التصوير داخل الظهارة من الخلايا الليمفاوية داخل الظهارة في الميورين الأمعاء الدقيقة

Summary

نحن نوصف طريقة لتصور GFP المسمى + IELs باستخدام التصوير داخل vital من الأمعاء الدقيقة مورين عن طريق عكس الغزل القرص المجهر confocal. هذه التقنية تمكن من تتبع الخلايا الحية داخل الغشاء المخاطي لمدة تصل إلى 4 ح ويمكن استخدامها للتحقيق في مجموعة متنوعة من التفاعلات المعوية المناعية الظهارية.

Abstract

الخلايا الليمفاوية داخل الظهارية التي تعبر عن مستقبلات الخلايا التّية (γ δ IEL) تلعب دوراً رئيسياً في المراقبة المناعية للظهارة المعوية. ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود ليجاننهائي لمستقبلات الخلية T γδ, فهمنا لتنظيم التنشيط iEL γδ ووظيفتها في الجسم الحي لا يزال محدودا. وهذا يتطلب وضع استراتيجيات بديلة لاستجواب مسارات الإشارة التي تنطوي على تنظيم وظيفة IEL δ ومدى استجابة هذه الخلايا للبيئة الدقيقة المحلية. على الرغم من أن الـ IELs من المفهوم على نطاق واسع للحد من نقل الممرض، فإن استخدام التصوير داخل الفيتال كان حاسماً لفهم الديناميات المكانية المكانية للتفاعلات الظهارية IEL/في حالة ثابتة واستجابة لمسببات الأمراض الغازية. هنا، نقدم بروتوكولا لتصور سلوك الهجرة IEL في الغشاء المخاطي المعوي ة من الماوس مراسل الخلية ت gfp باستخدام مقلوب الغزل القرص cofocal الليزر المجهري. على الرغم من أن عمق التصوير الأقصى لهذا النهج محدود بالنسبة لاستخدام المجهر المسح الضوئي بالليزر اثنين من الفوتونات، والغزل القرص مجهر الليزر البؤري يوفر ميزة الحصول على صورة عالية السرعة مع انخفاض photobleaching و الصورة الضرر. باستخدام برنامج تحليل الصور 4D، يمكن تحليل سلوك مراقبة الخلايا T وتفاعلاتها مع الخلايا المجاورة بعد التلاعب التجريبي لتوفير نظرة ثاقبة إضافية في تفعيل IEL ووظيفة داخل الغشاء المخاطي المعوي.

Introduction

توجد الخلايا اللمفاوية داخل الظهارة داخل الظهارة المعوية، وتوجد على طول غشاء الطابق السفلي وبين الخلايا الظهارية المجاورة في الفضاء الجانبي بين الخلايا¹. هناك تقريبا واحد IEL لكل 5-10 خلايا الظهارية; هذه العبوات اللي ة كحراس لتوفير المراقبة المناعية للامتداد الكبير للحاجز الظهاري المعوي². تشكل الـ IELs التي تعبر عن مستقبلات الخلايا t (TCR) ما يصل إلى 60% من إجمالي عدد السكان في الأمعاء الدقيقة في المورين. الدراسات في الفئران التي تعاني من نقص الخلايا التائية تتثبت من دور وقائي لهذه الخلايا استجابة لإصابة الأمعاء والتهاب والعدوى^3,4,5. على الرغم من جيل من Tcrd خروج المغلوب الماوس⁶, فهمنا لالبيولوجيا IEL γδ لا يزال محدودا ويرجع ذلك جزئيا إلى حقيقة أن الليجانس المعترف بها من قبل tcr γδ لم يتم تحديدها بعد⁷. ونتيجة لذلك، فإن عدم وجود أدوات لدراسة هذه الخلايا السكان جعلت من الصعب التحقيق في دور تنشيط ووظيفة tCR γδ في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية. لسد هذه الفجوة، قمنا بتطوير تقنيات التصوير الحي لتصور سلوك الهجرة IEL δ δ والتفاعلات مع الخلايا المعوية المجاورة كوسيلة لتوفير نظرة إضافية على وظيفة IEL والقدرة على الاستجابة للمحفزات الخارجية في الجسم الحي.

