Imagerie intravitale des lymphocytes intraépithéliales dans l'intestin grêle de Murine

Résumé

Nous décrivons une méthode pour visualiser gFP-étiquetée IELs utilisant l'imagerie intravitale de l'intestin grêle murine par microscopie confocale de disque de rotation inversée. Cette technique permet le suivi des cellules vivantes dans la muqueuse jusqu'à 4 h et peut être utilisée pour étudier une variété d'interactions intestinales immunisées-épithéliales.

Résumé

Les lymphocytes intraépithéliales exprimant le récepteur des lymphocytes T (IEL) jouent un rôle clé dans la surveillance immunitaire de l'épithélium intestinal. En partie à cause de l'absence d'un ligand définitif pour le récepteur des lymphocytes T, notre compréhension de la régulation de l'activation de l'IEL et de leur fonction in vivo reste limitée. Cela nécessite l'élaboration de stratégies alternatives pour interroger les voies de signalisation impliquées dans la régulation de la fonction IEL et la réactivité de ces cellules au microenvironnement local. Bien que les EI soient largement compris pour limiter la translocation des agents pathogènes, l'utilisation de l'imagerie intravitale a été essentielle pour comprendre la dynamique spatiotemporelle des interactions IEL/épithélial à l'état stable et en réponse aux agents pathogènes invasifs. Ici, nous présentons un protocole pour visualiser le comportement migratoire d'IEL dans la petite muqueuse intestinale d'une souris de journaliste de cellule T de GFP utilisant la microscopie focale focale de laser confocal de disque inversé. Bien que la profondeur maximale d'imagerie de cette approche soit limitée par rapport à l'utilisation de la microscopie à balayage laser à deux photons, la microscopie laser confocale du disque tournant offre l'avantage de l'acquisition d'images à haute vitesse avec un blanchiment de photoet et photodamage. À l'aide d'un logiciel d'analyse d'images 4D, le comportement de surveillance des lymphocytes T et leurs interactions avec les cellules voisines peuvent être analysés à la suite d'une manipulation expérimentale afin de fournir un aperçu supplémentaire de l'activation et de la fonction de l'IEL au sein de la muqueuse intestinale.

Introduction

Les lymphocytes intraépithéliales (IEL) sont situés dans l'épithélium intestinal, et se trouvent à la fois le long de la membrane du sous-sol et entre les cellules épithéliales adjacentes dans l'espace intercellulaire latéral¹. Il y a approximativement un IEL pour chaque 5-10 cellules épithéliales ; ces IEL servent de sentinelles pour assurer la surveillance immunitaire de la grande étendue de la barrière épithéliale intestinale². Les IEL exprimant le récepteur des lymphocytes T (TCR) représentent jusqu'à 60 % de la population totale d'IEL dans l'intestin grêle murine. Des études menées sur des souris déficientes en lymphocytes T démontrent un rôle largement protecteur de ces cellules en réponse à des lésions intestinales, à l'inflammation et à l'infection^3,4,5. Malgré la génération de lasouris Kok6 Tcrd , notre compréhension de la biologie IEL reste limitée en partie en raison du fait que les ligands reconnus par le TCR n'ont pas encore été identifiés⁷. En conséquence, le manque d'outils pour étudier cette population cellulaire a rendu difficile d'étudier le rôle de l'activation et de la fonction de TCR dans des conditions physiologiques et pathologiques. Pour combler cette lacune, nous avons mis au point des techniques d'imagerie en direct pour visualiser le comportement migratoire et les interactions avec les entéroocytes voisins comme un moyen de fournir un aperçu supplémentaire de la fonction ETL et de la réactivité aux stimuli externes in vivo.

