Imaging intravitale dei linfociti intraettali a Murine Small Intestine

Riepilogo

Descriviamo un metodo per visualizzare gli IEL con etichettatura GFP utilizzando l'imaging intravitale dell'intestino piccolo murino mediante microscopia confocale del disco rotante invertita. Questa tecnica consente il monitoraggio delle cellule vive all'interno della mucosa fino a 4 h e può essere utilizzata per studiare una varietà di interazioni immuno-epiteliali intestinali.

Abstract

I linfociti intraeliali che esprimono il recettore delle cellule T (IEL) svolgono un ruolo chiave nella sorveglianza immunitaria dell'epitelio intestinale. A causa in parte della mancanza di un ligando definitivo per il recettore delle cellule T, la nostra comprensione della regolazione dell'attivazione di IEL e della loro funzione in vivo rimane limitata. Ciò richiede lo sviluppo di strategie alternative per interrogare i percorsi di segnalazione coinvolti nella regolazione della funzione IEL e la reattività di queste cellule al microambiente locale. Anche se gli IEL sono ampiamente compresi per limitare la traslocazione degli agenti patogeni, l'uso dell'imaging intravitale è stato fondamentale per comprendere le dinamiche spatiotemporali delle interazioni IEL/epiteliali a stato costante e in risposta a patogeni invasivi. Qui, presentiamo un protocollo per la visualizzazione del comportamento migratorio IEL nella piccola mucosa intestinale di un topo reporter del cellulare T GFP utilizzando la microscopia laser confocale del disco rotante invertita. Sebbene la profondità massima di imaging di questo approccio sia limitata rispetto all'uso della microscopia a scansione laser a due fotoni, la microscopia laser confocale a disco rotante offre il vantaggio dell'acquisizione di immagini ad alta velocità con fotobleaching ridotto e Photodamage. Utilizzando il software di analisi delle immagini 4D, il comportamento di sorveglianza delle cellule T e le loro interazioni con le cellule vicine possono essere analizzati in seguito alla manipolazione sperimentale per fornire ulteriori informazioni sull'attivazione e il funzionamento dell'IEL all'interno della mucosa intestinale.

Introduzione

I linfociti intraeliali (IEL) si trovano all'interno dell'epitelio intestinale e si trovano sia lungo la membrana del seminterrato che tra celle epiteliali adiacenti nello spazio intercellulare laterale¹. C'è circa un IEL per ogni 5-10 cellule epiteliali; questi IEL servono come sentinelle per fornire la sorveglianza immunitaria della grande distesa della barriera epiteliale intestinale². Gli IEL che esprimono il recettore delle cellule T (TCR) costituiscono fino al 60% della popolazione totale di IEL nell'intestino piccolo murno. Studi condotti su topi carenti di cellule T dimostrano un ruolo in gran parte protettivo di queste cellule in risposta a lesioni intestinali, infiammazione e infezione^3,4,5. Nonostante la generazione del topo a eliminazione diretta Tcrd ⁶, la nostra comprensione della biologia della IEL rimane limitata in parte a causa del fatto che i ligandi riconosciuti da z - il TCR sono ancora da identificare^{7 .} Di conseguenza, la mancanza di strumenti per studiare questa popolazione cellulare ha reso difficile studiare il ruolo dell'attivazione e della funzione della TCR in condizioni fisiologiche e patologiche. Per colmare questa lacuna, abbiamo sviluppato tecniche di imaging dal vivo per visualizzare il comportamento migratorio di IEL e le interazioni con gli enterociti vicini come mezzo per fornire ulteriori informazioni sulla funzione IEL e sulla reattività agli stimoli esterni in vivo.

