البكتيريا التي تحمل علامة الفلورسنت كجهاز تتبع للكشف عن مسارات جديدة لتدفق الكربون العضوي في النظم الإيكولوجية المائية

Summary

يُعرض هنا بروتوكول لتقنية أحادية الخلية، تقوم على الفحص المجهري لتحديد معدلات الرعي في اليوكاريوتس المفترسة المائية بدقة عالية ودقة تصنيفية.

Abstract

توضيح التفاعلات الغذائية، مثل predation وآثارها، هي مهمة متكررة لكثير من الباحثين في علم البيئة. دراسة المجتمعات الميكروبية لديها العديد من القيود، وتحديد الحيوانات المفترسة، فريسة، ومعدلات المفترسة غالبا ما يكون من الصعب. المعروضة هنا هي طريقة الأمثل على أساس إضافة فريسة وصفت الفلورسنت كتعقب، والذي يسمح لكمية موثوق بها من معدلات الرعي في eukaryotes المفترسة المائية وتقدير نقل المغذيات إلى مستويات أعلى من التغذية.

Introduction

prokaryotes Heterotrophic هي عنصر بيولوجي رئيسي في النظم المائية وتمثل جزءا كبيرا من الكتلة الحيوية العوالق^1،2،3. العوامل التي تتحكم في وفرة، والتنوع، والنشاط هي حاسمة لفهم دورها في الدراجات البيوجيوكيميائية (أي مصير الكربون العضوي والمواد الغذائية الأخرى وتدفق الطاقة من prokaryotes إلى مستويات أعلى من التغذية). الرعي البروتوزوان هو واحد من هذه العوامل الهامة. البكتيريا من nanoflagellates غير متجانسة وأهداب يفرض سيطرة قوية من أعلى إلى أسفل على وفرة prokaryotic، وظيفة المجتمع، وهيكل، والتنوع، وحتى مورفولوجيا الخلوية ومعدل النمو من مجموعات بكتيرية معينة^{4، 5,6}. في بعض النظم، وprotists بمثابة السبب الرئيسي للوفيات البكتيرية^6،7.

النهج القياسي المستخدم لتقييم بكتيريا البروتوزوان، التي استخدمت لبعض الوقت الآن، ينطوي على استخدام البكتيريا التي تحمل اسم الفلورسنت (FLB) كنظائر فريسة والفحص المجهري. ويمكن تحديد معدلات الانتفاعي الخاصة بالخلايا من خلال تحديد عدد جزيئات الفرائس المسماة في فراغ الأغذية البروتستانية على مدى دورة زمنية مختارة⁸. وهناك عدة مزايا لهذا النهج. يتم إضافة التتبع إلى العينات الطبيعية مع الحيوانات المفترسة الطبيعية وتجمعات الفرائس. هناك الحد الأدنى من التلاعب عينة قبل الحضانة، والحد الأدنى من تغيير العينة من قبل التتبع FLB المضافة، وأوقات الحضانة قصيرة لضمان النتائج السليمة التي تم الحصول عليها في ظل ظروف قريبة في الموقع. وبدلاً من ذلك، في البيئات التي تنقصها أعداد المناوجيين أو العوالق الحيوانية (مثل النظم البحرية البحرية البحرية)، يمكن الكشف عن معدلات اختفاء FLB المضافة إلى العينات بكميات منخفضة (2٪ -3٪ التتبع) عن طريق قياس التدفق في المدى الطويل (12-24 ساعة) تجارب الحضانة. ثم، يتم قياس أرقام FLB في نقاط البداية والنهاية (دمج تأثير جميع البكتيريا) عن طريق قياس التدفق (للاطلاع على التفاصيل، انظر المنشور السابق⁹). ومع ذلك، فإن هذه المعلمة لا تمثل سوى مجموع معدلات البكتيريا المجمعة التي لا يمكن أن تعزى مباشرة إلى أي مجموعات أو أنواع معينة من البروتستان والعوالق الحيوانية.

