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  • Résumé
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  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour la caractérisation immunophenotypic et la différenciation induite par cytokine du sang de cordon dérivé CD34- cellules hématopoïétiques de tige et progénitrice aux quatre lignées myéloïdes. Les applications de ce protocole comprennent des études sur l'effet des mutations de la maladie myéloïde ou de petites molécules sur la différenciation myéloïde descellules CD34.

Résumé

La différenciation ex vivo des cellules souches hématopoïétiques humaines est un modèle largement utilisé pour étudier l'hématopoiesis. Le protocole décrit ici est pour la différenciation induite par cytokine des cellules de tige et d'progéniture de CD34- hématopoïétique aux quatre cellules myéloïdes de lignée. Lescellules CD34 sont isolées du sang de cordon ombilical humain et co-cultivées avec des cellules stromales MS-5 en présence de cytokines. La caractérisation immunophénotypique des cellules souches et progénitrices, et des cellules de lignée myéloïdes différenciées sont décrites. À l'aide de ce protocole, lescellules CD34 peuvent être incubées avec de petites molécules ou transduisantes avec des lentivirus pour exprimer des mutations de la myéloïde pour étudier leur impact sur la différenciation myéloïde.

Introduction

La différenciation normale des cellules souches hématopoïétiques (HSC) est essentielle pour le maintien des niveaux physiologiques de toutes les lignées de cellules sanguines. Au cours de la différenciation, dans une réponse coordonnée aux indices extracellulaires, y compris les facteurs de croissance et les cytokines, les HSC donnent d'abord lieu à des cellules progénitrices multipotentes (MPP) qui ont un potentiel lympho-myéloïde1,2,3 ,4 (Figure 1). Les MPP donnent lieu à des progéniteurs myéloïdes communs (PMC) et à des progéniteurs lymphoïdes communs (CLP) qui sont limités par la lignée. Les CLP se différencient en lignées lymphoïdes composées de cellules tueuses B, T et naturelles. Les CmP génèrent les lignées myéloïdes à travers deux populations d'ancêtres plus restreintes, les progéniteurs d'érythroïdes mégacaryocytes (MEPs) et les progéniteurs de monocytes granulocytes (GMP). Les députés donnent lieu à des mégacaryocytes et des érythrocytes, tandis que les GMP donnent lieu à des granulocytes et des monocytes. En plus de surgir par le biais des PMC, les mégacaryocytes ont été signalés pour provenir directement de HSCs ou premiers MPP par des voies non-canoniques5,6.

Les cellules hématopoïétiques de tige et d'ancêtre (HSPc) sont caractérisées par le marqueur de surface CD34 et l'absence de marqueurs spécifiques de lignée (Lin-). D'autres marqueurs de surface couramment utilisés pour distinguer les HSC et les populations d'ancêtres myéloïdes comprennent CD38, CD45RA et CD1232 (figure 1). Les HSC et les MPP sont Lin-/CD34-/CD38- et Lin-/CD34etCD38 , respectivement. Les populations d'ancêtres myéloïdes se distinguent par la présence ou l'absence de CD45RA et de CD123. Les CMP sont Lin-/CD34-/CD38/CD45RA-/CD123lo, les GmP sont Lin-/CD34-/CD38-/CD45RA-/CD123lo, et les députés sont Lin-/CD34 /CD38/CD45RA-/CD123-.

La population totale de cellules souches et progénitrices CD34 peut être obtenue à partir du sang de cordon ombilical humain (UCB), de la moelle osseuse et du sang périphérique. CD34- les cellules constituent 0,02% à 1,46% du total des cellules mononucléaires (MNC) dans l'UCB humain, tandis que leur pourcentage varie entre 0,5% et 5,3% dans la moelle osseuse et est beaucoup plus faible à 0,01% dans le sang périphérique7,8,9 . La capacité de prolifération et le potentiel de différenciation descellules CD34 dérivées de l'UCB sont significativement plus élevés que ceux de la moelle osseuse ou des cellules sanguines périphériques1,10, offrant ainsi un avantage distinct pour l'obtention matériel suffisant pour des analyses moléculaires en combination avec la caractérisation immunophenotypic et morphologique exécutante des cellules pendant la différenciation.

