אינטרטל הדמיה של לימפוציטים תוך-אפיתל במעי קטן מוריין

Summary

אנו מתארים שיטה כדי להמחיש gfp γδ iels התווית באמצעות הדמיה intravital של המעי הדק מורטין על ידי מיקרוסקופית הפוכה דיסק מיקרוסקופ קונפוקלית. טכניקה זו מאפשרת מעקב של תאים חיים בתוך רירית עד 4 h והוא יכול לשמש כדי לחקור מגוון של אינטראקציות מעיים החיסונית-אפיתל.

Abstract

לימפוציטים תוך-אפיתל המבטאת קולטן תא T γδ (γδ אל) לשחק תפקיד מפתח במעקב החיסונית של אפיתל המעי. בשל היעדר ליגולי מוחלט עבור קולטן התא γδ T, ההבנה שלנו של התקנה של γδ הפעלה של אל-על ותפקידם בvivo נשאר מוגבל. זה מחייבת את ההתפתחות של אסטרטגיות חלופיות לחקור משעולים איתות המעורבים בוויסות הפונקציה של γδ, ואת התגובה של תאים אלה למיקרו הסביבה המקומית. למרות γδ IELs מובנים באופן נרחב כדי להגביל טרנסלוקציה הפתוגן, השימוש הדמיה in, היה קריטי כדי להבין את הדינמיקה הרקתית של האינטראקציות של אל-האו אפיתל במצב יציב בתגובה פתוגנים פולשנית. בזאת, אנו מציגים פרוטוקול להמחיש התנהגות הנדידה של אל-אל ברירית המעי הקטן של העכבר הכתבת gfp γδ T באמצעות דיסק מסתובב הפוך מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית. למרות שעומק ההדמיה המקסימלי של גישה זו מוגבל ביחס לשימוש במיקרוסקופיה לייזר בשני הפוטונים, מיקרוסקופ לייזר מסתובב בדיסק מספק את היתרון של רכישת תמונה במהירות גבוהה עם הלבנת שיפור ו נזקי. באמצעות תוכנת ניתוח התמונה 4D, התנהגות מעקב התא T ואת האינטראקציות שלהם עם התאים השכנים ניתן לנתח בעקבות מניפולציה ניסיוני כדי לספק תובנה נוספת לתוך הפעלה ותפקוד של אל-על בתוך רירית המעי.

Introduction

לימפוציטים התוך-אפיתל (אל-על) נמצאים מתחת לאפיתל המעי, ומצויים הן לאורך קרום המרתף ובין תאי האפיתל הסמוכים בחלל הבין-תאי הרוחבי¹. יש כ-א. א. אחד עבור כל 5-10 תאים אפיתל; אלה IELs לשמש זקיפים כדי לספק מעקב החיסונית של המרחב הגדול של מכשול האפיתל המעי². IELs ביטוי קולטן התא γδ T (TCR) מהווים עד 60% של אוכלוסיית הכולל של אל. אל במעי הדק קטן. מחקרים ב γδ T-cell לקוי עכברים להפגין תפקיד המגן במידה רבה של תאים אלה בתגובה לפציעה במעיים, דלקת וזיהום^3,4,5. למרות הדור של העכבר הנוקאאוט Tcrd ⁶, ההבנה שלנו של ביולוגיה γδ, שנותרה מוגבלת בשל העובדה שליטרים המוכרים על-ידי הγδ tcr טרם זוהו⁷. כתוצאה מכך, חוסר כלים ללמוד את האוכלוסיה הסלולרית התקשה לחקור את התפקיד של γδ TCR הפעלה ותפקוד בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. כדי למלא פער זה, פיתחנו טכניקות הדמיה בשידור חי כדי להמחיש את התנהגות הנדידה הγδ של אל-על עם הסביבה השכנה כאמצעי כדי לספק תובנה נוספת לפונקציה γδ והיענות לגירויים חיצוניים בvivo.