وبشكل عام، فإن التحديد الكمي لمعدلات الوفيات البكتيرية الخاصة بالأنواع البروتستانية أو النمط المورفي في البيئة المائية بدقة وبمعنى إيكولوجي يمكن أن يكون أمراً صعباً. بعض الرعاة هم رعاة انتقائية، وحجم وشكل الخلية من المتتبع FLB المضافة قد تشوه المعدلات الطبيعية من ابتلاع فريسة^10،11. وعلاوة على ذلك، نشاط بروتستان والتمثيل الغذائي هي درجة حرارة عالية حساسة^12; لذلك، فإن كمية التتبع FLB المضافة تحتاج إلى التلاعب بعناية لكل نوع عينة الفردية (ليس فقط على أساس وفرة الطبيعية، وحجم، ومورفولوجيا البكتيريا والأنواع السائدة من البكتيريا، ولكن أيضا على درجة الحرارة). وتركز معظم الدراسات على نشاط الرعي البروتستان يُدفع بالجملة؛ ومع ذلك، فإن بكتيريا أنواع معينة من البروتستان غالبا ما يحمل قيمة معلومات أعلى بكثير، وقد يكون من الأفضل. في هذه الحالة، هناك حاجة إلى المعرفة التصنيفية للأنواع البروتيست الموجودة في عينة وفهم سلوكهم. وبالتالي، هناك حاجة إلى كميات كبيرة من الوقت والعمل للحصول على نتائج سليمة على معدلات الأنواع الخاصة من البكتيريا التي تعزى إلى مجموعة أو أنواع معينة من البروتستان.

وعلى الرغم من هذه الصعوبات، لا يزال هذا النهج الأداة الأنسب المتاحة حاليا لتقييم بكتيريا البروتستان في البيئات الطبيعية. تُعرض هنا طريقة شاملة وسهلة المتابعة لاستخدام FLB كمتتبع في دراسات الإيكولوجيا الميكروبية المائية. وتُحسب جميع الجوانب الإشكالية المذكورة في هذا النهج، ويرد وصف لسير العمل المحسن، مع تجربتين من بيئات متناقضة، فضلا عن الأنواع المتناقضة من الهداب كأمثلة على ذلك.

وقد أجريت دراسة الحالة الأولى في بيئة epilimnetic من خزان المياه الموريموففي في الجمهورية التشيكية، والتي تبين وفرة الرعي والبكتيرية مماثلة لمعظم المسطحات السطحية للمياه العذبة (انظر^5و7). وقد أجريت دراسة الحالة الثانية في بيئة محددة للغاية داخل الفخاخ من النبات آكلة اللحوم المائية Utricularia reflexa، الذي يستضيف أعدادا عالية للغاية من كل من الهداب اتوافيك الرعي(Tetrahymena utriculariae) والخلايا البكتيرية. وتظهر حسابات معدلات الرعي الخاصة بالخلايا والمخزونات الدائمة البكتيرية في كلا النوعين من العينات. ثم تناقش مجموعة من التفسيرات الإيكولوجية للنتائج، ويقترح أخيرا أمثلة على دراسات المتابعة الممكنة.