على مدى العقد الماضي، وسعت التصوير داخل الحيوية بشكل كبير فهمنا للأحداث الجزيئية التي تنطوي على جوانب متعددةمن البيولوجيا المعوية، بما في ذلك الخلايا الظهارية سفك 8، وتنظيم وظيفة الحاجز الظهاري^{9 ،10،}عينة الخلية النقوي من المحتويات المضيئة^11،12، وتفاعلات المضيف ميكروب^{11،13،14،15،16} . في سياق علم الأحياء IEL، وقد ألقى استخدام المجهر داخل الفيتال الضوء على ديناميات المكانية الصدغية من الحركة IEL والعوامل التي تتوسط سلوك المراقبة^{13،14،15، 16}. تطور TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP) مراسل الفئران, الذي تسميات + IELs من قبل التعبير النووي GFP¹⁷, كشفت أن المحطات المثيلة هي motile عالية داخل ظهارة ومعرض سلوك مراقبة فريدة من نوعها التي تستجيب للميكروبات العدوى^17,13,14. في الآونة الأخيرة، تم تطوير آخر ماوس مراسل الخلية t γδ (Tcrd-GDL) الذي يعبر عن GFP في السيتوبلازم للسماح تصور الخلية بأكملها¹⁸. وقد استخدمت منهجية مماثلة للتحقيق في متطلبات مستقبلات كيميائية محددة، مثل مستقبلات G البروتين مقرونة (GPCR)-18 و -55، على ديناميات الحركة IEL^19،20. في غياب مراسل خلية محددة، استخدمت الأجسام المضادة المترافقة الفلورسنت ضد CD8α لتصور وتتبع حركة IEL في الجسم الحي^19،20. على الرغم من أن المجهر المسح الضوئي بالليزر باثنين من الفوتونات يستخدم عادة في التصوير داخل الفيتال، فإن استخدام المجهر الليزري البؤري للقرص الدوار يوفر مزايا فريدة لالتقاط صور عالية السرعة وعالية الدقة متعددة القنوات مع الحد الأدنى من الضوضاء الخلفية. هذه التكنولوجيا مثالية لتوضيح الديناميات المكانية المكانية المكانية للتفاعلات المناعية/الظهارية داخل البيئة الدقيقة المعقدة للغشاء المخاطي المعوي. وعلاوة على ذلك، من خلال استخدام مختلف نماذج الماوس المعدلة وراثيا و / أو خروج المغلوب، وهذه الدراسات يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في التنظيم الجزيئي للمناعة المعوية و / أو وظيفة الخلية الظهارية.

Protocol

وقد أجريت جميع الدراسات في جمعية تقييم واعتماد مختبر رعاية الحيوانات (ALAC) المعتمدة منشأة وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها روتجرز نيو جيرسي كلية الطب الطب المقارن الموارد.

1. إعداد الماوس

ملاحظة: الإجراء التالي، بما في ذلك تحضير الحيوانات والجراحة، يستغرق 30-40 دقيقة قبل الجراحة، تشغيل المجهر وتسخين الحاضنة المغلقة على المجهر إلى 37 درجة مئوية.