La différenciation ex vivo du sang de cordon ombilical dérivé CD34- HSPCs est un modèle largement appliqué pour étudier l'hématopoiesis normal et les mécanismes de la maladie hématopoïétique. Lorsqu'ils sont cultivés avec les cytokines appropriées, les UCB CD34et HSPC peuvent être induits à se différencier le long des lignées myéloïdes ou lymphoïdes11,12,13,14,15 , 16. Ici, nous décrivons des protocoles pour l'isolement et la caractérisation immunophénotypique des CD34- HSPc de l'UCB humain, et pour leur différenciation aux cellules de lignée myéloïdes. Ce système de culture est basé sur la différenciation induite par la cytokine des HSPC en présence de cellules stromales MS-5 pour imiter le microenvironnement dans la moelle osseuse. Les conditions de culture provoquent une expansion initiale descellules CD34, suivies de leur différenciation aux cellules qui expriment des marqueurs pour les quatre cellules de lignée myéloïde, à savoir les granulocytes (CD66b), les monocytes (CD14), les mégacaryocytes (CD41), et érythrocytes (CD235a). Les applications du protocole de différenciationdes cellules CD34 comprennent des études sur les mécanismes moléculaires régulant l'hématopoiesis, et des études de l'impact des mutations associées à la myéloïde et des petites molécules sur l'auto-renouvellement et différenciation des HSPC.

Protocole

Le sang de cordon ombilical humain pour l'expérimentation a été donné par des individus en bonne santé après consentement éclairé aux systèmes intégrés de santé de Maricopa (MIHS), Phoenix. Les unités identifiées ont été obtenues dans le cadre d'un accord de transfert de matériel entre le MIHS et l'Université de l'Arizona.

1. Réactifs et tampons

REMARQUE: Préparer tous les réactifs et tampons dans des conditions stériles dans un coffret de sécurité biologique.

  1. Préparer le tampon stérile PBS-BSA-EDTA (PBE) en ajoutant 7,2 ml d'albumine stérile à 35 % de sérum bovin (BSA; utilisation de la culture stérile des tissus de qualité 35 % BSA) et 5 mL de téthylène téthylène tétra acétique ténu tétra tétra tétra técétique stérile (EDTA) à 487,8 mL de phosphate stérile saline (DPBS). Filtrer la stérilisation et dégazer le tampon en laissant le filtre attaché à l'aspirateur dans un coffret de sécurité biologique pendant au moins 2 h. Aliquot le tampon dégazé en plus petits volumes (250 ml) et le stocker à 4 oC.
  2. Préparer 1x Hanks solution de sel équilibré (1x HBSS). Diluer 100 ml de 10x HBSS stock dans 900 ml d'eau distillée stérile pour faire 1 L de 1x HBSS et ajuster le pH à 7,2. Filtrer stériliser le 1x HBSS avant utilisation.
  3. Préparer une solution d'acide acétique de 2 % en ajoutant 2 ml d'acide acétique glaciaire à 98 ml d'eau distillée.
  4. Préparer 20 ng/mL recombinant e solution de fragment de fibronectin humain dans 1x PBS. Faire 10 ml par assiette de 48 puits.
  5. Préparer 2% BSA. À 100 ml 1x PBS, ajouter 2 grammes de fraction BSA V. Filtrer stériliser avant utilisation.
  6. Faites compléter le milieu d'aigle modifié (DMEM) de Dulbecco en ajoutant la poudre de DMEM, 3,7 gm de bicarbonate de sodium, 100 ml de sérum bovin fœtal (FBS) et 5 mL de pénicilline-streptomycine (PS) à 800 mL d'eau distillée stérile. Mélanger et faire le volume à 1 L, et filtrer stériliser avant utilisation.
  7. Préparer le milieu de congélation en mélangeant 90 ml de FBS et 10 ml de sulfoxide de diméthyle stérile (DMSO).
  8. Préparer le milieu de stimulation. Pour le milieu sans sérum, ajouter la L-glutamine à 2 mm, et les cytokines à une concentration finale de 50 ng/mL pour le facteur de cellules souches (SCF), la thrombopoiétine (TPO), et la tyrosine de type Fms kinase 3 ligand (Flt3L), et 20 ng/mL pour l'interleukine-3 (IL3) (voir tableau des matériaux pour la préparation des solutions de stock de cytokine). Faire 5 ml par assiette de 48 puits.
  9. Préparer 1x milieu de différenciation myéloïde. Pour compléter le DMEM, ajouter les cytokines à une concentration finale de 5 ng/mL pour le SCF, le Flt3L et l'IL3, 50 ng/mL pour le TPO et 4 unités/mL pour l'érythropoïétine (EPO). Faire 5 ml par assiette de 48 puits.
  10. Préparer 2x milieu de différenciation myéloïde. Pour compléter dMEM, ajouter des cytokines à une concentration finale de 10 ng/mL pour SCF, Flt3L et IL3, 100 ng/mL pour TPO, et 8 unités/mL pour l'OEB. Faire 5 ml par assiette de 48 puits.
  11. Préparer le tampon de cytométrie de flux. À 1 L de 1x PBS, ajouter 10 g de fraction BSA V.
  12. Préparer 1% de paraformaldéhyde en 1x PBS (voir Tableau des matériaux pour plus de détails).
  13. Préparer la solution poly-L-lysine en ajoutant 500 l de 10 mg/mL de poly-lysine à 49,5 ml de 1x PBS.