Protocol

1. جمع عينة

1. جمع عينة مياه الخزان:دراسة الحالة الأولى (Exp I؛ نظام وفرة الحيوانات المفترسة والفرائس الطبيعية المنخفضة في الموقع)
   1. جمع عينات المياه من الموقع المطلوب في عمق مناسب. الاحتفاظ بالعينات في مبرد يتم التحكم في درجة حرارته مملوءة بدرجة حرارة في الموقع (تجنب صدمة درجة الحرارة؛ وتجدر الإشارة إلى أن معدلات امتصاص البروتيين تعتمد على درجة الحرارة) أثناء النقل إلى المختبر.
      ملاحظة: تم إجراء أخذ العينات لدينا في خزان ريموف على شكل الوادي المتوسط اليوريفي (بوهيميا الجنوبية، المجلد 34.5 × 10⁶ م^3،العمق الأقصى 43 م، متوسط وقت الاحتفاظ 100 يوم، ثنائي). ويقع موقع أخذ العينات على عمق 30 مترا، بالقرب من السد. تم جمع عينة مختلطة على عمق 0.5 متر من قبل عينات فريدنجر 2-l.
   2. تابع القسم 1-2 في أقرب وقت ممكن.
2. جمع السوائل من الفخاخ من النباتات الانعكاسية Utricularia آكلة اللحوم: دراسة الحالة الثانية (إكسب الثاني؛ نظام مع وفرة المفترس والفريسة عالية، حجم عينة صغيرة للغاية)
   1. يهز بلطف النباتات تحت الماء، وإزالة من حاوية زراعة، ووضعها على المواد ماصة لامتصاص المياه الزائدة. اعتمادا على متانة النباتات وحجم الفخاخ، واختيار 8-10 الأفراد النبات.
   2. تقسيم كل تبادل لاطلاق النار إلى أجزاء متساوية تقريبا عن طريق عد العقد ورقة تحمل أجهزة المحاصرين. كل قطعة تبادل لاطلاق النار سوف تعمل على جمع عينات مختلطة تمثل الشباب، في منتصف العمر، والفخاخ القديمة.
   3. قم بإرفاق قارورة زجاجية رقيقة وقارورة Eppendorf لجمع العينات بمضخة تمعجية. انتقل إلى إدراج طرف الشعرية في فتح فخ. باستخدام مضخة فراغ، تمتص كل السوائل من كل فخ حتى يتم جمع 900 ± 100 درجة مئوية من السائل فخ لكل فئة العمر فخ.
   4. استخدم عينات فرعية ثلاثية من 200 ميكرولتر من سائل الفخ المجمع لتجارب الرعي البروتستان. معالجة هذه على الفور على النحو المفصل في القسم 3. الحفاظ على ما تبقى ± 300 درجة مئوية من العينة لجميع التحليلات الأخرى للمكونات الميكروبية التي تعيش في السائل، على النحو المفصل أدناه (القسم 2).
   5. انتقل فورا ً إلى القسم 2

2. تثبيت العينات التي تم جمعها

1. Exp I and II: إصلاح عينات فرعية من الماء/الفخ للتعداد البكتيري (القسم 4؛ حوالي 20 مل و0.3 مل، على التوالي) مع الفورمالديهايد لمدة ساعة واحدة على الأقل للحصول على حجم نهائي 2%: تركيز الحجم في كل عينة.
   ملاحظة: التعامل مع الفورمالديهايد حصرا في غطاء محرك السيارة الدخان، وارتداء القفازات في جميع الأوقات في حين التلاعب العينات.

3. عينة الترشيح

1. تخفيف العينة (إكسب الأول): لا حاجة إلى تخفيف لعينات مياه الخزان. (إكسب 2): تمييع عينة السائل فخ 10x-100x مع المياه MQ خالية من الجسيمات لتحقيق توزيع مناسب للميكروبات المستهدفة على أسطح التصفية قبل العد عن طريق الفحص المجهري.
2. تصفية 1-2 مل (إكسب 1) من مياه الخزان أو 10-30 ميكرولتر (إكسب 2) من العينة الفرعية للسائل فخ للعد البكتيري على مرشحات سوداء 0.2 ميكرومتر حجم المسام، وذلك باستخدام قمع الترشيح (قطر 25 ملم).
3. وصمة عار المرشحات مع DAPI (4', 6-دياميدينو-2'-فينيليندول ثنائي هيدروكلوريد, 0.2% التركيز النهائي) لمدة 4 دقائق.
   ملاحظة: تجنب تلوث الجلد وسطح العمل، وارتداء القفازات.
4. ضع المرشح مع الميكروبات المركزة على قطرة من زيت الغمر (للميكروسكوب الفلورسنت) على شريحة المجهر. ضع قطرة زيت أخرى على مركز المرشح وغطيها بغطاء، مع التأكد من توزيع الزيت بالتساوي.
5. عند هذه النقطة، ويفضل معالجة العينات على الفور، أو بدلا من ذلك، تخزينها في الثلاجة (-20 درجة مئوية) لعدة أسابيع إلى أشهر حتى مزيد من التحليل.