Nell'ultimo decennio, l'imaging intravitale ha ampliato significativamente la nostra comprensione degli eventi molecolari coinvolti in molteplici sfaccettature della biologia intestinale, tra cui lo spargimento delle cellule epiteliali⁸, regolazione della funzione di barriera epiteliale^{9 ,10}, campionamento di cellule mieloidi del contenuto luminale^11,12e interazioni host-microbe^{11,13,14,15,16} . Nel contesto della biologia IEL, l'uso della microscopia intravitale ha fatto luce sulle dinamiche spatiotemporali della motilità IEL e sui fattori che mediano il loro comportamento di sorveglianza^{13,14,15, 16}. Lo sviluppo del topo reporter TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP), che etichetta gli IEL con l'espressione nucleare della GFP¹⁷, ha rivelato che gli IEL sono altamente motili all'interno dell'epitelio e presentano un comportamento di sorveglianza unico che risponde al microbico infezione^17,13,14. Recentemente, è stato sviluppato un altro topo di reporter delle cellule T (Tcrd-GDL) che esprime GFP nel citoplasma per consentire la visualizzazione dell'intera cellula¹⁸. Metodologia simile è stata utilizzata per studiare il requisito di recettori chemiochine specifici, come il recettore accoppiato a proteina G (GPCR)-18 e -55, sulla dinamica della motilità IEL^19,20. In assenza di un reporter specifico per le cellule, sono stati utilizzati anticorpi coniugati fluorescenti contro CD8, per visualizzare e tracciare la motilità IEL in vivo^19,20. Sebbene la microscopia a scansione laser a due fotoni sia comunemente utilizzata per l'imaging intravitale, l'uso della microscopia laser confocale confocale a disco rotante offre vantaggi unici per catturare immagini multicanale ad alta velocità e ad alta risoluzione con un minimo rumore di fondo. Questa tecnologia è ideale per chiarire le dinamiche spatiotemporali delle interazioni immuno/epiteliali all'interno del complesso microambiente della mucosa intestinale. Inoltre, attraverso l'uso di vari modelli murini transgenici e/o ad eliminazione diretta, questi studi possono fornire informazioni sulla regolazione molecolare della funzione immunitaria e/o delle cellule epiteliali intestinali.

Protocollo

Tutti gli studi sono stati condotti in una struttura accreditata dall'Associazione della valutazione e dell'accreditamento della cura degli animali di laboratorio (AALAC) secondo i protocolli approvati dalla Rutgers New Jersey Medical School Comparative Medicine Resources.

1. Preparazione del mouse

NOT: La seguente procedura, compresa la preparazione e l'intervento chirurgico, prenderà 30-40 min. Prima dell'intervento chirurgico, accenderà il microscopio e riscalderà l'incubatrice chiusa al microscopio a 37 gradi centigradi.

1. Eseguire esperimenti su mouse TcrdEGFP di 8-10 settimane su uno sfondo C57BL/6, ottenuti da Bernard Malissen (INSERM, Parigi, Francia). Secondo la procedura approvata da IACUC, anestesizzare il topo mediante iniezione i.p. di ketamina (120 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) in base al peso dell'animale. Valutare il livello di anestesia per frequenza respiratoria (55-65 respiri al minuto)²¹, pizzico e riflesso palpebrale.
2. Una volta raggiunta l'anestesia del piano chirurgico, fissare le zampe posteriori del mouse utilizzando il nastro adesivo su un pad di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea, che può essere monitorata dal termometro rettale. Se ci sono segni che l'anestesia si sta consumando (ad esempio, aumento del tasso di respirazione, lampeggiante e/o risposta contrazioni del muscolo oculare al riflesso palpebrale), re-amministrare 50 -L di ketamina/xylazina alla volta fino a quando il mouse è completamente sedato.
3. Preparare il tintura nucleare diluindo 50 gradi l di Hoechst 33342 (10 mg/mL) con 315 lun dello 0,9% di salina; la concentrazione finale è di 37,5 mg/kg in base al peso del topo (200 -l volume approssimativo). Una volta che il topo è anestesizzato, iniettare lentamente il Hoechst utilizzando una siringa di tubercolina attraverso il seno venoso retro-orbitale.
   NOT: Attendere 1–2 minuti prima di procedere al passaggio successivo per consentire al topo di acclimatarsi al cambiamento di volume circolante dopo l'iniezione retroorbitale.
4. Posizionare una piccola quantità di lubrificante sugli occhi per evitare che si asciughino.

