 ml de DMEM caliente y piscina con la suspensión de la celda.
  10. Cuente las celdas con trippan azul. Centrifugar la suspensión a 600 x g durante 5 min y volver a suspender a una densidad de 5.000 células/200 l de 1x medio de diferenciación mieloides.
  11. A partir de la placa de cultivo de tejido de 48 pocillos sembrada con células estromales MS-5, aspirar suavemente el medio sin perturbar las células. Capa 200 l (5.000 celdas) del CD34+ suspensión celular por pozo de la placa e incubar a 37 oC.
    NOTA: El cultivo de las células MS-5 se puede mantener en el DMEM completo. El día en que se sembran las células CD34 +, las células MS-5 deben estar en una capa uniforme (80-90% de confluencia). Se recomienda que las células MS-5 se celen al menos 24 horas antes de la sembración de las células CD34 +.  Si las células MS-5 deben ser chapadas 48 h o 72 h antes de la sembración de las células CD34+, la densidad celular debe ajustarse en consecuencia. También se recomienda que los pozos periféricos de la placa de 48 pocillos se dejen en blanco o se llenen con 200 ml de agua estéril para evitar efectos en los bordes.
  12. Realice un cambio medio-medio cada 3 x 4 días retirando suavemente 100 ml del medio de la parte superior de cada pocal y reemplazándolo por 100 s de 2x medio de diferenciación mieloide por pozo.
  13. El día 21, cosechar las células para el análisis de la expresión del marcador de linaje mieloide por citometría de flujo. Sin alterar la capa MS-5, pipetee suavemente el medio y transfiera las células a un tubo de 5 ml.
    NOTA: Para el análisis de tinción y citometría de flujo, las células de 1-2 pozos son suficientes. La diferenciación también se puede controlar en los días 1, 7 y 14. Si se realiza inmunofenotipado en varios días, el número de pozos necesarios para el análisis debe calcularse en consecuencia.
  14. Manchas 5 x 105 células con anticuerpos a CD34 (APC-Cy7), CD66b (PE-Cy7), CD14 (PE), CD41 (PerCP-Cy5.5) y CD235a (APC) en un volumen total de 50 l. Incubar en hielo en la oscuridad durante 20 min. Incluir MNCs sin mancha y de una sola mancha como controles para establecer puertas positivas y negativas para cada fluoróforo, y 7-AAD como una mancha viva / muerta para eliminar las células muertas del análisis.
  15. Lavar y fijar (opcional) las células manchadas como se describió anteriormente (pasos 4.3-4.6).
  16. Vuelva a suspender las células en un búfer de citometría de flujo de 500 ml y analizarlas mediante un citómetro de flujo.

6. Evaluación de la Morfología Celular

  1. Limpie los portaobjetos del microscopio pulverizando etanol y limpiando hasta que sea chirrecto.
  2. Sumerja las diapositivas limpias en la solución de poli-L-lisina durante 5 min a RT y seque durante 1 h en RT.
  3. Resuspenda los HSCCP del paso 3.14 y las células diferenciadas del paso 5.13 en 10 l de tampometría de citometría de flujo.
  4. Transfiera la suspensión celular a los portaobjetos recubiertos y déjelos secar al aire.
    NOTA: Las diapositivas del día 1 y el día 21 se pueden almacenar en RT y mancharse simultáneamente.
  5. Vierta 0,5 ml de la mancha Wright-Giemsa en el tobogán y deje reposar durante 3 minutos en RT.
  6. Añadir el mismo volumen de agua desionizada y dejar reposar durante 10 minutos adicionales en RT.
  7. Lave el portaobjetos con agua desionizada.
  8. Visualice las células manchadas con un aumento de 60x o 100x por un microscopio.

Resultados

La aplicación de los protocolos anteriores produce 5,6 (a 0,5) x 108 MNCs y 1 (a 0,3) x 106 CD34+ células de una unidad de sangre de cordón umbilical de 100 ml. El porcentaje del total de CD34+ celdas oscila entre 80-90% (Figura2A,B). 5 demuestra que las células CD34+ consisten típicamente en HSC s20% y MPP de 72% que son Lin-/CD34 + /CD3...