Au cours de la dernière décennie, l'imagerie intravitale a considérablement élargi notre compréhension des événements moléculaires impliqués dans de multiples facettes de la biologie intestinale, y compris l'excrétion épithéliale des cellules⁸, régulation de la fonction de barrière épithéliale^{9 ,10}, échantillonnage de cellules myéloïdes du contenu luminal^11,12, et les interactions hôte-microbe^{11,13,14,15,16} . Dans le contexte de la biologie IEL, l'utilisation de la microscopie intravitale a mis en lumière la dynamique spatiotemporale de la motilité IEL et les facteurs de médiation de leur comportement de surveillance^{13,14,15, 16}. Le développement de souris reporter TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP), qui étiquettes IELs par l'expression gFP nucléaire¹⁷, a révélé que les IEL sont très motiles dans l'épithélium et présentent un comportement de surveillance unique qui est sensible aux microbiens infection^17,13,14. Récemment, une autre souris de journaliste de cellule T a été développée (Tcrd-GDL) qui exprime GFP dans le cytoplasme pour permettre la visualisation de la cellule entière¹⁸. Une méthodologie similaire a été utilisée pour étudier l'exigence de récepteurs spécifiques de chimiokine, tels que les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR)-18 et -55, sur la dynamique de la motilité IEL^19,20. En l'absence d'un journaliste spécifique à une cellule, des anticorps conjugués fluorescents contre cD8 ont été utilisés pour visualiser et suivre la motilité IEL in vivo^19,20. Bien que la microscopie à balayage laser à deux photons soit couramment utilisée pour l'imagerie intravitale, l'utilisation de la microscopie laser confocale de disque tournant offre des avantages uniques pour capturer des images multicanaux à haute vitesse et à haute résolution avec un bruit de fond minimal. Cette technologie est idéale pour élucider la dynamique spatiotemporelle des interactions immunitaires/épithéliales dans le microenvironnement complexe de la muqueuse intestinale. En outre, grâce à l'utilisation de divers modèles transgéniques et/ou de souris knock-out, ces études peuvent fournir un aperçu de la régulation moléculaire de la fonction immunitaire intestinale et/ou épithéliale.

Protocole

Toutes les études ont été menées dans une association de l'évaluation et de l'accréditation des soins aux animaux de laboratoire (AALAC) accrédité s'installation selon les protocoles approuvés par Rutgers New Jersey Medical School Comparative Medicine Resources.

1. Préparation de la souris

REMARQUE: La procédure suivante, y compris la préparation des animaux et la chirurgie, prendra 30 à 40 min. Avant la chirurgie, allumer le microscope et réchauffer l'incubateur fermé sur le microscope à 37 oC.

1. Effectuer des expériences sur des souris TcrdEGFP de 8 à 10 semaines sur un fond C57BL/6, obtenues auprès de Bernard Malissen (INSERM, Paris, France). Selon la procédure approuvée par l'IACUC, anesthésier la souris par injection de kétamine (120 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) en fonction du poids de l'animal. Évaluer le niveau d'anesthésie par le taux de respiration (55-65 respirations par minute)²¹, pincement d'orteil et réflexe palpebral.
2. Une fois l'anesthésie chirurgicale de plan est atteinte, fixer les pattes postérieures de la souris utilisant le ruban adhésif à un coussin chauffant pour maintenir la température de corps, qui peut être surveillée par le thermomètre rectal. S'il y a des signes que l'anesthésie s'estompe (p. ex., augmentation du taux de respiration, clignotement et/ou réponse de contraction des muscles oculaires au réflexe palpébral), réadministrer 50 l de kétamine/xylazine à la fois jusqu'à ce que la souris soit entièrement sédative.
3. Préparer le colorant nucléaire en diluant 50 ll de Hoechst 33342 (10 mg/mL) avec 315 l de 0,9 % salin; la concentration finale est de 37,5 mg/kg en fonction du poids de la souris (volume approximatif de 200 lL). Une fois que la souris est anesthésié, injectez lentement le Hoechst à l'aide d'une seringue de tubercumine à travers le sinus veineux rétro-orbital.
   REMARQUE: Attendez 1/2 min avant de passer à l'étape suivante pour permettre à la souris de s'acclimater au changement de volume circulant après l'injection rétro-orbitale.
4. Placez une petite quantité de lubrifiant sur les yeux pour les empêcher de se dessécher.