במהלך העשור האחרון, הדמיה מעמיקה הרחיבה באופן משמעותי את הבנתנו את האירועים המולקולריים המעורבים בהיבטים מרובים של ביולוגיה של המעי, כולל תאים אפיתל הקזת⁸, ויסות פונקציית ההפרדה האפיתל^{9 ,10}, לדגימת תא מיאלואידית של תוכן של לומיאל^11,12, ואינטראקציות של חיידק מארח^{11,13,14,15,16} . במסגרת השימוש בביולוגיה של אל-על, שימוש במיקרוסקופיה באמצעות מיקרוטרטל מזיל אור על הדינמיקה הטמפורלית של אל-מדינת אל-עואו, והגורמים המאובטים את התנהגות המעקב שלהם^13,14,15, . ^{שישה עשרה} הפיתוח של TcrdH2BeGFP (tcrdegfp) כתבת עכברים, אשר תוויות γδ iels על ידי גרעיני הביטוי gfp¹⁷, גילה כי iels γδ הם מאוד נעים בתוך האפיתל והתערוכה התנהגות ייחודית מעקב היענות חיידקים . זיהום^17,13,14 לאחרונה, עוד γδ T העיתונאי הנייד פותחה (Tcrd-gdl) אשר מבטא gdl בציטופלסמה כדי לאפשר ויזואליזציה של התא כולו¹⁸. מתודולוגיה דומה שימש כדי לחקור את הדרישה של קולטני כימוקין ספציפיים, כגון G חלבון בשילוב קולטן (gpcr)-18 ו-55, על הדינמיקהשל אל. בהעדר כתב מיוחד לתאים, השתמשו בנוגדנים בעלי מראות פלורסנט כנגד CD8α שימשו להמחיש ולעקוב אחר "אל-לvivo" ב-^19,20. למרות מיקרוסקופ שני פוטון לייזר סריקה משמש בדרך כלל עבור הדמיה intravital, השימוש של הדיסק ספינינג מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית וקד מספק יתרונות ייחודיים כדי ללכוד מהירות גבוהה ברזולוציה גבוהה multi-channel תמונות עם רעש רקע מינימלי. טכנולוגיה זו היא אידיאלית כדי להבהיר את הדינמיקה הטמפורלית של אינטראקציות החיסון/אפיתל בתוך המיקרו-סביבה המורכבת של רירית המעי. יתר על כן, באמצעות שימוש במודלים שונים ו/או העכבר מודלים, מחקרים אלה יכולים לספק תובנה לתוך הוויסות המולקולרי של המעי החיסונית ו/או תא אפיתל התפקוד.

Protocol

כל המחקרים נערכו באגודה של הערכה והסמכה של מעבדה בעלי חיים טיפול (AALAC)-מתקן מוכר על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הספר הרפואי של רטגרס ניו ג'רזי רפואה השוואתית משאבים.

1. הכנת העכבר

הערה: ההליך הבא, כולל הכנה לבעלי חיים וניתוחים, ייקח 30 – 40 דקות לפני הניתוח, הפעל את המיקרוסקופ וחמם את החממה המצורפת במיקרוסקופ עד 37 ° c.