4. تعداد الأرقام البكتيرية على المرشحات

1. ضع الشريحة تحت مجهر الظهارة (مع مجموعة فلتر المقابلة لDAPI الفلوروكروم). ضع شبكة عد 10 × 10 في أحد العين. نقل الشريحة إلى موضع عشوائي.
2. قياس الخلايا البكتيرية (الفلورة الزرقاء) في منطقة شبكة العد (تحت التكبير 1000x). في عمليات العد، قم بتضمين الخلايا التي تعبر الحواف اليسرى والعليا من شبكة العد، مع استبعاد الخلايا الموجودة عبر الحواف اليمنى والسفلية.
3. الانتقال إلى موضع عشوائي آخر وتكرار التعداد على شبكات العد 10-15 على الأقل، تصل إلى 500 خلية محسوبة في المجموع.
4. إنشاء عامل تحويل لمجهر معين والتكبير، استناداً إلى معرفة نسبة مساحة شبكة واحدة إلى إجمالي منطقة الترشيح الفعالة للمرشح. ثم، قم بتقسيم العدد الإجمالي للخلايا التي يتم حسابها بعدد الشبكات التي تم عدها، مما يؤدي إلى متوسط عدد البكتيريا لكل شبكة.
5. ضرب المعلمة الأخيرة بعامل التحويل الذي تم إنشاؤه وتطبيع العدد الناتج لكل مل من العينة (اعتماداً على حجم العينة التي تمت تصفيتها) للحصول على الوفرة البكتيرية الإجمالية لكل مل.

5. تحديد وفرة البروتستان

1. إصلاح عينة المياه (إكسب الأول) أو السائل فخ (إكسب الثاني) عينات فرعية مع إما الجلوتالارهايد (تركيز نهائي 1٪، وأكثر ملاءمة للعينات مع وجود الكلوروفيل تحتوي على الجسيمات التي سيتم معالجتها أيام إلى أسابيع بعد التثبيت) أو باستخدام تقنية إزالة لون formol-thiosulfate المحددة أدناه.
   ملاحظة: كلا تقنيات الحفظ منع egestion من المواد التي ابتلعها من vacuoles الغذاء من protists⁸.
2. فيما يتعلق بتقنية إزالة لون السولمول ثيوسلفات، أضف 100 ميكرولتر/1 ميكرولتر من محلول لوغول إلى 20 مل/200 ميكرولتر من العينة الفرعية للسوائل المائية/الفخ (إكسب I/إكسب 2، على التوالي).
3. اتبع على الفور مع إضافة 0.5 مل / 50 درجة مئوية من رسميين بورات المخزنة مؤقتا ثم 20 درجة مئوية / 2 ميكرولتر من 3٪ ثيوسولفات الصوديوم (إكسب I / إكسب الثاني، على التوالي).
   ملاحظة: ثيوسولفات الصوديوم decolorizes اللون الأصفر من Lugol لتمكين مراقبة الخلايا تحت المجهر الظهارة⁸.
4. تصفية حجم معروف من عينة (اعتمادا على عدد protists الهدف) على 1 ميكرومتر المسام حجم مرشحات البولي الأسود.
5. تقدير عدد الأنواع البروتية عن طريق عد ما لا يقل عن 200 خلية تحت التكبير 600x باستخدام شبكة العد (انظر أعلاه).
6. تقليل حجم العينة تحت فراغ في قمع الترشيح عن طريق فراغ منخفض إلى ما يقرب من 2 مل. ثم, الإفراج عن تحت الضغط وإضافة الفلوروكروم DAPI (4',6-دياميديينو-2-فينيليندول ثنائي هيدروكلوريد^13,0.2% التركيز النهائي) لمدة 2 دقيقة.

6- تحديد الهيكل المجتمعي للأهال في عينات العوالق

ملاحظة: المجتمعات الهليسية في موائل المياه العذبة متنوعة للغاية^{14،15،16،18،}وتصميمها المجهري هو التحدي. فرز المجموعات ciliate في النقابات الوظيفية^{10،14،16،17} يسمح لتحليل أكثر تفصيلا من مختلف مجموعات أهداب كبكتيريا البحرية.