2. Chirurgia del topo: Laparotomia per esporre Mucosa intestinale

1. Fare un'incisione verticale di 2 cm attraverso la pelle e peritoneo lungo la linea mediana dell'addome inferiore per esternalizzare la regione dell'intestino da immaginare.
2. Utilizzando pinze angolate, estrarre attentamente il cecum dalla cavità peritoneale e identificare l'area dell'intestino tenue da immaginare. Fare attenzione a non strappare i vasi sanguigni mesentici durante questo processo. Per ridurre al minimo i potenziali danni o sanguinamento, evitare di afferrare o pizzicare l'intestino con le pinze.
3. Individuare una regione adatta di intestino tenue (2-3 cm) per l'imaging che contiene un contenuto fecale minimo. Restituire con attenzione il cecum e l'intestino tenue rimanente nella cavità peritoneale, lasciando il segmento di interesse esternalizzato.
   NOT: Evitare di perforare il cecum o interrompere la vascolatura mesenterica durante questo passaggio.
4. Posizionare due paia di pinze su entrambi i lati della mesenteria sottostante tra i vasi sanguigni e strofinare delicatamente le punte delle pinze insieme per creare un foro nella membrana (Figura 1)²². Questo permetterà all'ago di passare attraverso la mesenteria quando si chiude la cavità peritoneale sotto l'intestino.
5. Chiudere l'incisione mantenendo il ciclo dell'intestino esternalizzato. Utilizzando pinze angolate e un ago curvo, punto di cono attaccato a una sutura di 5 cm, penetrare un lato del peritoneo, passare attraverso il foro fatto nella fase precedente, e verso l'alto attraverso l'altro lato del rivestimento peritoneale. Posizionare una sutura nella parte superiore e un'altra vicino alla parte inferiore dell'incisione.
   NOT: Evitare di danneggiare la vascolatura durante questo passaggio.
6. Ripetere questo processo per chiudere la pelle sotto il ciclo intestinale, posizionando una sutura al centro dell'incisione, tra le suture precedenti nel peritoneo sottostante.
   NOT: È importante esternalizzare solo l'area da immaginare; questo ridurrà il movimento estraneo durante l'imaging. Assicurati di evitare di legare le arterie mesentiche.
7. Utilizzare un elettrocauterio per fare una linea di perforazione lungo il bordo antimesente. Immediatamente dopo la cauterizzazione, applicare alcune gocce d'acqua sulla superficie dell'intestino per evitare ulteriori danni ai tessuti indotti dal calore. Far fluttuare con un Kimwipe per rimuovere l'acqua residua.
8. Tagliare una piccola scheggia orizzontale sul bordo distale del tessuto cauterizzato utilizzando le forbici Vannas e procedere a tagliare lungo la lunghezza della linea cauterizzata verso l'estremità prossimale del segmento del tessuto esterno (circa 1,5 cm di lunghezza) per esporre il mucosa superficie.
   NOT: Se necessario, utilizzare pinze per rimuovere delicatamente qualsiasi contenuto fecale in eccesso rimanente sulla superficie mucosa esposta.
9. Coprire l'addome del topo con un Kimwipe umido per evitare che il tessuto si disidrati. Trasportare il topo al microscopio in una nave coperta.

3. Acquisizione di immagini da microscopia confocale disco rotante

1. Pipette 150 - L of 1 XM AlexaFluor 633 in HBSS sul fondo in vetro ritagliato di un piatto da 35 mm. Posizionare il mouse in modo che la superficie mucosa aperta contatti direttamente lo scivolo.
2. Inclinare la testa del microscopio indietro e posizionare il mouse sul piatto ritagliato sullo stadio di imaging in un'incubatrice preriscaldata. In alternativa, coprire il mouse con una coperta riscaldante per mantenere la temperatura corporea.
3. Avviare il software di imaging. L'intensità di eccitazione e il tempo di esposizione per ogni laser non devono superare rispettivamente 10-15 mW o 120-150 ms, per evitare il fotosbiancamento e ridurre al minimo l'intervallo tra i punti temporali. Regolare la media del fotogramma su "2" e attivare la funzione di guadagno EM per ridurre il rumore di fondo. Selezionare la calibrazione obiettivo 63x per garantire la corretta misurazione delle dimensioni in pixel.
   NOT: Le impostazioni descritte in precedenza hanno lo scopo di fornire un riferimento iniziale, ma variano a seconda delle singole configurazioni del microscopio.
4. Utilizzando il laser da 405 nm e l'obiettivo dell'aria 20x, visualizzare i nuclei per individuare un campo di villi che non hanno un movimento evidente o una deriva a occhio. Evitare le aree di movimento artifactuala a causa di respirazione, peristalsi o battito cardiaco.
5. Utilizzando la scansione XY, registrare la coordinata XY del campo di interesse e passare all'obiettivo 63X di immersione glicerolo.
6. Verificare che i villi nel campo selezionato siano stabili acquisendo un'immagine live sul canale 405 nm per un massimo di 1 min.
7. Durante l'acquisizione di un'immagine dal vivo sul canale 405 nm, regolare la messa a fuoco per trovare il piano ortogonale appena sotto la punta villosa. Acquisire le pile a partire da appena sotto l'epitelio di punta villous lungo il villus fino a quando non è difficile risolvere i nuclei, circa 15-20 m, utilizzando un passo di 1,5 m.
   NOT: Quando si crea immagini con tre canali (405, 488, 640 nm) utilizzando i tempi di esposizione descritti in precedenza, è possibile acquisire tutti e tre i canali in sequenza a intervalli di circa 20 s.
8. Aprire il software in modalità di analisi, 3-5 min dopo l'inizio dell'acquisizione, per confermare la stabilità dell'immagine e la motilità IEL. Continuare ad acquisire immagini per 30-60 min per ogni campo di villi. Registrare 2–3 campi per ogni mouse. Durante l'imaging, monitorare il mouse ogni 5 min.
   NOT: Se l'anestesia inizia a svanire, usare pinze per setacciare delicatamente il collo del mouse per somministrare 50 -L di ketamina/xilarina alla volta. Continuare a monitorare i livelli di anestesia e ri-somministrare quando necessario.
9. Non è consigliabile immaginare un singolo mouse per più di 4 h. Una volta completata l'acquisizione dell'immagine, sacrifica i topi con la lussazione cervicale seguita da pneumotorace bilaterale.

