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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode zur Visualisierung von GFP-markierten IELs mit intravitaler Bildgebung des murinen Dünndarms durch invertierte Konfokalmikroskopie der Spinnscheibe. Diese Technik ermöglicht die Verfolgung von lebenden Zellen innerhalb der Schleimhaut für bis zu 4 h und kann verwendet werden, um eine Vielzahl von darmen immun-epitheliale Wechselwirkungen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Intraepitheliale Lymphozyten, die den T-Zellrezeptor exzessikuliert, spielen eine Schlüsselrolle bei der Immunüberwachung des Darmepithels. Aufgrund des Fehlens eines endgültigen Liganden für den T-Zellrezeptor bleibt unser Verständnis der Regulation der IEL-Aktivierung und ihrer Funktion in vivo begrenzt. Dies erfordert die Entwicklung alternativer Strategien zur Abhörung von Signalwegen, die an der Regulierung der IEL-Funktion und der Reaktionsfähigkeit dieser Zellen auf die lokale Mikroumgebung beteiligt sind. Obwohl IELs weithin verstanden werden, um die Pathogentranslokation zu begrenzen, war die Verwendung von intravitaler Bildgebung entscheidend für das Verständnis der räumlich-zeitlichen Dynamik von IEL/epithelialen Wechselwirkungen im stationären Zustand und als Reaktion auf invasive Krankheitserreger. Hierin stellen wir ein Protokoll zur Visualisierung des IEL-Migrationsverhaltens in der kleinen Darmschleimhaut einer GFP-T-Zellreportermaus mit invertierter Konokallasermikroskopie der Spinnscheibe vor. Obwohl die maximale Bildtiefe dieses Ansatzes im Vergleich zur Verwendung der Zwei-Photonen-Laserscanmikroskopie begrenzt ist, bietet die konfokale Lasermikroskopie der Spinnscheibe den Vorteil der Hochgeschwindigkeits-Bildaufnahme mit reduzierter Photobleichung und Photodamage. Mit Hilfe der 4D-Bildanalyse-Software können das T-Zell-Überwachungsverhalten und ihre Wechselwirkungen mit benachbarten Zellen nach experimenteller Manipulation analysiert werden, um zusätzliche Einblicke in die IEL-Aktivierung und -Funktion innerhalb der Darmschleimhaut zu geben.

Einleitung

Intraepitheliale Lymphozyten (IEL) befinden sich im Darmepithel und finden sich sowohl entlang der Kellermembran als auch zwischen benachbarten Epithelzellen im lateralen interzellulären Raum1. Es gibt etwa einen IEL für jede 5-10 Epithelzellen; Diese IELs dienen als Wächter, um die große Weite der Darmepithelbarriere immun zu überwachen2. IELs, die den T-Zell-Rezeptor (TCR) exemiten, machen bis zu 60 % der gesamten IEL-Population im murinen Dünndarm aus. Studien an T-Zell-Mäusen zeigen eine weitgehend schützende Rolle dieser Zellen als Reaktion auf Darmverletzungen, Entzündungen und Infektionen3,4,5. Trotz der Erzeugung der Tcrd-Knockout-Maus6ist unser Verständnis der IEL-Biologie zum Teil darauf beschränkt, dass Liganden, die von der TCR erkannt werden, noch nicht identifiziert werden müssen7. Infolgedessen hat der Mangel an Werkzeugen zur Untersuchung dieser Zellpopulation es schwierig gemacht, die Rolle der TCR-Aktivierung und -Funktion unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Um diese Lücke zu schließen, haben wir Live-Bildgebungstechniken entwickelt, um das IEL-Migrationsverhalten und die Interaktionen mit benachbarten Enterozyten zu visualisieren, um zusätzliche Einblicke in die IEL-Funktion und die Reaktionsfähigkeit auf externe Reize in vivo zu geben.