2. Isolement des cellules mononucléaires du sang de cordon ombilical

REMARQUE: Pour le protocole décrit ci-dessous, des volumes de sang de cordon de 90 à 100 ml ont été utilisés. L'isolement descellules CD34 doit être effectué dans des conditions stériles dans un coffret de sécurité biologique.

  1. Vaporiser le sac contenant de l'UCB avec 70 % d'éthanol pour stériliser la surface extérieure avant de l'introduire dans l'armoire de sécurité biologique. Transférer l'UCB dans une bouteille en plastique stérile de 250 ml et la diluer 1:1 en ajoutant un volume égal de température ambiante (RT) 1x HBSS.
  2. Distribuer 15 ml de milieu de fractionnement MNC (MFM; voir Tableau des matériaux) par tube en environ six tubes coniques stériles de 50 ml. Inclinez le tube avec MFM, et versez doucement 30 mL d'UCB dilué sur la couche MFM sans le déranger.
  3. Centrifugeles les tubes à 400 x g pendant 30 min à RT avec une accélération lente et sans frein.
  4. Après centrifugation, aspirez entre 15-20 ml du plasma au-dessus de la couche MNC. Recueillir délicatement les MNC à l'eau avec une pipette et transférer dans un nouveau tube conique de 50 ml.
    REMARQUE: Les MNC se déposent sous forme de couche blanche à l'interface du plasma et de la MFM, et des sédiments des globules rouges (RBC) au fond du tube conique.
  5. Piscine MNCs recueillies à partir de 2-3 tubes ensemble. Faire le volume de chaque tube à 50 ml avec tampon PBE froid.
  6. Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 10 min à 4 oC, avec le frein à feu doux.
  7. Aspirer le supernatant et appuyez doucement sur le tube pour desserrer la pastille cellulaire.
  8. Suspendre à nouveau les cellules granulées dans 5 ml de tampon de Glace pBE froide. Utilisez les mêmes 5 ml de cellules re-suspendues pour recueillir les cellules d'autres tubes. Mélanger les cellules de 3 à 4 tubes ensemble dans un tube conique de 50 ml.
  9. Pour recueillir les cellules restantes, lavez tous les tubes avec 5 ml de tampon pBE froid et ajoutez au tube conique de 50 ml.
  10. Comptez les MNC en diluant 10 ll de suspension cellulaire dans une solution d'acide acétique de 490 l.
    REMARQUE: L'acide acétique lyse les RBC contaminants pour faciliter le comptage des MNC.
  11. Faire le volume de la suspension cellulaire à 50 ml avec tampon PBE glacé. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 10 min à 4 oC, avec frein à basse température.
    REMARQUE: La suspension MNC peut être traitée immédiatement pour l'isolement des cellules CD34ou congelée pour des applications ultérieures.
  12. Pour congeler les MNC, retirer le supernatant et le suspendre à une densité de 2 x 107 cellules/mL dans le milieu de congélation à RT.
  13. Congeler les cellules à -80 oC pendant la nuit dans un récipient de congélation cellulaire, puis les transférer dans de l'azote liquide.