4. Analisi 4D delle immagini

1. Importa direttamente i file di imaging nel software di rendering 4D.
2. Creare singole superfici per gli IEL e il lume, quindi tenere traccia delle superfici nel tempo utilizzando i parametri descritti nella Tabella 1 come riferimento iniziale. Per gli IEL, attivate Dividi gli oggetti toccanti utilizzando il diametro del punto di seme indicato.
3. Utilizzare l'algoritmo di tracciamento autogressivo per determinare la motilità IEL. Anche se l'algoritmo di rilevamento è relativamente accurato, è imperativo controllare visivamente le tracce per ogni singolo linguaggio IEL. Se una traccia non è corretta, correggerla utilizzando le funzioni Disconnetti e Connetti nella scheda Modifica tracce.
4. Per determinare la distanza da ogni lecca-leale al lume, selezionate la Superficie del lume ed eseguite la funzione Trasformazione distanza (Distance Transformation) nel menu Strumento (Tool). Quando richiesto, selezionare Superficie esterna. Una volta calcolata, la trasformazione della distanza verrà visualizzata come quarto canale.
5. Filtrare il valore Intensity min del quarto canale per selezionare gli IEL di z che si trovano all'interno dello spazio intercellulare laterale (LIS). Questo valore deve essere vicino a 15 m, in base all'altezza di una cella epiteliale colonnare. La percentuale di iEL z z all'interno di questo intervallo è riportata come la frequenza degli IEL nel LIS.
6. Per ulteriori analisi, esportare i dati statistici tra cui: velocità della traccia IEL, spostamento della pista, rettilineo e lunghezza della pista. In alternativa, analizzare i dati utilizzando il modulo Vantage. A seconda dell'esperimento, ottenere metriche aggiuntive dai dati acquisiti, incluso il tempo di permanenza all'interno delle interazioni LIS o IEL/epiteliale.

Risultati

Utilizzando l'imaging intravitale dei topi reporter TcrdEGFP, abbiamo già dimostrato che gli iEL s'esibiscono con un comportamento di sorveglianza dinamica, in cui pattugliano l'epitelio migrando lungo la membrana del seminterrato e nello spazio intercellulare laterale (LIS) a stato (Figura 2, Filmato 1).

Questo approccio può essere utilizzato anche per valutare come l'inibizione di specifiche vie di segnalazione cellulare e/o recettori influenz...

Discussione

Lo sviluppo di tecniche di microscopia intravitale ha fornito un'opportunità senza precedenti per osservare la riorganizzazione delle strutture subcellulari^8,9,22, interazioni cellule-cellule^{12, 25} e comportamento migratorio cellulare^13,14,15,16

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm dish, No. 1.5 Coverslip	MatTek	P35G-1.5-14-C
Alexa Fluor 633 Hydrazide	Invitrogen	A30634
BD PrecisionGlide Hypodermic needles - 27 G	Thermo Fisher Scientific	14-826-48
BD Slip Tip Sterile Syringe - 1 mL	Thermo Fisher Scientific	14-823-434
BD Tuberculin Syringe	Thermo Fisher Scientific	14-829-9
Dissecting scissors	Thermo Fisher Scientific	08-940
Electrocautery	Thermo Fisher Scientific	50822501
Enclosed incubation chamber	OKOLAB		Microscope
Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length	Roboz	RS-7983-3
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	55037C
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules	Bitplane		Software
Inverted DMi8	Leica		Microscope
IQ3 (v. 3.6.3)	Andor		Software
Ketamine	Putney		Anesthesia
Kimwipes	VWR	21905-026
McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5 x 0.15 mm Straight Sharp	Roboz	RS-5600
Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided	Fisher Scientific	NC0798934
Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2 mm Tip	Roboz	RS-5228
Puralube Vet Ointment	Dechra		Lubricating Eye Ointment
Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser	Andor		Confocal system
Xylazine	Akorn		Anesthesia