1. בצע ניסויים ב-8 – 10 שבועות עכברים מבית הספר על רקע C57BL/6, אשר התקבלו מ ברנרד Malissen (INSERM, פריז, צרפת). על פי ההליך המאושר IACUC, מורדם העכבר על ידי הזרקת כיתה של קטמין (120 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג/ק"ג) מבוסס על משקל החיה. הערכת רמת ההרדמה בקצב נשימה (55 – 65 נשימות לדקה)²¹, צביטה בבוהן וpalpebral רפלקס.
2. לאחר הרדמה המטוס הכירורגי הוא הגיע, לאבטח את הרגליים האחוריות של העכבר באמצעות קלטת למשטח חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף, אשר ניתן לפקח על ידי מד חום פי הטבעת. אם יש סימנים כי ההרדמה היא לובש (למשל, קצב נשימה מוגבר, מהבהב ו/או שריר העין תגובה מרעידה palpebral רפלקס), מחדש לניהול 50 μL של קטמין/xylazine בכל פעם עד העכבר הוא הרגעה לחלוטין.
3. להכין את הצבע הגרעיני על ידי דילול 50 μL של Hoechst 33342 (10 מ"ג/mL) עם 315 μL של 0.9% תמיסת מלח; הריכוז הסופי הוא 37.5 מ"ג/ק"ג מבוסס על משקל העכבר (200 כמות משוער μL). ברגע העכבר מורדם, לאט להזריק הופסט באמצעות מזרק טוברקולין דרך סינוס ורידי רטרו מסלולית.
   הערה: המתן 1 – 2 דקות לפני שתמשיך לשלב הבא כדי לאפשר לעכבר להפוך את השינוי במחזור הנפח הבאים רטרו מסלולית הזרקה.
4. מניחים כמות קטנה של חומר סיכה על העיניים כדי למנוע מהם להתייבש.

2. כירורגיה של העכבר: לפרוטומיה לחשוף רירית המעיים

1. לעשות חתך 2 ס מ אנכי דרך העור ואת צפק לאורך קו האמצע של הבטן התחתונה כדי להחצין את האזור של המעי להיות בתמונה.
2. באמצעות מלקחיים זוויתי, בזהירות למשוך את מעי מתוך חלל הצפק ולזהות את האזור של המעי הדק כדי להיות בתמונה. היזהרו לא לקרוע כלי דם מצע במהלך תהליך זה. כדי למזער נזק פוטנציאלי או דימום, להימנע לתפוס או צובט את המעי עם מלקחיים.
3. אתר אזור מתאים של המעי הדק (2 – 3 ס מ) עבור דימות המכיל תוכן מינימלי צואה. החזר בזהירות את המעי הגס ואת המעיים הקטנים הנותרים לחלל הצפק, תוך השארת קטע הריבית מוחלק.
   הערה: הימנע מלדרוך על המעי הסטום או לשבש את היום במהלך שלב זה.
4. מניחים שני זוגות של מלקחיים משני צדדיו של המצע המעי הבסיסית בין כלי הדם, ולשפשף בעדינות את קצות המלקחיים יחד כדי ליצור חור בקרום (איור 1)²². זה יאפשר המחט לעבור את המצע המעי כאשר סוגרים את החלל הצפק מתחת למעיים.
5. לסגור את החתך תוך שמירה על לולאה של המעי השפעה. באמצעות מלקחיים זוויתי מעוקל, המחט נקודת להתחדד מוצמד 5 ס מ תפר, לחדור צד אחד של צפק, לעבור דרך החור עשה בשלב הקודם, ומעלה דרך הצד השני של רירית הצפק. מניחים תפר אחד למעלה, ועוד. קרוב לתחתית החתך
   הערה: הימנע מפגיעה בכלי האורך במהלך שלב זה.
6. חזרו על תהליך זה כדי לסגור את העור מתחת לולאת המעי, על ידי הצבת תפר אחד באמצע החתך, בין התפרים הקודמים בצפק הבסיסית.
   הערה: חשוב רק להחצין את האזור שהוא ליצירת תמונה; פעולה זו תפחית את התנועה החיצוני במהלך ההדמיה. אל תדאג להמנע מקשירת. העורקים המסטרמיים
7. השתמשו בחשמלית כדי ליצור קו ניקוב לאורך הגבול האנטי-מסטראלי. מיד לאחר הצרוב, להחיל כמה טיפות מים על פני השטח של המעי כדי למנוע נזק נוסף רקמות המושרה. אבן חשופה בעלת מגבונים להסרת מים שיורית.
8. חותכים חתך אופקי קטן בקצה המרוחק של הרקמה הכאוגית באמצעות מספריים vannas ולהמשיך לחתוך לאורך הקו הצרוב לקראת הקצה הקרוב ביותר של פלח הרקמה המועבר (כ 1.5 ס מ אורך) כדי לחשוף את הרירית שטח.
   הערה: במקרה הצורך, השתמש מלקחיים כדי להסיר בעדינות את כל התוכן העודף בצואה שנותר על פני השטח החשוף של רירית.
9. לכסות את הבטן של העכבר עם קינגב לחות כדי למנוע את רקמת להיות מיובש. להעביר את העכבר למיקרוסקופ בתוך כלי מכוסה.