3. Isolement des Cellules CD34des cellules mononucléaires

  1. Si vous utilisez des MNC fraîchement isolés, passez directement à l'étape 3.3.
  2. Si vous utilisez des mNC congelés, décongelez rapidement les cellules congelées dans un bain d'eau de 37 oC et transférez-les dans un tube conique de 50 ml. Recueillir les cellules restantes dans les flacons avec 1 ml de tampon de PBE glacé et transférer dans le tube conique de 50 ml.
  3. Faire le volume de la suspension MNC à 50 ml avec tampon PBE froid et centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min à 4 oC.
  4. Retirez le supernatant et appuyez doucement sur le tube pour desserrer la pastille cellulaire. Resuspendre les MNC à 1 x 108 cellules dans 300 lde de tampon de PBE glacé.
  5. Ajoutez 100 l de réagent de blocage FcR du kit humain de microbilles CD34 de tri de cellules activées magnétiquement (MACS) pour 1 x 108 MNC et mélangez doucement.
    REMARQUE: Cela bloque la liaison non spécifique aux microbilles CD34.
  6. Ajouter 100 L des microbilles CD34 pour 1 x 108 cellules. Mélanger délicatement et incuber à 4 oC pendant 30 min au réfrigérateur. Ne pas couver sur la glace.
  7. Pendant que les cellules couvent, placez une colonne LS et un filtre de pré-séparation dans le champ magnétique du séparateur MACS. Équilibrez la colonne avec un tampon PBE glacé en ajoutant 2 ml directement dans la colonne et 1 ml dans le filtre de pré-séparation. Laisser la colonne se vider dans un tube conique de 15 ml et jeter le flux à travers.
  8. Retirer les MNC de 4 oC, ajouter un tampon PBE glacé pour compenser le volume à 15 ml, et centrifuger les cellules à 300 x g pendant 10 min à 4 oC, avec le frein à basse température.
  9. Aspirer le supernatant et re-suspendre les cellules dans 1 ml de tampon de PBE glacé.
  10. Ajoutez la suspension cellulaire au filtre de pré-séparation placé sur la colonne LS.
    REMARQUE: Le filtre de pré-séparation supprime les agrégats cellulaires volumineux qui peuvent bloquer la colonne.
  11. Rincer le tube avec 3 ml de tampon PBE glacé et l'ajouter au filtre de pré-séparation placé sur la colonne LS. Après cela, jetez le filtre de pré-séparation.
  12. Laver la colonne LS quatre fois en ajoutant 3 ml de tampon PBE glacé, ce qui permet à la colonne de s'écouler à chaque fois.
    REMARQUE: Lescellules CD34 resteront liées à la colonne et les cellules non étiquetées circuleront à travers la colonne.
  13. Après le lavage final, retirez la colonne du champ magnétique séparateur MACS et placez-la dans un nouveau tube conique de 15 ml, loin de l'aimant.
  14. Ajouter un tampon PBE glacé de 5 ml à la colonne et expulser les cellules CD34 reliées en poussant fermement dans le piston.
  15. En option, passez les cellules CD34et isolées de la première colonne sur une autre colonne LS avec le filtre de pré-séparation tel que décrit ci-dessus (étapes 3.10-3.13).
  16. Comptez les cellules isolées cD34avec le bleu trypan (10 l de cellules et 10 l de bleu trypan) pour déterminer le nombre total de cellules vivantes.
    REMARQUE: À ce stade, les cellules isolées CD34peuvent être congelées pour une utilisation ultérieure ou peuvent être traitées directement pour l'analyse des HSPC par cytométrie de débit (section 4) ou pour la différenciation des cellules de lignée myéloïde (section 5).
  17. Centrifugelant la suspension cellulaire à 600 x g pendant 5 min à RT, avec frein à basse.
  18. Pour congeler les cellules CD34, aspirer le supernatant et suspendre à nouveau jusqu'à 5 x 106 cellules dans 1 ml de milieu de congélation et congeler comme décrit ci-dessus (étape 2.13). Dans le cas contraire, passez à l'article 4 ou 5.

