Imagem latente intravital de linfócitos intraepithelial no intestino pequeno murine

Resumo

Nós descrevemos um método para visualizar o IELS do ltγδ GFP-etiquetado usando a imagem latente intravital do intestino pequeno murino pela microscopia confocal invertida do disco de giro. Esta técnica permite o rastreamento de células ao vivo dentro da mucosa para até 4 h e pode ser usada para investigar uma variedade de interações imunológicas intestinais.

Resumo

Os linfócitos intraepithelial que expressam o receptor da pilha de ltγδ T (ltγδ IEL) jogam um papel chave na fiscalização imune do epitélio intestinal. Devido, em parte, à falta de um ligantes definitivo para o receptor de células ltγδ T, nossa compreensão da regulação da ativação ltγδ IEL e sua função in vivo permanece limitada. Isso requer o desenvolvimento de estratégias alternativas para interrogar as vias de sinalização envolvidas na regulação da função ltγδ IEL e a responsividade dessas células ao microambiente local. Embora os IELS do ltγδ sejam compreendidos extensamente para limitar o translocation do micróbio patogénico, o uso da imagem latente intravital tem sido crítico a compreender a dinâmica armazenamento de interações de IEL/epithelial no estado estacionário e em resposta aos micróbios patogénicos invasores. Nisto, nós apresentamos um protocolo para visualizar o comportamento migratório de IEL na mucosa intestinal pequena de um rato do repórter da pilha de GFP ltγδ T usando a microscopia de laser confocal invertida do disco de giro. Embora a profundidade máxima da imagem latente desta aproximação seja limitada relativo ao uso da microscopia do laser-exploração do dois-fóton, a microscopia confocal do laser do disco de giro fornece a vantagem da aquisição de imagem de alta velocidade com photobranqueamento reduzido e photodamage. Usando o software da análise de imagem 4D, o comportamento da fiscalização da pilha de T e suas interações com pilhas vizinhas podem ser analisados depois da manipulação experimental para fornecer a introspecção adicional na ativação e na função de IEL dentro da mucosa intestinal.

Introdução

Os linfócitos intraepithelial (IEL) são situados dentro do epitélio intestinal, e são encontrados ao longo da membrana do porão e entre pilhas epithelial adjacentes no espaço intercelular lateral¹. Há aproximadamente um IEL para cada 5-10 pilhas epithelial; Estes IELs servem como sentinelas para fornecer a fiscalização imune da grande extensão da barreira epithelial intestinal². Os IELs que expressam o receptor da célula ltγδ T (TCR) compreendem até 60% da população total de IEL no intestino delgado murino. Estudos em camundongos T-Cell-deficientes ltγδ demonstram um papel de grande proteção dessas células em resposta a lesão intestinal, inflamação e infecção^3,4,5. Apesar da geração do mouse nocaute Tcrd ⁶, nossa compreensão da biologia ltγδ IEL permanece limitada devido, em parte, ao fato de que os ligantes reconhecidos pelo ltγδ TCR ainda não foram identificados⁷. Como resultado, a falta de ferramentas para estudar esta população celular dificultou a investigação do papel da ativação e função do ltγδ TCR condições fisiológicas e patológicas. Para preencher essa lacuna, desenvolvemos técnicas de imagem ao vivo para visualizar o comportamento migratório de ltγδ IEL e interações com enterócitos vizinhos como um meio para fornecer informações adicionais sobre a função ltγδ IEL e responsividade aos estímulos externos in vivo.