1. إجراء تجارب على الفئران TcrdEGFP 8-10 أسابيع القديمة على خلفية C57BL/6، والتي تم الحصول عليها من برنارد ماليسن (INSERM، باريس، فرنسا). ووفقاً للإجراء المعتمد من قبل الاتحاد الدولي للقضاء على الفقدان، يقوم بالتخدير بواسطة حقن الكيتامين (120 ملغم/كغم) وإكسيلازين (10 ملغم/كغم) على أساس وزن الحيوان. تقييم مستوى التخدير عن طريق معدل التنفس (55-65 نفسا في الدقيقة الواحدة)²¹، وقرصة إصبع القدم وردود الفعل الشاحب.
2. بمجرد الوصول إلى التخدير بالطائرة الجراحية، قم بتأمين الساقين الخلفيتين للفأر باستخدام شريط إلى وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم، والتي يمكن رصدها بواسطة ميزان الحرارة المستقيم. إذا كانت هناك علامات على أن التخدير هو قبالة (على سبيل المثال، زيادة معدل التنفس، وامض و / أو العين العضلات الوخز استجابة لانعكاس بالببرال)، إعادة إدارة 50 ميكرولتر من الكيتامين / إكسيلازين في وقت واحد حتى يتم تخدير الماوس تماما.
3. إعداد الصبغة النووية عن طريق تخفيف 50 μL من Hoechst 33342 (10 ملغ / مل) مع 315 ميكرولتر من 0.9٪ المالحة; التركيز النهائي هو 37.5 ملغم/كغم على أساس وزن الماوس (200 ميكرولتر الحجم التقريبي). مرة واحدة يتم تخدير الماوس، وحقن ببطء Hoechst باستخدام حقنة درنة من خلال الجيوب الوريدية الرجعية المدارية.
   ملاحظة: انتظر 1-2 دقيقة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية للسماح للماوس بالتكيف مع التغير في حجم التداول بعد الحقن المداري الرجعية.
4. ضع كمية صغيرة من مواد التشحيم على العينين لمنعها من الجفاف.

2. جراحة الفأر: البطن لفضح الغشاء المخاطي المعوي

1. إجراء شق عمودي 2 سم من خلال الجلد والصفاق على طول خط الوسط من أسفل البطن لخارج منطقة الأمعاء ليتم تصويرها.
2. باستخدام ملقط الزاوية، وسحب بعناية cecum من تجويف الصفاوية وتحديد منطقة الأمعاء الدقيقة ليتم تصويرها. يجب الحرص على عدم تمزيق الأوعية الدموية المساريقية خلال هذه العملية. لتقليل الضرر أو النزيف المحتمل، تجنب الاستيلاء على الأمعاء أو معسر هابس هابس.
3. حدد منطقة ملائمة من الأمعاء الدقيقة (2-3 سم) للتصوير الذي يحتوي على أقل قدر من محتويات البراز. إعادة بعناية التجويف الدقيق والأمعاء الدقيقة المتبقية إلى تجويف الصفاون، مع ترك الجزء من الاهتمام خارجيا.
   ملاحظة: تجنب ثقب الأوعية الدموية أو تعطيل الأوعية الوعائية المساريقية خلال هذه الخطوة.
4. ضع زوجين من الملقط على جانبي الموضع الكامنة بين الأوعية الدموية، وفرك بلطف نصائح الملقط معا لخلق ثقب في الغشاء (الشكل1)²². وهذا سوف يسمح للإبرة لتمرير من خلال mesentery عند إغلاق تجويف الصفايا تحت الأمعاء.
5. أغلق الشق مع الحفاظ على حلقة الأمعاء الخارجية. باستخدام ملقط الزاوية ومنحنية، تفتق نقطة إبرة تعلق على خياطة 5 سم، واختراق جانب واحد من البصاق، انتقل من خلال ثقب المحرز في الخطوة السابقة، وحتى من خلال الجانب الآخر من بطانة البصاق. ضع خيطاً واحداً في الأعلى، وآخر بالقرب من الجزء السفلي من الشق.
   ملاحظة: تجنب الإضرار بالأوعية الدموية أثناء هذه الخطوة.
6. كرر هذه العملية لإغلاق الجلد تحت حلقة الأمعاء، عن طريق وضع خياطة واحدة في منتصف الشق، بين الغرز السابقة في البِاقَلة الكامنة.
   ملاحظة: من المهم فقط أن تُستبعد المنطقة التي يجب تصويرها؛ وهذا سوف يقلل من الحركة الدخيلة أثناء التصوير. تأكد من تجنب ربط قبالة الشرايين المساريقية.
7. استخدام الكواتيري الكهربائي لجعل خط من ثقب على طول الحدود المضادة للخط. مباشرة بعد الكي، وتطبيق بضع قطرات من الماء على سطح الأمعاء لمنع أضرار إضافية الأنسجة الناجمة عن الحرارة. قم بلط مُنَزَه بـ Kimwipe لإزالة الماء المتبقي.
8. قطع شق أفقي صغير على الحافة البعيدة للأنسجة الكيّة باستخدام مقص فاناس والمضي قدما في قطع طول الخط الكي نحو الطرف القريب من الجزء الخارجي من الأنسجة (حوالي 1.5 سم في الطول) لفضح الغشاء المخاطي السطح.
   ملاحظة: إذا لزم الأمر، استخدم الملقط لإزالة أي محتوى برازي زائد متبقي على السطح المخاطي المكشوف.
9. تغطية بطن الماوس مع Kimwipe رطبة لمنع الأنسجة من أن تصبح جافة. نقل الماوس إلى المجهر في وعاء مغطى.