3. רכישת תמונה על ידי ספינינג מיקרוסקופיה דיסק מוקד

1. פיפטה 150 μL של 1 μM AlexaFluor 633 ב HBSS על שמיכות זכוכית התחתון של צלחת 35 mm. הצב את העכבר כך שפני השטח הפתוחים של רירית מגעים ישירות עם שובר הכיסויים.
2. להטות את הראש של המיקרוסקופ לאחור ולמקם את העכבר על הצלחת שמיכות על הבמה הדמיה בחממה טרום מחומם. לחלופין, לכסות את העכבר על ידי שמיכה חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף.
3. הפעל תוכנה לדימות. את עוצמת עירור ואת זמן החשיפה עבור כל לייזר לא יעלה על 10-15 mW או 120 – 150 ms, בהתאמה, כדי למנוע הלבנת ולמזער את המרווח בין נקודות זמן. כוונן את ממוצע המסגרת ל-"2" והפעל את פונקציית הרווח האלקטרו-ממדי כדי להפחית את רעשי הרקע. בחר בכיול האובייקטיבי 63 x כדי להבטיח את המדידה הנכונה של גודל הפיקסל.
   הערה: ההגדרות המפורטות לעיל אמורות לספק הפניה ראשונית, אך ישתנו בהתאם לתצורות המיקרוסקופ הבודדות.
4. שימוש 405 ננומטר לייזר ומטרת האוויר 20x, להמחיש את הגרעינים כדי לאתר שדה של villi כי חוסר תנועה מורגש או להיסחף בעין. הימנע מאזורים של התנועה העובדתית עקב נשימה, פריסטלזיס או פעימות לב.
5. באמצעות הסריקה XY, להקליט את קואורדינטת XY של שדה העניין ולעבור את טבילה הגליצרול 63 x המטרה.
6. ודא כי villi בשדה שנבחר הם יציבים על ידי רכישת תמונה חיה על ערוץ 405 ננומטר עד 1 דקות.
7. בזמן הרכישה של תמונה חיה על הערוץ 405 ננומטר, להתאים את המוקד כדי למצוא את המטוס האורתוגונלי ממש מתחת לקצה הווילי. לרכוש Z-ערימות החל מתחת בדיוק מתחת האפיתל עצה villous למטה villous עד קשה לפתור את גרעיני, כ 15 – 20 יקרומטר, באמצעות צעד 1.5 יקרומטר.
   הערה: כאשר הדמיה עם שלושה ערוצים (405, 488, 640 nm) באמצעות זמני חשיפה שתוארו לעיל, ניתן לרכוש את כל שלושת הערוצים ברציפות בסביבות 20 s מרווחי.
8. פתח את התוכנה במצב ניתוח, 3 – 5 דקות לאחר תחילת הרכישה, כדי לאשר את יציבות התמונה וγδ לתנועתיות אל-על. המשך לרכוש תמונות עבור 30 – 60 דקות עבור כל שדה של villi. שיא 2 – 3 שדות עבור כל עכבר. בזמן הדמיה, לפקח על העכבר כל 5 דקות.
   הערה: אם ההרדמה מתחיל להתפוגג, להשתמש מלקחיים כדי להדוף בעדינות את הצוואר של העכבר כדי לנהל 50 μL של קטמין/xylazine בכל פעם. המשיכו לנטר רמות הרדמה וניהול מחדש בעת הצורך.
9. לא מומלץ לצלם עכבר יחיד למשך יותר מ 4 h. לאחר רכישת תמונה הושלמה, להקריב את העכברים על ידי פריקה צוואר הרחם ואחריו החזה הדו.