2. Chirurgie de la souris: Laparotomie pour exposer muqueuse intestinale

1. Faire une incision verticale de 2 cm à travers la peau et le péritoine le long de la ligne médiane du bas-ventre pour externaliser la région de l'intestin à être photographié.
2. À l'aide de forceps inclinés, retirez soigneusement le cecum de la cavité péritonéale et identifiez la zone de l'intestin grêle à imager. Veillez à ne pas déchirer les vaisseaux sanguins mésentériques au cours de ce processus. Pour minimiser les dommages ou les saignements potentiels, évitez de saisir ou de pincer l'intestin avec les forceps.
3. Localiser une région appropriée de l'intestin grêle (2 à 3 cm) pour l'imagerie qui contient un contenu fécal minimal. Retournez soigneusement le cecum et le reste de l'intestin grêle dans la cavité péritonéale, tout en laissant le segment d'intérêt externalisé.
   REMARQUE: Évitez de perforer le cecum ou de perturber la vascularisation mésentérique pendant cette étape.
4. Placez deux paires de forceps de chaque côté de la mésenterie sous-jacente entre les vaisseaux sanguins, et frottez doucement les extrémités des forceps ensemble pour créer un trou dans la membrane (Figure 1)²². Cela permettra à l'aiguille de passer à travers la mésenterie lors de la fermeture de la cavité péritonéale sous l'intestin.
5. Fermer l'incision tout en gardant la boucle de l'intestin externalisé. À l'aide de forceps inclinés et d'une aiguille à pointe s'effilochée fixée à une suture de 5 cm, pénétrer un côté du péritoine, passer par le trou fait dans l'étape précédente, et jusqu'à l'autre côté de la doublure péritonéale. Placez une suture en haut, et une autre près du fond de l'incision.
   REMARQUE: Évitez d'endommager la vascularisation pendant cette étape.
6. Répétez ce processus pour fermer la peau sous la boucle intestinale, en plaçant une suture au milieu de l'incision, entre les sutures précédentes dans le péritoine sous-jacent.
   REMARQUE: Il est important de ne faire qu'extérioriser la zone qui doit être représentée; ceci réduira le mouvement d'extra-industrie pendant l'imagerie. Assurez-vous d'éviter de lier les artères mésentériques.
7. Utilisez une électrocautérisation pour faire une ligne de perforation le long de la frontière anti-mésentérique. Immédiatement après la cautérisation, appliquez quelques gouttes d'eau à la surface de l'intestin pour éviter d'autres lésions tissulaires causées par la chaleur. Blot avec un Kimwipe pour enlever l'eau résiduelle.
8. Couper une petite éliture horizontale au bord distal du tissu cautérisé à l'aide de ciseaux Vannas et procéder à la coupe le long de la ligne cautérisée vers l'extrémité proximale du segment des tissus externalisés (environ 1,5 cm de longueur) pour exposer le muquale surface.
   REMARQUE: Si nécessaire, utilisez des forceps pour enlever délicatement tout excès de matières fécales restant sur la surface muqueuse exposée.
9. Couvrez l'abdomen de la souris d'un Kimwipe humide pour éviter que le tissu ne se déshydrate. Transportez la souris au microscope dans un récipient couvert.

3. Acquisition d'image par Spinning Disk Confocal Microscopy

1. Pipette 150 l de 1 M AlexaFluor 633 en HBSS sur le fond en verre glissé du fond d'un plat de 35 mm. Placez la souris de sorte que la surface muqueuse ouverte entre directement en contact avec le bordereau.
2. Inclinez la tête du microscope vers l'arrière et placez la souris sur le plat couvert sur la scène d'imagerie dans un incubateur pré-chauffé. Sinon, couvrez la souris d'une couverture chauffante pour maintenir la température corporelle.
3. Lancer un logiciel d'imagerie. L'intensité d'excitation et le temps d'exposition de chaque laser ne doivent pas dépasser 10 à 15 mW ou 120 à 150 m, respectivement, afin d'éviter le photoblanchiment et de minimiser l'intervalle entre les points de temps. Ajustez la moyenne du cadre à « 2 » et activez la fonction de gain EM pour réduire le bruit de fond. Sélectionnez l'étalonnage objectif 63x pour assurer la mesure correcte de la taille des pixels.
   REMARQUE: Les paramètres détaillés ci-dessus sont destinés à fournir une référence initiale, mais varient en fonction des configurations de microscope individuels.
4. À l'aide du laser 405 nm et de l'objectif d'air 20x, visualisez les noyaux pour localiser un champ de villosités qui n'ont pas de mouvement notable ou de dérive par les yeux. Évitez les zones de mouvement artifactual due à la respiration, péristaltisme ou le rythme cardiaque.
5. À l'aide de l'analyse XY, enregistrez la coordonnées XY du champ d'intérêt et passez à l'objectif d'immersion de glycérol 63X.
6. Confirmez que les villosités dans le champ sélectionné sont stables en acquérant une image en direct sur le canal de 405 nm jusqu'à 1 min.
7. Tout en acquérant une image en direct sur le canal 405 nm, ajuster la mise au point pour trouver le plan orthogonal juste en dessous de la pointe villous. Acquérir des z-piles à partir de l'épithélium pointe villous bas de la villus jusqu'à ce qu'il soit difficile de résoudre les noyaux, environ 15-20 'm, en utilisant une étape de 1,5 m.
   REMARQUE: Lors de l'imagerie avec trois canaux (405, 488, 640 nm) en utilisant les temps d'exposition décrits ci-dessus, il est possible d'acquérir les trois canaux séquentiellement à environ 20 s intervalles.
8. Ouvrez le logiciel en mode d'analyse, 3 à 5 min après le début de l'acquisition, afin de confirmer la stabilité de l'image et la motilité IEL. Continuer à acquérir des images pour 30 à 60 min pour chaque champ de villosité. Enregistrez 2 à 3 champs pour chaque souris. Pendant l'imagerie, surveillez la souris toutes les 5 min.
   REMARQUE: Si l'anesthésie commence à s'estomper, utilisez des forceps pour frotter doucement le cou de la souris afin d'administrer 50 ll de kétamine/xylazine à la fois. Continuer à surveiller les niveaux d'anesthésie et réadministrer si nécessaire.
9. Il n'est pas conseillé d'imager une seule souris pendant plus de 4 h. Une fois l'acquisition d'image est complète, sacrifiez les souris par dislocation cervicale suivie du pneumothorax bilatéral.