Durante a última década, a imagem latente Intravital expandiu significativamente nossa compreensão dos eventos moleculars envolvidos em facetas múltiplas da biologia intestinal, incluindo o derramamento epithelial⁸da pilha, regulamento da função epithelial 9 da barreira ^,10, amostragem de células mielóides de conteúdo Luminal^11,12e interações hospedeiro-micróide^{11,13,14,15,16} . No contexto da biologia de IEL, o uso da microscopia intravital tem derramado luz sobre a dinâmica espaciotemporal da motilidade de IEL e os fatores que mediam o seu comportamento de vigilância^13,14,15, a ¹⁶. O desenvolvimento de camundongos de repórter TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP), que rotula ltγδ IELs pela expressão nuclear de GFP¹⁷, revelou que Ltγδ IELS são altamente motile dentro do epitélio e exibem um comportamento de vigilância único que é responsivo a microbiana infecção^17,13,14. Recentemente, um outro rato do repórter da pilha de ltγδ T foi desenvolvido (Tcrd-GDL) que expressa GFP no citoplasma para permitir o visualização da pilha inteira¹⁸. Metodologia semelhante tem sido utilizada para investigar a exigência de receptores específicos de quimiocina, como o receptor acoplado à proteína G (GPCR)-18 e-55, sobre a dinâmica da motilidade de IEL^19,20. Na ausência de um repórter Cell-specific, os anticorpos conjugado fluorescentes de encontro a CD8α foram usados para visualizar e seguir a motilidade de IEL in vivo^19,20. Embora a microscopia de varredura do laser do dois-fóton seja usada geralmente para a imagem latente intravital, o uso da microscopia confocal do laser do disco de giro fornece vantagens originais para capturar imagens multicanal de alta velocidade e de alta resolução com ruído de fundo mínimo. Esta tecnologia é ideal para elucidar a dinâmica espaciotemporal das interações imunológicas/epiteliais dentro do complexo microambiente da mucosa intestinal. Além disso, através do uso de vários modelos transgênicos e/ou Knockout mouse, esses estudos podem fornecer informações sobre a regulação molecular da função intestinal imune e/ou células epiteliais.

Protocolo

Todos os estudos foram conduzidos em uma associação de avaliação e acreditação de laboratório de cuidados com animais (AALAC)-instalações credenciadas de acordo com protocolos aprovados pela Rutgers New Jersey Medical School recursos de medicina comparativa.

1. preparação do mouse

Nota: O procedimento a seguir, incluindo preparação e cirurgia de animais, levará de 30 a 40 min. antes da cirurgia, ligue o microscópio e aqueça a incubadora fechada no microscópio para 37 ° c.

1. Realize experimentos em camundongos TcrdEGFP de 8 – 10 semanas de idade em um fundo C57BL/6, que foram obtidos de Bernard Malissen (INSERM, Paris, França). De acordo com o procedimento aprovado pelo IACUC, anestesiam o camundongo pela injeção i.p. de cetamina (120 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) com base no peso do animal. Avaliar o nível de anestesia por taxa de respiração (55 – 65 respirs por minuto)²¹, pinça Toe e reflexo palpebral.
2. Uma vez que a anestesia plana cirúrgica é alcançada, fixe os pés traseiros do rato usando a fita a uma almofada de aquecimento para manter a temperatura de corpo, que pode ser monitorada pelo termômetro rectal. Se houver sinais de que a anestesia está se desgastando (por exemplo, aumento da taxa de respiração, piscar e/ou músculo ocular espasmos resposta ao reflexo palpebral), re-administrar 50 μL de cetamina/xilazina em um momento até que o mouse é totalmente sedado.
3. Prepare o corante nuclear diluindo 50 μL de Hoechst 33342 (10 mg/mL) com 315 μL de soro fisiológico de 0,9%; a concentração final é de 37,5 mg/kg com base no peso do rato (200 μL de volume aproximado). Uma vez que o rato é anestesiado, injete lentamente o Hoechst usando uma seringa da tuberculina através da cavidade venosa retro-orbital.
   Nota: Aguarde 1 – 2 min antes de prosseguir para a próxima etapa para permitir que o mouse aclimatar para a mudança no volume circulante após a injeção retro-orbital.
4. Coloque uma pequena quantidade de lubrificante sobre os olhos para impedi-los de secar.