4. Détermination des populations de tiges et d'ancêtres par cytométrie des flux

  1. Pour déterminer les fractions des populations de tiges et d'ancêtres dans les CD34fraîchement isolés, les centrifuger à 600 x g pendant 5 min et suspendre à nouveau 1 x 106 cellules dans 50 L de tampon de cytométrie d'écoulement.
  2. À 1 x 106 cellules CD34, ajoutez des anticorps (voir Tableau des matériaux pour les dilutions) aux marqueurs de lignée (CD3, CD7, CD10, CD11b, CD19 et CD235a — tous étiquetés FITC), CD34 (APC-Cy7), CD38 (PE), CD45RA (PE-Cy7), CD123 (APC) et 7- aminoactinomycine D (7-AAD; comme tache vivante/morte) et composent le volume total à 100 L. Incubate sur la glace dans l'obscurité pendant 20 min.
    REMARQUE: Moins de 1 x 106 cellules CD34 peuvent être utilisées pour l'analyse. Si la coloration de moins de cellules, le volume total et le volume d'anticorps ajoutés doivent être réduits en conséquence. Pour l'analyse de cytométrie du débit, les MNC non tachés et teints ne devraient pas être utilisés comme contrôles pour fixer des barrières positives et négatives pour chaque fluorophore.
  3. Après l'incubation, laver les cellules avec 1 ml de tampon de cytométrie d'écoulement et centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min.
  4. Optionnellement, fixer les cellules tachées dans 0.5 ml de solution de paraformaldehyde de 1% pendant 10 min dans l'obscurité à RT.
  5. Centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min et aspirez le supernatant.
  6. Laver les cellules fixes/tachées avec 1 ml de tampon de cytométrie d'écoulement et centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min à 4 oC.
  7. Aspirer le supernatant, re-suspendre les cellules dans 500 'L de tampon de cytométrie de flux, et d'analyser par un cytomètre de flux (Tableau des matériaux).

5. Différenciation myéloïde des cellules de tige et de progéniture de CD34

REMARQUE: Pour différencier les CD34et HSPC aux cellules de lignée myéloïde, ils sont d'abord stimulés dans des plaques recombinantes de fibronectin humain enduites, puis ensemiés sur une couche de cellules stromales MS-5 dans le milieu de différenciation myéloïde. La différenciation peut être surveillée chaque semaine pendant 3 semaines en fonction de l'expression des marqueurs de surface cellulaire spécifiques aux quatre lignées myéloïdes. Pendant la stimulation et la différenciation, toutes les incubations sont effectuées à 37 oC et 5 % de CO2 dans une chambre humidifiée. Toutes les étapes doivent être effectuées dans un coffret de sécurité biologique.

