Bactérias rotuladas fluorescently como um Tracer para revelar novas vias de fluxo de carbono orgânico em ecossistemas aquáticos

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para uma única célula, técnica baseada em microscopia de epifluorescência para quantificar as taxas de pastejo em eucariontes predatórios aquáticos com alta precisão e resolução taxonômica.

Resumo

Elucidar interações tróficas, como predação e seus efeitos, é uma tarefa frequente para muitos pesquisadores em ecologia. O estudo das comunidades microbianas tem muitas limitações, e a determinação de um predador, presa e taxas predatórias é muitas vezes difícil. Aqui apresentamos um método otimizado com base na adição de presas rotuladas fluorescentamente como traçador, o que permite quantificar de forma confiável as taxas de pastejo em eucariontes predatórios aquáticos e estimar a transferência de nutrientes para níveis tróficos mais elevados.

Introdução

Os procariontes heterotróficos são um componente biológico fundamental nos sistemas aquáticos e respondem por uma fração significativa da biomassa plâncton^1,2,3. Fatores que controlam sua abundância, diversidade e atividade são cruciais para a compreensão de seu papel no ciclismo biogeoquímico (ou seja, o destino de carbono orgânico e outros nutrientes e fluxo de energia de procariontes a níveis tróficos mais elevados). O pastoreio de protozoan é um desses fatores importantes. Bacterivory de nanoflagelados e ciliados heterotróficas impõe um controle top-down forte sobre a abundância procarióticas, a função da Comunidade, a estrutura, a diversidade, e mesmo a morfologia celular e a taxa de crescimento de grupos bacterianos particulares^{4, 5,6}. Em alguns sistemas, os protistas servem como a principal causa de mortalidade bacteriana^6,7.

A aproximação padrão usada para avaliar o bacterivory do protozoário, que tem sido usada por algum tempo agora, envolve o uso de bactérias cDNAs etiquetadas (FLB) como análogos da rapina e microscopia do epifluorescência. As taxas de captação específicas de células podem ser determinadas quantificando o número de partículas de presas rotuladas em vacúolos de alimentos protistan ao longo de um curso de tempo selecionado⁸. Existem várias vantagens para esta abordagem. O Tracer é adicionado às amostras naturais com as assemblages naturais do predador e da rapina. Há uma manipulação mínima da amostra antes da incubação, alteração mínima da amostra pelo traçador FLB adicionado, e os tempos de incubação são curtos para garantir resultados sonoros obtidos em condições próximas a in situ. Alternativamente, em ambientes com baixo número de protistas bacterivorosos ou zooplâncton (por exemplo, sistemas marinhos offshore), as taxas de desaparecimento de FLB adicionadas a amostras em baixas quantidades (2%-3% traçador) podem ser detectadas via citometria de fluxo em longo prazo (12-24 h) experimentos de incubação. Em seguida, os números de FLB nos pontos inicial e final (integrando o impacto de todos os bacterivores) são quantificados por citometria de fluxo (para detalhes, ver publicação anterior⁹). No entanto, tal parâmetro representa apenas as taxas totais de bactérias agregadas que não podem ser diretamente atribuídas a qualquer grupo ou espécie de Grazer protistan e zooplâncton.

Em geral, a quantificação da espécie protistan-ou taxas de mortalidade bacteriana específicas do morphotype no ambiente aquático com precisão e com significado ecológico pode ser desafiador. Alguns protistas são pastosos seletivos, e o tamanho e a forma celular do traçador de FLB adicionado podem distorcer as taxas naturais de ingestão de presas^10,11. Além disso, a atividade e o metabolismo do protistan são altamente temperatura-sensível¹²; Conseqüentemente, a quantidade de Tracer adicionado de FLB precisa de ser manipulada com cuidado para cada tipo individual da amostra (não somente baseado na abundância, no tamanho, e na morfologia naturais de bactérias e em tipos prevalecentes de bacterivores, mas igualmente na temperatura). A maioria dos estudos centra-se na atividade de pastoreio protistan granel; no entanto, o bactermarfim de espécies específicas protistan muitas vezes detém um valor de informação muito maior e pode ser preferível. Neste caso, é necessário o conhecimento taxonômico das espécies de protistas presentes em uma amostra e compreensão de seu comportamento. Portanto, quantidades consideráveis de tempo e trabalho são necessárias para obter resultados sonoros sobre as taxas específicas de bactérias de bacterivoria atribuíveis a um determinado grupo ou espécie protistan.