Discusión

El protocolo descrito aquí es adecuado para la diferenciación ex vivo de CD34+ HSCCP derivados ucB a los cuatro linajes mieloides. La incubación inicial con una mezcla de citoquinas que consiste en Células SCF, TPO, Flt3L e IL3 estimula las células CD34+. Posteriormente, la diferenciación se logra con un cóctel de SCF, IL3, Flt3L, EPO y TPO. En esta mezcla, SCF, IL3 y Flt3L son importantes para la supervivencia y proliferación de CD34+ HSCs. EPO y TPO promueven la diferenciación ...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores quieren agradecer a Wendy Barrett, Rachel Caballero y Gabriella Ruiz de Maricopa Integrated Health Systems por las unidades de sangre de cordón de sin identificación y donado, Mrinalini Kala por la asistencia con la citometría de flujo, y Gay Crooks y Christopher Seet por consejos sobre la diferenciación mieloide ex vivo. Este trabajo fue apoyado por fondos a S.S. de los Institutos Nacionales de Salud (R21CA170786 y R01GM127464) y la Sociedad Americana contra el Cáncer (la Beca de Investigación Institucional 74-001-34-IRG). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.4% Trypan blue solutionThermo Fisher Scientific15250-061Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS
0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0Gibco 15575-038
10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Invitrogen14185052Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2
2.5% Trypsin, no phenol redThermo Fisher Scientific15090046Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS
30 µm Pre-separation filtersMiltenyi biotech130-041-407
35% sterile Bovine serum albuminSigma-AldrichA7979
7-AADBiolegend420404Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis
Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a)Biolegend312207Use 1:20 dilution
Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5)Biolegend301403Use 1:5 dilution
Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6)Biolegend306012Use 1:20 dilution
Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2)Biolegend301806Use 1:20 dilution
Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7)BD Biosciences347543Use 1:5 dilution
Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2))BD Biosciences551336Use 1:20 dilution
Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2)Biolegend306609Use 1:50 dilution
Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581)Biolegend343514Use 1:20 dilution
Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2)Biolegend303506Use 1:20 dilution
Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1)Biolegend300405Use 1:20 dilution
Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8)Biolegend303720Use 1:20 dilution
Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100)Biolegend304126Use 1:20 dilution
Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5)Biolegend305116Use 1:20 dilution
Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7)Biolegend343103Use 1:20 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher ScientificBP231-100Filter sterilize before use
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine Gibco12100046Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media  with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin 
Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivatedOmega ScientificFB-22 Lot #609716
Human CD34 microbead kit Miltenyi biotech130-046-702
Human Thrombopoietin (TPO), research gradeMiltenyi biotech130-094-011Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium
L-GlutamineOmega ScientificGS-602 mM concentration in stimulation medium
LS ColumnsMiltenyi biotech130-042-401
MACS Multi standMiltenyi biotech130-042-303
MidiMACS magnetic separatorMiltenyi biotech130-042-302
MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS)GE Healthcare Biosciences17-1440-03
MS-5 cellsGift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. 
Penicillin & StreptomycinSigma-AldrichP4458-100ml
Poly-L lysineSigma-AldrichP2636Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS
Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α)BioBasicRC213-15Make a stock of 2,000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation
Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin)Takara T100BUse 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs.
Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L)BioBasicRC214-16Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium
Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3)BioBasicRC212-14Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium
Recombinant human stem cell factor (rHu SCF)BioBasicRC213-12Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium
Serum free medium (X-Vivo-15)Lonza 04-418Q
Sodium bicarbonateFisher ScientificBP328-500
Wright-Giemsa stain, modifiedSigma-AldrichWG16-500Use according to manufacturer's instructions
Equipment 
BD LSR II flow cytometerBD Biosciences
CentrifugeSorvall Legend RT
Light microscopeOlympus

Referencias

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