  1. Enrober les puits d'une plaque stérile non couchée de 48 puits en ajoutant 200 L/puits de solution de fibronectin humain recombinant dans 1x PBS pour 2 h à RT.
  2. Après 2 h, retirer soigneusement la solution de fibronectin humain recombinant e et jeter.
  3. Bloquer les puits avec 200 l/puits de 2% BSA pendant 30 min à RT.
  4. Aspirez la solution BSA et lavez les puits deux fois avec 500 l de 1x PBS stérile.
    REMARQUE: Les plaques enduites de fragments de fibronectin peuvent être stockées à 4 oC pendant une température pouvant aller jusqu'à 2 semaines.
  5. Pour stimuler les CD34et hSPc, suspendez à nouveau les cellules fraîchement isolées (à partir de l'étape 3.17) à une densité de 1 x 105 cellules/200 l ou 5 x 105 cellules/mL de milieu de stimulation chaud de 1x.
  6. Si vous utilisez des cellules CD34et CD34 congelées, dégelez rapidement et transférez les cellules dans un tube conique de 15 ml contenant du DMEM complet chaud. Centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min et re-suspendre les cellules comme décrit à l'étape 5.5.
  7. Plaque 200 l de la suspension de cellules CD34par puits du fragment de fibronectin enduit 48 puits et incuber pendant 48 h.
  8. Le lendemain, les graines de 15 000 cellules stromales MS-5 dans 200 L de DMEM complet par puits d'une plaque traitée par la culture tissulaire de 48 puits et incitaient à 37 oC pendant 24 h.
  9. Après 48 h de stimulation, collectez les cellules CD34par pipetage doux. Laver les puits avec 500 l de DMEM chaud et la piscine avec la suspension cellulaire.
  10. Comptez les cellules avec le bleu trypan. Centrifugelant la suspension à 600 x g pendant 5 min et suspendez à une densité de 5 000 cellules/200 l de 1 x milieu de différenciation myéloïde.
  11. À partir de la plaque de culture tissulaire de 48 puits ensemait de cellules stromales MS-5, aspirez doucement le milieu sans déranger les cellules. Couche de 200 l (5 000 cellules) de la suspensioncellulaire CD34 par puits de la plaque et incuber à 37 oC.
    REMARQUE: La culture des cellules MS-5 peut être maintenue dans le DMEM complet. Le jour où lescellules CD34 sont ensemencées, les cellules MS-5 doivent être en couche uniforme (80-90% de confluence). Il est recommandé que les cellules MS-5 soient plaquées au moins 24 heures avant l'ensemencement descellules CD34.  Si les cellules MS-5 doivent être plaquées 48 h ou 72 h avant d'ensemencer les cellules CD34, la densité cellulaire doit être ajustée en conséquence. Il est également recommandé de laisser les puits périphériques de la plaque de 48 puits vides ou remplis de 200 l d'eau stérile afin d'éviter les effets de bord.
  12. Effectuer un changement de demi-moyen tous les 3 à 4 jours en enlevant doucement 100 l du milieu du haut de chaque puits et en le remplaçant par 100 l de 2x milieu de différenciation myéloïde par puits.
  13. Le jour 21, récoltez les cellules pour l'analyse de l'expression de marqueur de lignée myéloïde par cytométrie de flux. Sans perturber la couche MS-5, pipette doucement le milieu et transférer les cellules à un tube de 5 ml.
    REMARQUE: Pour l'analyse de la cytométrie de coloration et d'écoulement, les cellules de 1-2 puits sont suffisantes. La différenciation peut également être surveillée les jours 1, 7 et 14. Si vous effectuez l'immunophénotypage sur plusieurs jours, le nombre de puits nécessaires à l'analyse doit être calculé en conséquence.
  14. Tainer 5 x 105 cellules avec des anticorps à CD34 (APC-Cy7), CD66b (PE-Cy7), CD14 (PE), CD41 (PerCP-Cy5.5), et CD235a (APC) dans un volume total de 50 'L. Incubate sur la glace dans l'obscurité pendant 20 min. Inclure mNCs non tachés et unique souillé comme pour les contrôles portes positives et négatives pour chaque fluorophore, et 7-AAD comme une tache vivante /morte pour éliminer les cellules mortes de l'analyse.
  15. Laver et fixer (facultatif) les cellules tachées telles que décrites ci-dessus (étapes 4.3-4.6).
  16. Re-suspendre les cellules dans 500 'L de tampon de cytométrie de flux et d'analyser par un cytomètre de flux.

6. Évaluation de la morphologie cellulaire

  1. Nettoyez les lames de microscope en pulvérisant de l'éthanol et en essuyant jusqu'à ce qu'ils grincent.
  2. Immerger les lames propres dans la solution poly-L-lysine pendant 5 min à RT et sécher pendant 1 h à RT.
  3. Resuspendre les HSPC de l'étape 3.14 et les cellules différenciées de l'étape 5.13 dans 10 'L de tampon de cytométrie de flux.
  4. Transférer la suspension cellulaire sur les lames enduites et les laisser sécher à l'air.
    REMARQUE: Les diapositives du jour 1 et du jour 21 peuvent être stockées à RT et tachées simultanément.
  5. Verser 0,5 ml de la tache Wright-Giemsa sur la glissière et laisser reposer pendant 3 min à RT.
  6. Ajouter un volume égal d'eau déionisée et laisser reposer 10 min de plus à RT.
  7. Laver la glissière dans de l'eau déionisée.
  8. Visualisez les cellules tachées à un grossissement de 60x ou 100x par un microscope.