Apesar destas dificuldades, esta aproximação permanece a ferramenta a mais apropriada atualmente disponível para avaliar o bacterivoria do protistan em ajustes naturais. Aqui apresentamos um método abrangente e fácil de seguir para o uso de FLB como traçador em estudos de ecologia microbiana aquática. Todos os aspectos problemáticos mencionados da abordagem são contabilizados e um fluxo de trabalho melhorado é descrito, com dois experimentos de ambientes contrastantes, bem como contrastantes espécies ciliadas como exemplos.

O primeiro estudo de caso foi conduzido em um ambiente epilimnetic do reservatório de água mesotrófico de římov na República Checa, que mostra o Grazer e as abundâncias bacterianas comparáveis à maioria de corpos de água doce de superfície (cf.^5,7). O segundo estudo de caso foi conduzido no ambiente altamente específico dentro das armadilhas da planta carnívoros aquática Utricularia reflexa, que hospeda números extremamente elevados de ambos os ciliados mixotróficas de pastoreio (utriculariae de Tetrahymena) e células bacterianas. Cálculos de taxas de pastejo específicas de células e estoques de pé bacteriano em ambos os tipos de amostra são mostrados. Uma escala de interpretações ecological dos resultados é discutida então, e os exemplos de estudos possíveis da continuação são sugeridos finalmente.

Protocolo

1. coleta de amostra

1. Coleta de amostra de água do reservatório: o primeiro estudo de caso (exp I; menor predador natural in situ e sistema de abundância de presas)
   1. Colete amostras de água do local desejado em uma profundidade adequada. Mantenha as amostras em um refrigerador temperatura-controlado enchido na temperatura in situ (evitando o choque da temperatura; deve notar-se que as taxas de captação de protistas são temperatura-dependentes) durante o transporte para o laboratório.
      Nota: nossa amostragem foi realizada no reservatório de Římov em forma de cânion meso-eutrófico (Boémia do Sul, volume 34,5 x 10⁶ m³, profundidade máxima de 43 m, tempo médio de retenção de 100 dias, dimicótico). O local de amostragem foi localizado a uma profundidade de 30 m, perto da barragem. Uma amostra misturada em uma profundidade de 0,5 m foi coletada por um amostrador de 2-l Friedinger.
   2. Continue até a seção 1,2 o mais rápido possível.
2. Coleta de fluido das armadilhas de plantas carnívoras de Utricularia reflexa: o segundo estudo de caso (exp II; um sistema com abundância de predadores e presas elevadas, volume de amostra extremamente pequeno)
   1. Agitar suavemente as plantas debaixo d' água, retire do recipiente de cultivo, e colocá-los em material absorvente para absorver o excesso de água. Dependendo da robustez das plantas e do tamanho das armadilhas, escolha 8-10 indivíduos da planta.
   2. Divida cada disparo em partes aproximadamente iguais contando os nós de folha que carregam órgãos de aprisionamento. Cada segmento de tiro servirá para coletar amostras mistas representando jovens, de meia-idade, e armadilhas antigas.
   3. Prenda um capilar de vidro fino e um frasco de Eppendorf para a coleção da amostra a uma bomba peristáltica. Proceder para inserir a ponta capilar na abertura da armadilha. Usando a bomba de vácuo, Sugar para fora todo o líquido de cada armadilha até 900 ± 100 μL do líquido da armadilha é coletado para cada categoria da idade da armadilha.
   4. Use subamostras de triplicado de 200 μl do líquido de armadilha agrupado para experimentos de pastoreio protistan. Processe estes imediatamente conforme detalhado na seção 3. Preservar o restante ± 300 μL da amostra para todas as outras análises de componentes microbianos que vivem no fluido, conforme detalhado abaixo (seção 2).
   5. Prossiga imediatamente para a seção 2.