In den letzten zehn Jahren hat die intravitale Bildgebung unser Verständnis der molekularen Ereignisse, die an mehreren Facetten der Darmbiologie beteiligt sind, einschließlich epithelialen Zellabwurfs8, Regulierung der epithelialen Barrierefunktion 9 erheblich erweitert. ,10, myeloische Zellentnahme von Luminalinhalten11,12und Wirtsmikroben-Wechselwirkungen11,13,14,15,16 . Im Kontext der IEL-Biologie hat der Einsatz der intravitalen Mikroskopie die raumzeitliche Dynamik der IEL-Motilität und die Faktoren, die ihr Überwachungsverhalten vermitteln,beleuchtet 13,14,15, 16. Die Entwicklung von TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP) Reportermäusen, die DIE IELs nach dem kernadischen GFP-Ausdruck17kennzeichnen, zeigte, dass IELs innerhalb des Epithels hochmotil sind und ein einzigartiges Überwachungsverhalten aufweisen, das auf mikrobielle Infektion17,13,14. Kürzlich wurde eine weitere "T-Zellreporter-Maus"(Tcrd-GDL) entwickelt, die GFP im Zytoplasma ausdrückt, um die Visualisierung der gesamten Zelle18zu ermöglichen. Ähnliche Methoden wurden verwendet, um die Anforderung von spezifischen Chemokin-Rezeptoren, wie G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-18 und -55, auf die Dynamik der IEL-Motilität19,20zu untersuchen. In Ermangelung eines zellspezifischen Reporters wurden fluoreszierende konjugierte Antikörper gegen CD8 verwendet, um Die IEL-Motilität in vivo19,20zu visualisieren und zu verfolgen. Obwohl die Zwei-Photonen-Laserscanmikroskopie häufig für die intravitale Bildgebung verwendet wird, bietet die Verwendung der konfokalen Lasermikroskopie einzigartige Vorteile, um hochauflösende und hochauflösende Mehrkanalbilder mit minimalem Hintergrundrauschen zu erfassen. Diese Technologie ist ideal, um die raumzeitliche Dynamik von immun-epitheliaalen Wechselwirkungen innerhalb der komplexen Mikroumgebung der Darmschleimhaut aufzuklären. Darüber hinaus können diese Studien durch den Einsatz verschiedener transgener und/oder Knockout-Mausmodelle Einblicke in die molekulare Regulation der Darmimmun- und/oder Epithelzellfunktion geben.

Protokoll

Alle Studien wurden in einer Association of the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC)-akkreditierten Einrichtung nach Protokollen durchgeführt, die von Rutgers New Jersey Medical School Comparative Medicine Resources genehmigt wurden.

1. Mausvorbereitung

HINWEIS: Das folgende Verfahren, einschließlich Tierpräparation und Operation, dauert 30–40 min. Vor der Operation, schalten Sie das Mikroskop ein und wärmen Sie den geschlossenen Inkubator am Mikroskop auf 37 °C.

  1. Führen Sie Experimente an 8-10 Wochen alten TcrdEGFP-Mäusen auf einem C57BL/6-Hintergrund durch, die von Bernard Malissen (INSERM, Paris, Frankreich) gewonnen wurden. Nach dem von der IACUC zugelassenen Verfahren wird die Maus durch i.p. Injektion von Ketamin (120 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) auf der Grundlage des Gewichts des Tieres befeuchtet. Bewerten Sie das Niveau der Anästhesie durch Atmungsrate (55-65 Atemzüge pro Minute)21, Zehenkneifen und palpebrale Reflex.
  2. Sobald die chirurgische Anästhesie erreicht ist, sichern Sie die Hinterbeine der Maus mit Klebeband an einem Heizkissen, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten, die mit dem Rektalthermometer überwacht werden kann. Wenn anzeichen dafür ist, dass sich die Anästhesie abnimmt (z. B. erhöhte Atmungsrate, Blinken und/oder Zucken des Augenmuskels auf palpebralen Reflex), verabreichen Sie 50 l Ketamin/Xylazin gleichzeitig, bis die Maus vollständig sediert ist.
  3. Bereiten Sie den Kernfarbstoff vor, indem Sie 50 l Hoechst 33342 (10 mg/ml) mit 315 l mit 0,9 % Saline verdünnen; die Endkonzentration beträgt 37,5 mg/kg, bezogen auf das Gewicht der Maus (ca. 200 l ungefähres Volumen). Sobald die Maus betäuben, injizieren Sie den Hoechst langsam mit einer Tuberkulinspritze durch die retro-orbitale Venensinus.
    HINWEIS: Warten Sie 1–2 min, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren, damit sich die Maus nach der retroorbitalen Injektion an die Veränderung des zirkulierenden Volumens akklimatisieren kann.
  4. Legen Sie eine kleine Menge Schmiermittel über die Augen, um zu verhindern, dass sie austrocknen.