4. Analyse 4D des images

1. Importez directement des fichiers d'imagerie vers un logiciel de rendu 4D.
2. Créez des surfaces individuelles pour les IEL et le lumen, puis suivez les surfaces au fil du temps en utilisant les paramètres décrits dans le tableau 1 comme référence initiale. Pour les IEL, activez le toucher fractionné d'objets à l'aide du diamètre du point de semence indiqué.
3. Utilisez l'algorithme de suivi autorégressif pour déterminer la motilité IEL. Bien que l'algorithme de suivi soit relativement précis, il est impératif d'inspecter visuellement les pistes pour chaque IEL individuel. Si une piste est incorrecte, corrigez-la en utilisant les fonctions Déconnecter et connecter sous l'onglet Edit Tracks.
4. Pour déterminer la distance entre chaque IEL et le lumen, sélectionnez la Surface lumen et effectuez la fonction de transformation de distance dans le menu Outil. Lorsque vous êtes invité, sélectionnez Surface extérieure. Une fois calculée, la transformation de distance s'affiche comme le 4ème canal.
5. Filtrer la min d'intensité du 4ème canal pour sélectionner les IEL qui se trouvent dans l'espace intercellulaire latéral (LIS). Cette valeur doit être proche de 15 m, en fonction de la hauteur d'une cellule épithéliale colonneaire. Le pourcentage total d'EIL dans cette plage est signalé comme la fréquence des IEL dans le LIS.
6. Pour une analyse plus approfondie, les données statistiques d'exportation, y compris : la vitesse de la voie IEL, le déplacement de la voie, la rectitude de la voie et la longueur de la voie. Vous pouvez également analyser les données à l'aide du module Vantage. Selon l'expérience, obtenir des mesures supplémentaires à partir des données acquises, y compris le temps d'habiter dans les interactions LIS ou IEL/épithélial.

Résultats

À l'aide de l'imagerie intravitale des souris reporter TcrdEGFP, nous avons déjà montré que les IEL présentent un comportement de surveillance dynamique, dans lequel ils patrouillent l'épithélium en migrant le long de la membrane du sous-sol et dans l'espace intercellulaire latéral (LIS) à stable état (Figure 2, Film 1).

Cette approche peut également être utilisée pour évaluer comment l'inhibition de voies de signalisation cellulaire...

Discussion

Le développement de techniques de microscopie intravitale a fourni une occasion sans précédent d'observer la réorganisation des structures subcellulaires^8,9,22, interactions cellule-cellule^{12, 25} et le comportement migratoire cellulaire^13,14,15,...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm dish, No. 1.5 Coverslip	MatTek	P35G-1.5-14-C
Alexa Fluor 633 Hydrazide	Invitrogen	A30634
BD PrecisionGlide Hypodermic needles - 27 G	Thermo Fisher Scientific	14-826-48
BD Slip Tip Sterile Syringe - 1 mL	Thermo Fisher Scientific	14-823-434
BD Tuberculin Syringe	Thermo Fisher Scientific	14-829-9
Dissecting scissors	Thermo Fisher Scientific	08-940
Electrocautery	Thermo Fisher Scientific	50822501
Enclosed incubation chamber	OKOLAB		Microscope
Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length	Roboz	RS-7983-3
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	55037C
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules	Bitplane		Software
Inverted DMi8	Leica		Microscope
IQ3 (v. 3.6.3)	Andor		Software
Ketamine	Putney		Anesthesia
Kimwipes	VWR	21905-026
McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5 x 0.15 mm Straight Sharp	Roboz	RS-5600
Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided	Fisher Scientific	NC0798934
Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2 mm Tip	Roboz	RS-5228
Puralube Vet Ointment	Dechra		Lubricating Eye Ointment
Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser	Andor		Confocal system
Xylazine	Akorn		Anesthesia