2. fixação de amostras coletadas

1. Exp I e II: correção de subamostras de fluido de água/armadilha para enumeração bacteriana (seção 4; aproximadamente 20 mL e 0,3 mL, respectivamente) com formaldeído por pelo menos 1 h para obter um volume final de 2%: concentração de volume em cada amostra.
   Nota: Manuseie o formaldeído exclusivamente na capa das emanações e use luvas em todos os momentos durante a manipulação das amostras.

3. filtração da amostra

1. Diluição da amostra (exp I): nenhuma diluição é necessária para as amostras de água do reservatório. (Exp II): diluir a amostra de fluido de armadilha 10x-100x com água MQ sem partículas para alcançar uma distribuição adequada dos micróbios alvo em superfícies filtrantes antes da contagem através de microscopia de epifluorescência.
2. Filtrar 1-2 mL (exp I) da água do reservatório ou 10-30 μL (exp II) da subamostra do fluido de armadilha para contagem bacteriana em filtros pretos de tamanho de poros de 0,2 μm, usando um funil de filtração (25 mm de diâmetro).
3. Manchar os filtros com DAPI (4 ', 6-diamidino-2 '-phenylindole dihydrochloride, 0,2% concentração final) por 4 min.
   Nota: Evite a contaminação da pele e da superfície de trabalho e use luvas.
4. Coloque o filtro com micróbios concentrados sobre uma gota de óleo de imersão (para microscopia fluorescente) em uma lâmina de microscópio. Coloque outra gota de óleo sobre o centro do filtro e cubra com uma lamínula, certificando-se de que o óleo é distribuído uniformemente.
5. Neste ponto, de preferência processar amostras imediatamente, ou alternativamente, armazená-las no congelador (-20 ° c) por várias semanas a meses até uma análise mais aprofundada.

4. enumeração de números bacterianos nos filtros

1. Coloque o slide o microscópio de epifluorescência (com o conjunto de filtros correspondente ao fluorocromo DAPI). Coloque uma grade de contagem de 10 x 10 em um dos oculars. Mova o slide para uma posição aleatória.
2. Quantificar as células bacterianas (fluorescência azul) na área da grelha de contagem (sob a ampliação 1000x). Nas contagens, inclua as células cruzando as bordas esquerda e superior da grade de contagem, excluindo as localizadas nas bordas direita e inferior.
3. Mova para outra posição aleatória e repita a enumeração em pelo menos 10-15 grades de contagem, totalizando 500 células contabilizadas no total.
4. Estabelecer um fator de conversão para um determinado microscópio e ampliação, com base no conhecimento da razão da área de uma grade para a área de filtração efetiva total do filtro. Em seguida, divida o número total de células contados pelo número de grades contados, produzindo um número médio de bactérias por grade.
5. Multiplique o último parâmetro pelo fator de conversão estabelecido e normalizar o número resultante por ml de uma amostra (dependendo do volume da amostra filtrada) para obter a abundância bacteriana total por ml.