4.4D ניתוח תמונות

1. ישירות לייבא קבצי הדמיה לתוכנת עיבוד 4D.
2. צור משטחים בודדים עבור iels ולומן, ולאחר מכן עקוב אחר המשטחים לאורך זמן תוך שימוש בפרמטרים המתוארים בטבלה 1 כהפניה ראשונית. עבור IELs, אפשר מפוצל לגעת באובייקטים באמצעות קוטר נקודת הזרע המצוין.
3. השתמש באלגוריתם המעקב האוטומטי כדי לקבוע את התנועתיות של אל. למרות שאלגוריתם המעקב מדויק יחסית, הכרחי לבדוק באופן חזותי מסלולים לכל אחד מאלה. אם מעקב אינו נכון, תקן אותו באמצעות הפקודה התנתק והתחבר תחת הכרטיסיה ערוך רצועות .
4. כדי לקבוע את המרחק מכל אל-אל לומן, בחר את משטח לומן ובצע פונקציית שינוי מרחק בתפריט כלי . כשתתבקש, בחר מחוץ למשטח. לאחר החישוב, השינוי במרחק יוצג כערוץ ה -4.
5. לסנן את העוצמה מינימום של הערוץ הרביעי כדי לבחור γδ iels כי הם בתוך המרחב התרבות לרוחב (LIS). ערך זה צריך להיות קרוב ל 15 μm, מבוסס על גובה של תא אפיתל טורי. האחוזים של סך γδ IELs בתוך טווח זה מדווחים כתדירות של IELs γδ ב-LIS.
6. לניתוח נוסף, לייצא נתונים סטטיסטיים כולל: מהירות המסלול של אל-על, מסלול הזחה, מעקב אחר יושר ואורך המסלול. לחלופין, ניתוח נתונים באמצעות מודול התצפית. בהתאם לניסוי, השג מדדים נוספים מהנתונים הנרכשים, כולל זמן לשכון באינטראקציות LIS או אל-האפיתל.

תוצאות

באמצעות דימות הדמיה של עכברים העיתונאי TcrdEGFP, יש לנו בעבר הראו כי IELs γδ התערוכה מעקב דינמי התנהגות, שבה הם מסיירים האפיתל על ידי מעבר לאורך קרום המרתף לתוך החלל הבינתאי לרוחב (LIS) באופן קבוע מדינה (איור 2, סרט 1).

גישה זו יכולה לשמש גם כדי להעריך כיצד עיכו...

Discussion

פיתוח טכניקות המיקרוסקופיה של הארגון סיפק הזדמנות חסרת תקדים לבחון את התארגנות משנה של מבנים תת-תאיים^8,9,22, אינטראקציות תא תאים^{12, 25} והתנהגות הנדידה של תאים^13,14,

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm dish, No. 1.5 Coverslip	MatTek	P35G-1.5-14-C
Alexa Fluor 633 Hydrazide	Invitrogen	A30634
BD PrecisionGlide Hypodermic needles - 27g	Thermo Fisher Scientific	14-826-48
BD Slip Tip Sterile Syringe - 1 ml	Thermo Fisher Scientific	14-823-434
BD Tuberculin Syringe	Thermo Fisher Scientific	14-829-9
Dissecting scissors	Thermo Fisher Scientific	08-940
Electrocautery	Thermo Fisher Scientific	50822501
Enclosed incubation chamber	OKOLAB		Microscope
Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length	Roboz	RS-7983-3
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	55037C
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules	Bitplane		Software
Inverted DMi8	Leica		Microscope
IQ3 (v. 3.6.3)	Andor		Software
Ketamine	Putney		Anesthesia
Kimwipes	VWR	21905-026
McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5X0.15mm Straight Sharp	Roboz	RS-5600
Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided	Fisher Scientific	NC0798934
Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2mm Tip	Roboz	RS-5228
Puralube Vet Ointment	Dechra		Lubricating Eye Ointment
Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser	Andor		Confocal system
Xylazine	Akorn		Anesthesia