2. cirurgia do rato: laparotomia para expor a mucosa intestinal

1. Faça uma incisão vertical de 2 cm através da pele e peritônio ao longo da linha média do abdômen inferior para externalizar a região do intestino a ser imaged.
2. Usando fórceps angular, puxe com cuidado o cálio para fora da cavidade peritoneal e identifique a área do intestino delgado a ser imaged. Tenha cuidado para não rasgar os vasos sanguíneos mesentéricos durante este processo. Para minimizar potenciais danos ou sangramento, evite agarrar ou beliscar o intestino com o fórceps.
3. Localize uma região adequada de intestino delgado (2 – 3 cm) para imagens que contêm conteúdo fecal mínimo. Retorne com cuidado o ceco e o intestino delgado restante na cavidade peritoneal, ao deixar o segmento do interesse externalized.
   Nota: Evite perfurar o ceco ou interromper a vasculatura mesentérica durante esta etapa.
4. Coloque dois pares de fórceps em ambos os lados do mesenteria subjacente entre os vasos sanguíneos e esfregue suavemente as pontas da pinça juntas para criar um furo na membrana (Figura 1)²². Isto permitirá que a agulha passe através do mesentério ao fechar a cavidade peritoneal abaixo do intestino.
5. Feche a incisão enquanto mantém o laço do intestino exteriorizado. Usando o fórceps angular e uma agulha curvada, do ponto do atarraxamento unida a uma sutura de 5 cm, penetre um lado do peritoneum, atravessa o furo feito na etapa precedente, e acima através do outro lado do forro peritonealny. Coloc uma sutura na parte superior, e outra perto da parte inferior da incisão.
   Nota: Evite danificar a vasculatura durante esta etapa.
6. Repita este processo para fechar a pele o laço intestinal, colocando uma sutura no meio da incisão, entre as suturas anteriores no peritônio subjacente.
   Nota: É importante apenas externalizar a área a ser fotografada; Isto reduzirá o movimento estranho durante a imagem latente. Certifique-se de evitar amarrar as artérias mesentéricas.
7. Use um eletrocautério para fazer uma linha de perfuração ao longo da beira antimesenteric. Imediatamente após a cauterização, aplique algumas gotas da água à superfície do intestino para impedir dano de tecido calor-induzido adicional. Blot com um Kimwipe para remover a água residual.
8. Corte uma pequena fenda horizontal na borda distal do tecido cauterizado usando as tesouras de Vannas e prossiga para cortar ao longo do comprimento da linha cauterizada em direção à extremidade proximal do segmento de tecido externalizado (aproximadamente 1,5 cm de comprimento) para expor a mucosa Superfície.
   Nota: Se necessário, use fórceps para remover suavemente qualquer excesso de conteúdo fecal restante na superfície exposta da mucosa.
9. Cubra o abdômen do rato com um Kimwipe úmido para impedir que o tecido se torne desidratado. Transportar o mouse para o microscópio em uma embarcação coberta.

3. aquisição de imagem por microscopia confocal de disco giratório

1. Pipete 150 μL de 1 μM AlexaFluor 633 em HBSS para o fundo de vidro de um prato de 35 mm. Posicione o mouse de modo que a superfície mucosa aberta entre em contato diretamente com a lamínula.
2. Incline a cabeça do microscópio para trás e coloc o rato no prato coverescorregado na fase da imagem latente em uma incubadora pre-warmed. Alternativamente, cubra o rato por uma manta de aquecimento para manter a temperatura do corpo.
3. Inicie o software de imagem. A intensidade de excitação e o tempo de exposição de cada laser não devem exceder 10 – 15 mW ou 120 – 150 ms, respectivamente, para evitar o fotobranqueamento e minimizar o intervalo entre os pontos temporais. Ajuste a média do quadro para "2" e ative a função de ganho EM para reduzir o ruído de fundo. Selecione a calibração objetiva de 63x para assegurar a medida correta do tamanho do pixel.
   Nota: Os ajustes detalhados acima são significados fornecer uma referência inicial, mas variarão dependendo das configurações individuais do microscópio.
4. Usando o laser de 405 nanômetro e o objetivo do ar 20x, visualize os núcleos para encontrar um campo dos Villi que faltam o movimento ou a tração perceptível pelo olho. Evite áreas de movimento vesícula devido à respiração, peristaltismo ou batimento cardíaco.
5. Usando a varredura XY, registre a coordenada XY do campo de interesse e mude para o objetivo da imersão 63X do glicerol.
6. Confirme que as vilosidades no campo selecionado são estáveis adquirindo uma imagem ao vivo no canal 405 nm por até 1 min.
7. Ao adquirir uma imagem ao vivo no canal 405 nm, ajuste o foco para encontrar o plano ortogonal logo abaixo da ponta villous. Adquira pilhas Z a partir do logo abaixo do epitélio da ponta villous abaixo do vilosidades até que seja difícil resolver os núcleos, aproximadamente 15 – 20 μm, usando uma etapa de 1,5 μm.
   Nota: Quando a imagem latente com três canaletas (405, 488, 640 nanômetro) usando os tempos da exposição descritos acima, é possível adquirir todos os três canaletas sequencialmente em intervalos de aproximadamente 20 s.
8. Abra o software em modo de análise, 3 – 5 min após o início da aquisição, para confirmar a estabilidade da imagem e a motilidade ltγδ IEL. Continue a adquirir imagens por 30 – 60 min para cada campo de Villi. Registre 2 – 3 campos para cada mouse. Durante a imagem, monitore o mouse a cada 5 min.
   Nota: Se a anestesia começa a se desgastar, use fórceps para esfregar suavemente o pescoço do mouse para administrar 50 μL de cetamina/xilazina de cada vez. Continuar a monitorizar os níveis de anestesia e re-administrar quando necessário.
9. Não é aconselhável a imagem de um único mouse por mais de 4 h. Após a conclusão da aquisição da imagem, Sacrifique os camundongos por luxação cervical seguida de pneumotórax bilateral.