5. determinação da abundância protistan

1. Fixar a amostra de água (exp I) ou as subamostras de fluido de armadilha (exp II) com glutaraldeído (1% de concentração final, mais adequada para amostras com a presença de partículas contendo clorofila a serem processadas dias a semanas após a fixação) ou utilizando o técnica de descoloração de formol-tiossulfato especificada abaixo.
   Nota: ambas as técnicas de preservação impedem a egestion do material ingerido de vacúolos alimentares de protistas⁸.
2. Em relação à técnica de descoloração de formol-tiossulfato, adicionar 100 μL/1 μL de solução de Lugol em 20 mL/200 μL da subamostra de fluido de água/armadilha (exp I/exp II, respectivamente).
3. Seguir imediatamente com a adição de 0,5 mL/50 μL de formalina tamponada em borato e, em seguida, 20 μL/2 μL de tiossulfato de sódio a 3% (exp I/exp II, respetivamente).
   Nota: o tiossulfato de sódio descoloração a cor amarela de Lugol para possibilitar a observação de células o microscópio de epifluorescência⁸.
4. Filtre um volume conhecido de amostra (dependendo do número de protistas de destino) em filtros de policarbonato preto de tamanho de poros de 1 μm.
5. Estimar o número de espécies de protistas é contando pelo menos 200 células ampliação 600x usando a grade de contagem (ver acima).
6. Reduza o volume da amostra um vácuo no funil da filtração pelo baixo vácuo a aproximadamente 2 mL. Em seguida, solte a subpressão e adicione o DAPI fluorocromo (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole dicloridrato de¹³, 0,2% concentração final) por 2 min.

6. determinação da estrutura comunitária dos ciliados em amostras de plâncton

Nota: comunidades ciliate em habitats de água doce são altamente diversificadas^{14,15,16, 18}, e sua determinação microscópica é desafiador. A classificação dos grupos ciliados em guildas funcionais^{10,14,16,17permite uma} análise mais detalhada dos diferentes grupos ciliados como bacterivores pelágicos.

1. Avalie a estrutura da Comunidade ciliate combinando o seguinte:
   1. Amostras de DAPI-manchadas na microscopia do epifluorescência (para localizar as pilhas ciliate com fluorescência brilhante de macro-e micronúcleos de tamanhos e de morfologia diferentes) combinadas com a tomada de bactérias cDNAs marcadas (FLB⁸; para detalhes, Veja abaixo), controlando a capacidade dos ciliados de se alimentar de bactérias.
   2. Observação da amostra ao vivo em casos selecionados^17,18. Para obter mais detalhes sobre as abordagens e os critérios acima utilizados para o agrupamento de ciliados em diferentes categorias taxonômicas, ver publicações anteriores^16,17.
      Nota: estudos citados indicaram que entre os ciliados, espécies onívoras de Stichotrichia (gêneros halteria e Pelagohalteria) e oligotrichia (ou seja, rimostrombidium spp.) são os consumidores pelágicos mais importantes da bacterioplâncton na grande maioria dos habitats de água doce^10,17,18.