1. تقييم بنية المجتمع من خلال الجمع بين ما يلي:
   1. عينات ملطخة DAPI في المجهرية epifluorescence (لتوطين الخلايا الهدبية مع الفلورة مشرق من النوى الكلي والجزئي من مختلف الأحجام ومورفولوجيا) جنبا إلى جنب مع استيعاب البكتيريا وصفت الفلورسنت (FLB⁸؛ للحصول على التفاصيل، انظر أدناه)، وتتبع قدرة الهداب اتال تتغذى على البكتيريا.
   2. مراقبة عينة حية في حالات مختارة^17،19. لمزيد من التفاصيل حول المناهج والمعايير المذكورة أعلاه المستخدمة لتجميع الهالات في فئات تصنيفية مختلفة، راجع المنشورات السابقة^16،17.
      ملاحظة: أشارت الدراسات المذكورة إلى أن من بين الأهداب، الأنواع المنتشرة من Stichotrichia (جنس الهالتريا وبيلاغوهالتريا)وOligotrichia (وهي Rimostrombidium spp.) هي أهم المستهلكين البحرية من العوالق البكتريولوجية في الغالبية العظمى من موائل المياه العذبة^10،17،18.

7- تقدير معدلات الرعي في الهدبية

1. حساب معدلات الاستفادة من الهداب على البكتيريا على أساس التغيرات في متوسط عدد التتبع [أي FLB⁸ لكل أهداب تتعلق وقت الحضانة (5-15 دقيقة)] وكمية التتبع من FLB وأضاف، مما يمثل على الأكثر ل 5٪ -15٪ من مجموع البكتيريا.
2. لمقارنة معدلات التناول بين مختلف الأنواع البروتستان، تطبيع معدلات التناول كما عدد البكتيريا لكل أهداب في الساعة، مع حسابات على أساس الوقت الحضانة الفعلية ونسبة التتبع FLB وأضاف.
   ملاحظة: يُصوَّر في الشكل 1المخطط العام لتطبيق طريقة FLB لتقدير معدلات البكتيريا الضخمة والخاصة بكل من الخلايا أو الأنواع في العينات الطبيعية.
3. إعداد FLB من السلالات البكتيرية الأصلية إلى بيئة المياه العذبة⁸
   1. حدد حجم مناسب (متوسط حجم الخلية = MCV) ومورفولوجيا البكتيريا بحيث تحاكي بشكل فعال الأحجام النموذجية للبكتيريا العوالق / الخلايا البكتيرية في النظام المائي الذي يجري التحقيق فيه.
      ملاحظة: بالنسبة للإكسب الأول، تم استخدام خليط من سلالات معزولة من موقع دراسة جنس Limnohabitans وPolynucleobacter (أي نموذجية، العوالق الجرثومية وفيرة للغاية في البحيرات والبرك)²⁰. لمزيد من التفاصيل حول مورفولوجيا وأحجام السلالات، انظر المنشورات السابقة^{3،17،18،21}.
   2. حصاد الخلايا البكتيرية من الثقافة عن طريق الطرد المركزي (5000 × ز)لمدة 15 دقيقة في مرحلة ثابتة في وقت مبكر ومزجها في نسبة عددية التي تنتج MCV ± SD من الخلايا في الخليط المقابل لMCV نموذجية من البكتيريا في الموقع المختار.
   3. تعليق الكريات في 10 مل من المالحة المخزنة الفوسفات (PBS؛ درجة الحموضة = 9).
   4. إضافة 2 ملغ من صبغ الفلورة الصفراء والخضراء 5-(4,6-ثنائي كلوروتريازين-2-yl) أمينوفلورسين (DTAF، يربط إلى البروتينات) إلى تعليق الخلية في العازلة الفوسفات المالحة، وحضانة في حمام المياه 60 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
   5. بعد الحضانة، الطرد المركزي الخلايا إلى أسفل، decant الحل DTAF، وغسل والطرد المركزي 3X مع PBS.
   6. بعد الغسيل النهائي، إعادة تعليق الخلايا في 20 مل من المخزن المؤقت PP_{i-المالحة.}
   7. دوامة تعليق FLB وماصة 1.5 مل aliquots في 2 مل قارورة التبريد، ثم الحفاظ على المجمدة (في -20 درجة مئوية) في PP_ط-المالحة العازلة حتى الاستخدام.
   8. قبل تصفية PP_{ط-المالحة}العازلة من خلال مرشح البولي 0.2m للاستخدام في الخطوة التالية.
   9. لتحديد تركيز FLB، نقل aliquot صغيرة (عادة 20-40 درجة مئوية) إلى 2 مل من الجسيمات خالية PP_{I-المالحة}العازلة، sonicate في 30 W لعدة رشقات نارية 2 ثانية، وتصفية على 0.2 ميكرومتر مرشح أسود البولي للتعداد عن طريق epifluorescenceence الفحص المجهري (1000X التكبير) تحت إعدادات التصفية البصرية لDTAF (448 نانومتر / 520-540 نانومتر).