3. الحصول على صورة بواسطة القرص الغزل كونبوكلوسكوبي

1. ماصيت 150 ميكرولتر من 1 ميكرومتر أليكسافلور 633 في HBSS على أغطية الزجاجأسفل من طبق 35 مم. وضع الماوس بحيث السطح المخاطي فتح يتصل مباشرة غطاء.
2. إمالة رأس المجهر مرة أخرى ووضع الماوس على طبق يغطي انزلق على مرحلة التصوير في حاضنة ما قبل تسخينها. بدلا من ذلك، وتغطي الماوس عن طريق بطانية التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم.
3. إطلاق برنامج التصوير. يجب ألا تتجاوز كثافة الإثارة ووقت التعرض لكل ليزر 10-15 مللي واط أو 120-150 مللي ثانية، على التوالي، لتجنب التبييض الضوئي ولتقليل الفاصل الزمني بين النقاط الزمنية. اضبط متوسط الإطار إلى "2" واضبط وظيفة كسب EM لتقليل الضوضاء في الخلفية. حدد المعايرة الموضوعية 63x لضمان القياس الصحيح لحجم البكسل.
   ملاحظة: الإعدادات المفصلة أعلاه تهدف إلى توفير مرجع أولي، ولكن سوف تختلف تبعاً لتكوينات المجهر الفردية.
4. باستخدام الليزر 405 نانومتر والهدف الجوي 20X، تصور النوى لتحديد موقع حقل من الزغب التي تفتقر إلى حركة ملحوظة أو الانجراف عن طريق العين. تجنب مناطق الحركة الارتبية بسبب التنفس أو التمعج أو ضربات القلب.
5. باستخدام المسح الضوئي XY، تسجيل إحداثيات XY من مجال الاهتمام والتبديل إلى الغمر الغليسي هدف 63X.
6. تأكد من أن الزغب في الحقل المحدد مستقر من خلال الحصول على صورة حية على قناة 405 نانومتر لمدة تصل إلى دقيقة واحدة.
7. أثناء الحصول على صورة حية على قناة 405 نانومتر، ضبط التركيز للعثور على الطائرة المتعامدة فقط تحت طرف متعرج. الحصول على Z-المكدسات بدءا من أسفل ظهارة طرف أسفل الفيلز حتى أنه من الصعب حل النوى، حوالي 15-20 ميكرون، وذلك باستخدام خطوة 1.5 ميكرومتر.
   ملاحظة: عند التصوير بثلاث قنوات (405، 488، 640 نانومتر) باستخدام أوقات التعرض المذكورة أعلاه، فمن الممكن الحصول على جميع القنوات الثلاث بالتتابع على فترات 20 ثانية تقريبا.
8. افتح البرنامج في وضع التحليل، 3-5 دقيقة بعد البدء في عملية الاستحواذ، لتأكيد استقرار الصورة وحركة iEL. استمر في الحصول على صور لمدة 30-60 دقيقة لكل حقل من حقول الزغب. سجل 2-3 حقول لكل ماوس. أثناء التصوير، راقب الماوس كل 5 دقائق.
   ملاحظة: إذا بدأ التخدير في التآكل، استخدم الملقط لقشر ةيبلطف عنق الفأر لتدبير 50 ميكرولتر من الكيتامين/الزيلازين في وقت واحد. استمر في مراقبة مستويات التخدير وإعادة إدارتها عند الضرورة.
9. ليس من المستحسن لتصوير ماوس واحد لفترة أطول من 4 ح. بمجرد اكتمال الحصول على صورة، التضحية الفئران عن طريق خلع عنق الرحم تليها استرواح الصدر الثنائية.