7. estimativa das taxas de pastejo ciliado

1. Calcule as taxas de captação de ciliados em bactérias com base em mudanças no número médio de traçador [i.e., FLB⁸ por Ciliato relacionado ao tempo de incubação (5-15 min)] e quantidade traçada de FLB adicionado, contabilizando no máximo 5%-15% do total de bactérias.
2. Para comparar as taxas de captação entre as diferentes espécies de protistan, normalizar as taxas de captação como o número de bactérias por Ciliato por hora, com cálculos baseados no tempo real de incubação e proporção do traçador FLB adicionado.
   Nota: o esquema geral da aplicação do método FLB para estimar as taxas de bactérias específicas de células ou espécies e a granel em amostras naturais é representado na Figura 1.
3. Preparação de FLB de cepas bacterianas nativas de um ambiente de água doce⁸
   1. Selecione um tamanho adequado (volume celular médio = MCV) e morfologia das bactérias para que eles efetivamente imitam os tamanhos típicos de bacterioplâncton/células bacterianas no sistema aquático que está sendo investigado.
      Nota: para exp I, utilizou-se uma mistura de cepas isoladas do local de estudo do gênero Limnohabitans e Polynucleobacter (isto é, bacterioplâncton típico, altamente abundante em lagos e lagoas)²⁰. Para detalhes sobre morfologia e tamanhos das cepas, ver publicações anteriores^3,17,18,21.
   2. Colher células bacterianas da cultura por centrifugação (5.000 x g) por 15 min na fase estacionária precoce e misturá-las em uma proporção numérica que produz MCV ± DP das células na mistura correspondente ao MCV típico de bactérias no local escolhido.
   3. Suspender os pellets em 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS; pH = 9).
   4. Adicionar 2 mg do corante fluorescente amarelo-verde 5-(4, 6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluoresceína (DTAF, liga-se às proteínas) à suspensão celular no tampão fosfato-salino, e incubar em um banho de água de 60 ° c por 2 h.
   5. Após a incubação, Centrifugue as células para baixo, decantar a solução DTAF, e lave e centrifugue 3x com PBS.
   6. Após a lavagem final, re-suspender as células em 20 mL do tampão PP_i-Saline.
   7. Vórtice da suspensão FLB e pipeta 1,5 mL alíquotas em 2 mL crio-frascos, em seguida, manter congelado (em-20 ° c) em PP_i-tampão salina até o uso.
   8. Pré-filtro PP_i-tampão Saline através de um filtro de policarbonato de 0,2 μm para uso na próxima etapa.
   9. Para determinar a concentração de FLB, transfira uma alíquota pequena (geralmente 20-40 μL) a 2 ml do amortecedor_i-Saline partícula-livre do PP, proceda em 30 W para diversas explosões de 2 s, e filtre no filtro do preto do policarbonato do μm 0,2 para a enumeração através da epifluorescência microscopia (1, 000X ampliação) configurações de filtro óptico para DTAF (448 nm/520-540 nm).
4. Técnica de traçador para estimativa de bactermarfim ciliado
   1. Para as experiências de pastoreio em habitats planctônicos naturais, dispense 300 ml de amostras em frascos de 1 L bem enxaguados e incubar na temperatura in situ durante 15 min (para permitir que os protistas se recuperem do choque de manuseamento).
   2. Adicionar traçadores FLB para constituir 5%-15% do total de bactérias, com os montantes adicionados dependendo da estação e temperatura da água.
      Nota: há um espectro muito largo, dependente da época em taxas de captação específicas de espécies ciliate abrangendo várias ordens de magnitude (ou seja, de 10¹-10⁴ bactérias ciliate^-1 por hora)^{10,16, 17,18,22,23,24}.
   3. Em períodos de maior ocorrência de ciliados com altas taxas de captação (geralmente durante o verão), também executam uma incubação paralela com adições de FLB muito baixas, constituindo apenas 2%-4% das bactérias totais para evitar o carregamento excessivo de vacúolos ciliados por traçador FLB (ver exemplos na Figura 2).
   4. Incubar amostras de ciliados/plâncton com FLB por 5-15 min.
   5. Há duas possibilidades para a fixação da amostra para impedir a egestion do material ingerido dos vacúolos do alimento dos protistas⁸. Encerre as incubações pela adição de 1% de glutaraldeído (concentração final que é mais adequada para amostras com partículas contendo clorofila, como algas). Alternativamente, use 100 μl/10 μL de solução de Lugol em 20 mL/200 μL de subamostra de fluido de água/armadilha, seguido imediatamente pela adição de 0,5 mL/10 μL de formalina tamponada em borato e, em seguida, 200 μL/2 μL de tiossulfato de sódio a 3% (exp I/exp II, respectivamente).
5. Após a adição do fixador, deixe as amostras descansar por pelo menos 1 h no escuro a 4 ° c para garantir a preservação completa das células ciliadas.
6. Tome subamostras de plâncton natural de 4-30 mL/10-30 μL (exp I/exp II, respectivamente; o volume depende da abundância de ciliate) e mancha com DAPI (concentração final 0,2% WT/vol; para detalhes, veja a etapa 3,2 acima).
7. Passe através de filtros pretos de 1 μm e inspecione através da microscopia de epifluorescência para contar ciliados (ampliação 600x) e enumerar o número de traçadores de FLB ingeridos (na maior parte na ampliação 1000x) como detalhado em publicações precedentes^2,17 . Inspecione amostras no prazo de 7 dias após a preservação.
8. Para estimar o pastejo total/espécies específicas, multiplicar as taxas médias de captação de todos os ciliados, ou apenas as espécies ciliadas detectadas pela abundância in situ.
9. O exemplo do cálculo das taxas de captação por célula de dados in situ do reservatório de água de Římov é descrito a seguir:
   1. Suponha que a concentração bacteriana é 3,55 x 10⁶ bactérias/ml e traçador FLB adicionado é 0,25 x 10⁶ FLB/ml, que produz uma soma de 3,8 x 10⁶ bactérias/ml de partículas bacterianas totais (bactérias naturais + FLB = 100% de partículas de presa) disponíveis para protistas fagotróficos na amostra natural.
      Nota: os traçadores de FLB adicionaram assim representam 6,58% (um projeto de 0.25/0.038) de partículas bacterianas totais. O número médio de FLB por Halteria SP. é 6,2 FLB em incubações de 5 min.
   2. Para normalizar a captação por hora, use o seguinte cálculo: (6,2 x 12)/(6.58/100) = 1131 bactérias por célula Halteria /h.
      Nota: para obter mais exemplos de distribuições de taxas de captação individuais de Halteria SP. detectadas temperaturas de água variáveis, quantidades (como percentuais) de traçador FLB adicionadas e diferentes épocas de incubação com FLB, ver Figura 3.