4. تقنية التتبع لتقدير بكتيريا الهداب
   1. بالنسبة لتجارب الرعي في الموائل الطبيعية العوالقية، الاستغناء عن عينات 300 مل في قوارير 1 لتر مغسولة جيدا ً وحضانة في درجة حرارة الموقع لمدة 15 دقيقة (للسماح للبروتيين بالتعافي من صدمة المناولة).
   2. إضافة تتبع FLB لتشكيل 5٪ -15٪ من مجموع البكتيريا، مع المبالغ المضافة اعتمادا على الموسم ودرجة حرارة المياه.
      ملاحظة: هناك طيف واسع جداً يعتمد على الموسم في معدلات التناول بالأنواع الخاصة بالهالة التي تغطي عدة أوامر من الحجم (أي من 10^1-104 بكتيريا تهداب^-1 في الساعة)^{10،16، 17،18،22،23،24}.
   3. في فترات من البروز المعزز ة من الهدابات مع معدلات التحمل العالية (عادة خلال فصل الصيف)، كما تشغيل حضانة موازية مع إضافات FLB منخفضة جدا، مما يشكل فقط 2٪ -4٪ من مجموع البكتيريا لتجنب التحميل المفرط من الفراغات ciliate من قبل التتبع FLB (انظر أمثلة في الشكل 2).
   4. احتضان أهداب / العوالق عينات مع FLB لمدة 5-15 دقيقة.
   5. هناك احتمالان لتثبيت العينة لمنع egestion من المواد التي ابتلعها من vacuoles الغذاء من protists⁸. إنهاء الحضانة بإضافة 1٪ الجلوتالالديهايد (التركيز النهائي الذي هو أكثر ملاءمة للعينات مع الجسيمات التي تحتوي على الكلوروفيل، مثل الطحالب). بدلاً من ذلك، استخدم 100 ميكرولتر/10 ميكرولتر من محلول لوغول إلى 20 مل/200 ميكرولتر من عينة السوائل المائية/الفخ، تليها مباشرة إضافة 0.5 مل/10 ميكرولتر من رسميلين المخزنة ببورات ثم 200 ميكرولتر/2 ميكرولتر من 3% ثيوسولفات الصوديوم (إكسب I/إكسب الثاني، على التوالي).
5. بعد إضافة المثبت، والسماح للعينات بقية لمدة ساعة واحدة على الأقل في الظلام في 4 درجة مئوية لضمان الحفاظ على شامل للخلايا أهداب.
6. أخذ عينات فرعية من العوالق الطبيعية من 4-30 مل/10-30 ميكرول (إكسب I/إكسب 2، على التوالي؛ يعتمد الحجم على وفرة الهداب) ووصمة عار مع DAPI (التركيز النهائي 0.2٪ الوزن / المجلد؛ للاطلاع على التفاصيل، انظر الخطوة 3.2 أعلاه).
7. تمر من خلال 1 ميكرومتر مرشحات سوداء وتفقد عن طريق الفحص المجهري للعد ciliates (600x التكبير) وتعداد عدد تتبع FLB بلعها (في الغالب في التكبير 1000x) كما هو مفصل في المنشورات السابقة^2،17 . فحص العينات في غضون 7 أيام بعد الحفظ.
8. ولتقدير مجموع الرعي البروتوزوان/الأنواع الخاصة، اضرب متوسط معدلات التناول بجميع الهداب، أو الأنواع الهدبية فقط كما تم اكتشافها بوفرة في الموقع.
9. ويرد على النحو التالي مثال لحساب معدلات الاستهلاك لكل خلية من البيانات الموقعية من خزان مياه ريموف:
   1. افترض أن التركيز البكتيري هو 3.55 × 10⁶ بكتيريا / مل وتعقب FLB وأضاف هو 0.25 × 10⁶ FLB / مل، الذي ينتج مجموع 3.8 × 10⁶ بكتيريا / مل من مجموع الجسيمات البكتيرية (البكتيريا الطبيعية + FLB = 100٪ من جزيئات فريسة) المتاحة لعلماء البُتَوَتِّيِيّين في العينة الطبيعية.
      ملاحظة: تمثل أجهزة تتبع FLB المضافة بالتالي 6.58% (مشروع 0.25/0.038) من إجمالي الجسيمات البكتيرية. متوسط عدد FLB لكل الرسن sp. هو 6.2 FLB في 5 دقائق الحضانة.
   2. لتطبيع التناول في الساعة، استخدم الحساب التالي: (6.2 × 12)/(6.58/100) = 1131 بكتيريا لكل خلية/ساعة من الهالتريا.
      ملاحظة: لمزيد من الأمثلة على توزيعات معدلات الإنقباق الفردية لـ Halteria sp. التي تم اكتشافها تحت درجات حرارة المياه المتغيرة، والمبالغ (كنسب مئوية) من تعقب FLB المضافة، وأوقات حضانة مختلفة مع FLB، راجع الشكل 3.