4. 4D تحليل الصور

1. استيراد ملفات الصور مباشرة إلى برامج التجسيد 4D.
2. إنشاء أسطح فردية لـ IELs والتجويف، ثم تتبع الأسطح مع مرور الوقت باستخدام المعلمات الموضحة في الجدول 1 كمرجع أولي. بالنسبة لـ IELs، قم بتمكين كائنات اللمس سبليت باستخدام قطر نقطة البذور المشار إليه.
3. استخدم خوارزمية التتبع التلقائي لتحديد حركة IEL. على الرغم من أن خوارزمية التتبع دقيقة نسبيا، فإنه من الضروري لفحص بصريا المسارات لكل IEL الفردية. إذا كان المسار غير صحيح، قم بتصحيحه باستخدام دالات قطع الاتصال والاتصال ضمن علامة التبويب تحرير المسارات.
4. لتحديد المسافة من كل IEL إلى التجويف، حدد سطح التجويف وقم بوظيفة تحويل المسافة ضمن قائمة الأدوات. عند المطالبة، حدد خارج Surface. بمجرد حساب، سيتم عرض تحويل المسافة كقناة 4.
5. قم بتصفية الحد الأدنى للقناة الرابعة لتحديد الـ iels γδ الموجودة في الفضاء الجانبي بين الخلايا (LIS). يجب أن تكون هذه القيمة قريبة من 15 ميكرومتر، استناداً إلى ارتفاع خلية عمودية ظهارية. يتم الإبلاغ عن النسبة المئوية لمجموع الـ iels في هذا النطاق كتردد لـ (Δ IELs) في LIS.
6. لمزيد من التحليل، تصدير البيانات الإحصائية بما في ذلك: IEL سرعة المسار، وتتبع النزوح، وتتبع الاستقامة وطول المسار. بدلاً من ذلك، تحليل البيانات باستخدام الوحدة النمطية Vantage. اعتمادا على التجربة، الحصول على مقاييس إضافية من البيانات المكتسبة، بما في ذلك وقت الإيذب في LIS أو IEL/التفاعلات الظهارية.

النتائج

باستخدام التصوير داخل الحيات من الفئران مراسل TcrdEGFP، وقد أظهرنا سابقا أن + Δ IELs يحمل سلوك مراقبة ديناميكية، التي تقوم بدوريات في ظهارة عن طريق الهجرة على طول غشاء الطابق السفلي وإلى الفضاء الجانبي بين الخلايا (LIS) في ثابت الدولة (الشكل 2, فيلم 1).

ويمكن ?...

Discussion

وقد أتاح تطوير تقنيات الفحص المجهري داخل الفيتال فرصة غير مسبوقة لمراقبة إعادة تنظيم الهياكل الفرعية^8و9و22و تفاعلات الخلية^{12، 25} وسلوك هجرة الخلية^{13،14،15...}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm dish, No. 1.5 Coverslip	MatTek	P35G-1.5-14-C
Alexa Fluor 633 Hydrazide	Invitrogen	A30634
BD PrecisionGlide Hypodermic needles - 27g	Thermo Fisher Scientific	14-826-48
BD Slip Tip Sterile Syringe - 1 ml	Thermo Fisher Scientific	14-823-434
BD Tuberculin Syringe	Thermo Fisher Scientific	14-829-9
Dissecting scissors	Thermo Fisher Scientific	08-940
Electrocautery	Thermo Fisher Scientific	50822501
Enclosed incubation chamber	OKOLAB		Microscope
Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length	Roboz	RS-7983-3
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	55037C
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules	Bitplane		Software
Inverted DMi8	Leica		Microscope
IQ3 (v. 3.6.3)	Andor		Software
Ketamine	Putney		Anesthesia
Kimwipes	VWR	21905-026
McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5X0.15mm Straight Sharp	Roboz	RS-5600
Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided	Fisher Scientific	NC0798934
Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2mm Tip	Roboz	RS-5228
Puralube Vet Ointment	Dechra		Lubricating Eye Ointment
Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser	Andor		Confocal system
Xylazine	Akorn		Anesthesia