2. Mauschirurgie: Laparotomie zur Belichtung der Darmschleimhaut

  1. Machen Sie einen 2 cm vertikalen Schnitt durch die Haut und Peritoneum entlang der Mittellinie des Unterbauchs, um den zu bildenden Darmbereich zu externalisieren.
  2. Mit abgewinkelten Zangen ziehen Sie vorsichtig das Cecum aus der Peritonealhöhle und identifizieren Sie den zu bildenden Bereich des Dünndarms. Achten Sie darauf, während dieses Prozesses keine mesenterischen Blutgefäße zu zerreißen. Um mögliche Schäden oder Blutungen zu minimieren, vermeiden Sie das Greifen oder Kneifen des Darms mit der Zange.
  3. Suchen Sie einen geeigneten Bereich des Dünndarms (2–3 cm) für die Bildgebung, die minimalen Fäkaliengehalt enthält. Geben Sie vorsichtig das Cecum und den verbleibenden Dünndarm in die Peritonealhöhle zurück, während das Segment des Interesses externisiert bleibt.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, das Cecum zu punktieren oder die mesenterische Vaskulatur während dieses Schritts zu stören.
  4. Legen Sie zwei Zangenpaare auf beiden Seiten der zugrunde liegenden Mesenterie zwischen den Blutgefäßen und reiben Sie sanft die Spitzen der Zangen zusammen, um ein Loch in der Membran zu schaffen (Abbildung 1)22. Dadurch kann die Nadel durch die Mesenterie gehen, wenn die Peritonealhöhle unter dem Darm geschlossen wird.
  5. Schließen Sie den Schnitt, während Sie die Darmschleife externisieren. Mit abgewinkelten Zangen und einer gekrümmten, Verjüngungsspitze Nadel an einer 5 cm Naht befestigt, durchdringen eine Seite des Peritoneums, gehen durch das Loch im vorherigen Schritt gemacht, und nach oben durch die andere Seite der peritonealen Futter. Platzieren Sie eine Naht an der Spitze und eine andere in der Nähe der Unterseite des Einschnitts.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Vaskulatur während dieses Schritts zu beschädigen.
  6. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um die Haut unter der Darmschleife zu schließen, indem Sie eine Naht in die Mitte des Schnittes legen, zwischen den vorherigen Nähten im zugrunde liegenden Peritoneum.
    HINWEIS: Es ist wichtig, nur den Bereich zu externalisieren, der abgebildet werden soll; dadurch wird die Fremdbewegung während der Bildgebung reduziert. Achten Sie darauf, die mesenterischen Arterien nicht zu binden.
  7. Verwenden Sie eine Elektrokauterie, um eine Linie der Perforation entlang der anti-mesentischen Grenze zu machen. Unmittelbar nach der Kauterisierung einige Tropfen Wasser auf die Darmoberfläche auftragen, um zusätzliche hitzeinduzierte Gewebeschäden zu verhindern. Blot mit einem Kimwipe, um Restwasser zu entfernen.
  8. Schneiden Sie einen kleinen horizontalen Schlitz am distalen Rand des kauterisierten Gewebes mit der Vannas-Schere und schneiden Sie entlang der Länge der kauterisierten Linie in Richtung des proximalen Endes des externalisierten Gewebesegments (ca. 1,5 cm lang), um die Schleimhaut freizulegen oberfläche.
    HINWEIS: Verwenden Sie bei Bedarf Zangen, um überschüssigen Fäkaliengehalt, der auf der freiliegenden Schleimhautoberfläche verbleibt, vorsichtig zu entfernen.
  9. Bedecken Sie den Bauch der Maus mit einem feuchten Kimwipe, um zu verhindern, dass das Gewebe dehydriert wird. Transportieren Sie die Maus zum Mikroskop in einem abgedeckten Gefäß.