Résultats

L'application des protocoles ci-dessus donne 5,6 (0,5) x 108 MNC et 1 (0,3) x 106 CD34cellules à partir d'une unité de sang de cordon de 100 ml. Le pourcentage total de CD34et de cellules varie entre 80 et 90 % (figure2A,B). L'analyse immunophénotypique du schéma décrit par Manz et al.5 démontre que les cellules CD34-se composent généralement de 20 % de HSC et de MPP de 72 % qui sont Lin

Discussion

Le protocole décrit ici convient à la différenciation ex vivo des CD34 cD34 dérivés de l'UCBet des HSPC aux quatre lignées myéloïdes. L'incubation initiale avec un mélange de cytokine composé de SCF, TPO, Flt3L et IL3 stimule lescellules CD34. Par la suite, la différenciation est réalisée avec un cocktail de SCF, IL3, Flt3L, EPO et TPO. Dans ce mélange, SCF, IL3, et Flt3L sont importants pour la survie et la prolifération des CD34- HSCs. EPO et TPO favorisent la différenci...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les auteurs tient à remercier Wendy Barrett, Rachel Caballero et Gabriella Ruiz de Maricopa Integrated Health Systems pour les unités de sang de cordon désitruré et données, Mrinalini Kala pour l'aide à la cytométrie du débit, et Gay Crooks et Christopher Seet pour conseils sur la différenciation myéloïde ex vivo. Ce travail a été soutenu par des fonds à S.S. des National Institutes of Health (R21CA170786 et R01GM127464) et de l'American Cancer Society (la Subvention de recherche institutionnelle 74-001-34-IRG). Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.4% Trypan blue solutionThermo Fisher Scientific15250-061Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS
0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0Gibco 15575-038
10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Invitrogen14185052Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2
2.5% Trypsin, no phenol redThermo Fisher Scientific15090046Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS
30 µm Pre-separation filtersMiltenyi biotech130-041-407
35% sterile Bovine serum albuminSigma-AldrichA7979
7-AADBiolegend420404Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis
Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a)Biolegend312207Use 1:20 dilution
Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5)Biolegend301403Use 1:5 dilution
Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6)Biolegend306012Use 1:20 dilution
Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2)Biolegend301806Use 1:20 dilution
Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7)BD Biosciences347543Use 1:5 dilution
Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2))BD Biosciences551336Use 1:20 dilution
Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2)Biolegend306609Use 1:50 dilution
Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581)Biolegend343514Use 1:20 dilution
Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2)Biolegend303506Use 1:20 dilution
Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1)Biolegend300405Use 1:20 dilution
Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8)Biolegend303720Use 1:20 dilution
Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100)Biolegend304126Use 1:20 dilution
Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5)Biolegend305116Use 1:20 dilution
Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7)Biolegend343103Use 1:20 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher ScientificBP231-100Filter sterilize before use
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine Gibco12100046Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media  with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin 
Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivatedOmega ScientificFB-22 Lot #609716
Human CD34 microbead kit Miltenyi biotech130-046-702
Human Thrombopoietin (TPO), research gradeMiltenyi biotech130-094-011Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium
L-GlutamineOmega ScientificGS-602 mM concentration in stimulation medium
LS ColumnsMiltenyi biotech130-042-401
MACS Multi standMiltenyi biotech130-042-303
MidiMACS magnetic separatorMiltenyi biotech130-042-302
MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS)GE Healthcare Biosciences17-1440-03
MS-5 cellsGift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. 
Penicillin & StreptomycinSigma-AldrichP4458-100ml
Poly-L lysineSigma-AldrichP2636Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS
Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α)BioBasicRC213-15Make a stock of 2,000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation
Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin)Takara T100BUse 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs.
Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L)BioBasicRC214-16Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium
Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3)BioBasicRC212-14Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium
Recombinant human stem cell factor (rHu SCF)BioBasicRC213-12Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium
Serum free medium (X-Vivo-15)Lonza 04-418Q
Sodium bicarbonateFisher ScientificBP328-500
Wright-Giemsa stain, modifiedSigma-AldrichWG16-500Use according to manufacturer's instructions
Equipment 
BD LSR II flow cytometerBD Biosciences
CentrifugeSorvall Legend RT
Light microscopeOlympus

Références

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