النتائج

مثال التجربة ركضت في خزان المياه Římov (بوهيميا الجنوبية، تشيكوسلوفاكيا)، وهو موقع طبيعي مع أقل الطبيعية في الموقع المفترس ووفرة فريسة. يتم الإبلاغ عن البيانات التمثيلية للأنواع الهدبية الشاملة الرسنة grandinella، وهو مرعى وفيرة وفعالة من البيكوالعوالق (<2 م) الجسيمات¹⁰

Discussion

فك التفاعل الغذائي في النظم المائية هو دائما تحديا²⁸، وخاصة في جداول العوالق نانو التي تنطوي على protists وفريستهم ، والبكتيريا. عندما يتعلق الأمر بمسارات امتصاص المواد الغذائية والقياس الكمي، فإن تطبيق الأساليب المستخدمة بنجاح في مستويات غذائية أعلى أقل من الممكن، وذلك بسبب ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2-µm pore-size filters	SPI supplies, https://www.2spi.com/	B0225-MB	Black, polycarbonate track etch membrane filters, diameter approprite for filtering apparatus used
5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluorescein (DTAF)	Any brand
Automatic pipettes with adjustable volumes	Any brand, various sizes
Centrifuge	22 000 x g
Cryovials	Any brand, 2 mL size
DAPI (4´,6-Diamidino-2´-phenylindole dihydrochloride)	Any brand		1 mg ml-1
Epiflorescence microscope	Magnification from 400 x up to 1000 x
	Filters appropriate for viewing in the DAPI and DTAF range
	Counting grid in one of the oculars
Filtering apparatus	Usually with a diameter of 25 mm
Formaldehyde	A brand for microscopy
Glutaraldehyde	A brand for microscopy
Immersion oil for microscopy	Specific oil with low fluorescence
Lugol´s solution	Any brand or see comment		Make an alkaline Lugol' solution as follows: Solution 1 - dissolve  10 g of potassium iodide in 20 ml in MQ water, then add 5 g of iodine. Solution 2 - add 5 g of sodium acetate  to 50 ml of MQ water. Add the solution 2 to the solution 1 and thoroughly mix
Methanol stabilized formalin	Any brand available for microscopy purposes
Microscope slides and cover slips	Any brand produced for microscopy purposes
MQ water for diluting samples	Any brand
Phosphate-buffered saline (PBS; pH = 9)	Any brand		0.05 M Na2HPO4-NaCl solution, adjusted to pH 9
PPi-saline buffer	Any brand		0.02 M Na4P2O7-NaCl solution. Add 0.53 g Na4P2O7 to 100 ml of MQ water plus 0.85 g NaCl
Sampling device	Appropriate for obtaining representative sample		e.g. Friedinger sampler for lake plankton
Sodium thiosulfate solution	Any brand		3% solution is used in the protocol
Sonicator	Any brand		30 W
Vortex	Any brand allowing  thorough mixing of the solutes and samples
Water bath	Any brand allowing temperature to be maintained at 60 °C