3. Bildaufnahme durch Spinnen Disk Confocal Microscopy

  1. Pipette 150 l von 1 'M AlexaFluor 633 in HBSS auf die Glasabdeckungen, die unten einer 35 mm Schale verkrüpt sind. Positionieren Sie die Maus so, dass die geöffnete Schleimhautoberfläche direkt mit dem Deckslip in Kontakt steht.
  2. Neigen Sie den Kopf des Mikroskops zurück und legen Sie die Maus auf die Abdeckungen auf der Bildbühne in einem vorgewärmten Inkubator. Alternativ können Sie die Maus mit einer Heizdecke bedecken, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten.
  3. Starten Sie Bildgebungssoftware. Die Anregungsintensität und Belichtungszeit für jeden Laser sollte 10–15 mW bzw. 120–150 ms nicht überschreiten, um Photobleichungen zu vermeiden und das Intervall zwischen den Zeitpunkten zu minimieren. Passen Sie den Rahmendurchschnitt auf "2" an und aktivieren Sie die EM-Verstärkungsfunktion, um Hintergrundgeräusche zu reduzieren. Wählen Sie 63x Objektivkalibrierung aus, um die korrekte Messung der Pixelgröße sicherzustellen.
    HINWEIS: Die oben beschriebenen Einstellungen sollen eine erste Referenz liefern, variieren jedoch je nach Konfiguration des einzelnen Mikroskops.
  4. Visualisieren Sie mit dem 405 nm Laser und dem 20x Luftobjektiv die Kerne, um ein Feld von Zotten zu lokalisieren, in dem es an spürbarer Bewegung oder Drift durch das Auge fehlt. Vermeiden Sie Bereiche der Artefaktbewegung durch Atmung, Peristalse oder Herzschlag.
  5. Zeichnen Sie mit dem XY-Scan die XY-Koordinate des Interessenfeldes auf und wechseln Sie zum Glycerin-Immersion 63X-Objektiv.
  6. Vergewissern Sie sich, dass die Zotten im ausgewählten Feld stabil sind, indem Sie ein Live-Bild auf dem 405 nm Kanal für bis zu 1 min erfassen.
  7. Passen Sie beim Erfassen eines Live-Bildes auf dem 405 nm-Kanal den Fokus an, um die orthogonale Ebene direkt unter der Villous-Spitze zu finden. Erwerben Sie Z-Stacks, beginnend mit dem knapp unterhalb des Villous Tip Epithels nach unten des Villus, bis es schwierig ist, die Kerne, etwa 15–20 m, mit einem 1,5 m-Schritt aufzulösen.
    HINWEIS: Bei der Bildgebung mit drei Kanälen (405, 488, 640 nm) unter Verwendung der oben beschriebenen Belichtungszeiten ist es möglich, alle drei Kanäle sequenziell in etwa 20 s Intervallen zu erfassen.
  8. Öffnen Sie die Software im Analysemodus, 3–5 min nach Beginn der Erfassung, um die Bildstabilität und die Beweglichkeit von IEL zu bestätigen. Fahren Sie fort, Bilder für 30-60 min für jedes Feld von Villi zu erfassen. Zeichnen Sie 2–3 Felder für jede Maus auf. Überwachen Sie die Maus während der Bildgebung alle 5 Min.
    HINWEIS: Wenn die Anästhesie abnutzt, verwenden Sie Zangen, um den Hals der Maus sanft zu zerkratzen, um 50 l Ketamin/Xylazin gleichzeitig zu verabreichen. Weiter anästhesien und bei Bedarf erneut verabreichen.
  9. Es ist nicht ratsam, eine einzelne Maus länger als 4 h abzubilden. Sobald die Bildaufnahme abgeschlossen ist, opfern Sie die Mäuse durch zervikale Dislokation gefolgt von bilateralem Pneumothorax.