Resultados

Experimento de exemplo fui executado no reservatório de água de římov (Boémia do Sul, CZ), que é um local natural com menor predador natural in situ e abundância de presas. Os dados representativos são relatados para a espécie onívora do ciliate halteria grandinella, que é um Grazer abundante e eficiente do picoplâncton (< 2 μm) partículas^10,16,17,18

Discussão

Decifrar a interação trófica em sistemas aquáticos é sempre desafiador²⁸, especialmente nas escalas de nano-plâncton envolvendo protistas e suas presas, bactérias. Quando se trata de vias de captação de nutrientes e quantificação, a aplicação de métodos utilizados com sucesso em níveis tróficos mais elevados é menos possível, devido à alta complexidade das interações bióticas. Estes incluem, por exemplo, abordagens de rotulagem de isótopos estáveis. Este protocolo mostra as...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2-µm pore-size filters	SPI supplies, https://www.2spi.com/	B0225-MB	Black, polycarbonate track etch membrane filters, diameter approprite for filtering apparatus used
5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluorescein (DTAF)	Any brand
Automatic pipettes with adjustable volumes	Any brand, various sizes
Centrifuge	22 000 x g
Cryovials	Any brand, 2 mL size
DAPI (4´,6-Diamidino-2´-phenylindole dihydrochloride)	Any brand		1 mg ml-1
Epiflorescence microscope	Magnification from 400 x up to 1000 x
	Filters appropriate for viewing in the DAPI and DTAF range
	Counting grid in one of the oculars
Filtering apparatus	Usually with a diameter of 25 mm
Formaldehyde	A brand for microscopy
Glutaraldehyde	A brand for microscopy
Immersion oil for microscopy	Specific oil with low fluorescence
Lugol´s solution	Any brand or see comment		Make an alkaline Lugol' solution as follows: Solution 1 - dissolve  10 g of potassium iodide in 20 ml in MQ water, then add 5 g of iodine. Solution 2 - add 5 g of sodium acetate  to 50 ml of MQ water. Add the solution 2 to the solution 1 and thoroughly mix
Methanol stabilized formalin	Any brand available for microscopy purposes
Microscope slides and cover slips	Any brand produced for microscopy purposes
MQ water for diluting samples	Any brand
Phosphate-buffered saline (PBS; pH = 9)	Any brand		0.05 M Na2HPO4-NaCl solution, adjusted to pH 9
PPi-saline buffer	Any brand		0.02 M Na4P2O7-NaCl solution. Add 0.53 g Na4P2O7 to 100 ml of MQ water plus 0.85 g NaCl
Sampling device	Appropriate for obtaining representative sample		e.g. Friedinger sampler for lake plankton
Sodium thiosulfate solution	Any brand		3% solution is used in the protocol
Sonicator	Any brand		30 W
Vortex	Any brand allowing  thorough mixing of the solutes and samples
Water bath	Any brand allowing temperature to be maintained at 60 °C