4.4D análise de imagens

1. Importe diretamente arquivos de imagem para o software de renderização 4D.
2. Crie superfícies individuais para IELS e o lúmen e, em seguida, acompanhe as superfícies ao longo do tempo usando os parâmetros descritos na tabela 1 como uma referência inicial. Para os IELs, ative dividir objetos tocantes usando o diâmetro do ponto de semente indicado.
3. Use o algoritmo de rastreamento autoregressivo para determinar a motilidade do IEL. Embora o algoritmo de rastreamento seja relativamente preciso, é imperativo inspecionar visualmente as faixas para cada IEL individual. Se uma faixa estiver incorreta, corrija-a usando as funções Desconectar e conectar a guia Editar faixas .
4. Para determinar a distância de cada IEL ao lúmen, selecione a superfície do lúmen e realize a função de transformação de distância no menu de ferramentas . Quando solicitado, selecione fora do Surface. Uma vez calculado, a transformação de distância será exibida como o 4º canal.
5. Filtre a intensidade mínima do 4º canal para selecionar Ltγδ IELS que estejam dentro do espaço intercelular lateral (LIS). Esse valor deve ser próximo a 15 μm, com base na altura de uma célula epitelial colunar. A percentagem de ltγδ IELs totais dentro deste intervalo é relatada como a frequência de ltγδ IELs no LIS.
6. Para uma análise mais aprofundada, exporte dados estatísticos, incluindo: velocidade da faixa IEL, deslocamento da faixa, lineabilidade da faixa e comprimento da faixa. Alternativamente, analise os dados usando o módulo Vantage. Dependendo do experimento, obtenha métricas adicionais dos dados adquiridos, incluindo o tempo de permanência dentro das interações LIS ou IEL/epitelial.

Resultados

Usando a imagem latente intravital de ratos do repórter de tcrdegfp, nós mostramos previamente que ltγδ IELS exibem um comportamento dinâmico da fiscalização, em que patrulham o epitélio migrando ao longo da membrana do porão e no espaço intercelular lateral (LIS) em constante Estado (Figura 2, filme 1).

Essa abordagem também pode ser usada para avaliar como a inibição de vias de sinalização celular específica e/ou receptores influ...

Discussão

O desenvolvimento de técnicas de microscopia intravital proporcionou uma oportunidade inédita de observar a reorganização das estruturas subcelulares^8,9,22, interações célula-celular^{12, 25} e comportamento migratório^{celular 13,14,15,16}<...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm dish, No. 1.5 Coverslip	MatTek	P35G-1.5-14-C
Alexa Fluor 633 Hydrazide	Invitrogen	A30634
BD PrecisionGlide Hypodermic needles - 27g	Thermo Fisher Scientific	14-826-48
BD Slip Tip Sterile Syringe - 1 ml	Thermo Fisher Scientific	14-823-434
BD Tuberculin Syringe	Thermo Fisher Scientific	14-829-9
Dissecting scissors	Thermo Fisher Scientific	08-940
Electrocautery	Thermo Fisher Scientific	50822501
Enclosed incubation chamber	OKOLAB		Microscope
Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length	Roboz	RS-7983-3
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	55037C
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules	Bitplane		Software
Inverted DMi8	Leica		Microscope
IQ3 (v. 3.6.3)	Andor		Software
Ketamine	Putney		Anesthesia
Kimwipes	VWR	21905-026
McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5X0.15mm Straight Sharp	Roboz	RS-5600
Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided	Fisher Scientific	NC0798934
Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2mm Tip	Roboz	RS-5228
Puralube Vet Ointment	Dechra		Lubricating Eye Ointment
Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser	Andor		Confocal system
Xylazine	Akorn		Anesthesia