4. 4D-Analyse von Bildern

  1. Importieren Sie Bildgebungsdateien direkt in die 4D-Rendering-Software.
  2. Erstellen Sie einzelne Flächen für IELs und das Lumen, und verfolgen Sie dann die Flächen im Laufe der Zeit mithilfe der in Tabelle 1 beschriebenen Parameter als erste Referenz. Aktivieren Sie für die IELs Split-Touch-Objekte mit dem angegebenen Startpunktdurchmesser.
  3. Verwenden Sie den autoregressiven Tracking-Algorithmus, um die IEL-Beweglichkeit zu bestimmen. Obwohl der Tracking-Algorithmus relativ genau ist, ist es unerlässlich, Spuren für jeden einzelnen IEL visuell zu überprüfen. Wenn eine Spur falsch ist, korrigieren Sie sie mit den Funktionen Trennen und Verbinden unter der Registerkarte Spuren bearbeiten.
  4. Um den Abstand von jedem IEL zum Lumen zu bestimmen, wählen Sie das Lumen Oberfläche aus und führen Sie die Distance Transformation-Funktion im Menü Werkzeug aus. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, wählen Sie Außenflächeaus. Nach der Berechnung wird die Entfernungstransformation als 4. Kanal angezeigt.
  5. Filtern Sie die Intensitätsmin des 4. Kanals, um IELs auszuwählen, die sich innerhalb des lateralen interzellulären Raums (LIS) befinden. Dieser Wert sollte auf der Höhe einer säulenaren Epithelzelle nahe 15 m liegen. Der prozentuale Anteil der gesamten IELs innerhalb dieses Bereichs wird als Häufigkeit von IELs im LIS gemeldet.
  6. Für weitere Analysen exportieren Sie statistische Daten, einschließlich: IEL-Spurgeschwindigkeit, Spurverschiebung, Spurgeraden und Streckenlänge. Alternativ können Sie Daten mit dem Vantage-Modul analysieren. Erhalten Sie je nach Experiment zusätzliche Metriken aus den erfassten Daten, einschließlich der Verweilzeit innerhalb der LIS- oder IEL/Epithelial-Interaktionen.

Ergebnisse

Mit Hilfe der intravitalen Bildgebung von TcrdEGFP-Reportermäusen haben wir zuvor gezeigt, dass IELs ein dynamisches Überwachungsverhalten aufweisen, bei dem sie das Epithel patrouillieren, indem sie entlang der Kellermembran und in den lateralen interzellulären Raum (LIS) in stetiger Zustand (Abbildung 2, Film 1).

Dieser Ansatz kann auch verwendet werden, um zu bewerten, wie die Hemmung bestimmter Zellsignalwege und/oder Rezeptoren das IEL-Mig...

Diskussion

Die Entwicklung von intravitalen Mikroskopie-Techniken hat eine beispiellose Gelegenheit geboten, die Reorganisation subzellulärer Strukturen zu beobachten8,9,22, Zell-Zell-Wechselwirkungen12, 25 und Zellmigrationsverhalten13,14,15,16,

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wird unterstützt von NIH R21 AI143892, New Jersey Health Foundation Grant, Busch Biomedical Grant (KLE). Wir danken Madeleine Hu für ihre Unterstützung bei der Bearbeitung des Manuskripts und der Bereitstellung der in den repräsentativen Ergebnissen dargestellten Daten.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm dish, No. 1.5 CoverslipMatTekP35G-1.5-14-C
Alexa Fluor 633 HydrazideInvitrogenA30634
BD PrecisionGlide Hypodermic needles - 27 GThermo Fisher Scientific14-826-48
BD Slip Tip Sterile Syringe - 1 mLThermo Fisher Scientific14-823-434
BD Tuberculin SyringeThermo Fisher Scientific14-829-9
Dissecting scissorsThermo Fisher Scientific08-940
ElectrocauteryThermo Fisher Scientific50822501
Enclosed incubation chamberOKOLABMicroscope
Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord LengthRobozRS-7983-3
Hank's Balanced Salt SolutionSigma-Aldrich55037C
Hoechst 33342InvitrogenH3570
Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modulesBitplaneSoftware
Inverted DMi8LeicaMicroscope
IQ3 (v. 3.6.3)AndorSoftware
KetaminePutneyAnesthesia
KimwipesVWR21905-026
McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5 x 0.15 mm Straight SharpRobozRS-5600
Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black BraidedFisher ScientificNC0798934
Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2 mm TipRobozRS-5228
Puralube Vet OintmentDechraLubricating Eye Ointment
Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laserAndorConfocal system
XylazineAkornAnesthesia

Referenzen

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