Fluorescently etichettato batteri come un tracciante per rivelare nuovi percorsi di flusso organico di carbonio negli ecosistemi acquatici

Riepilogo

Presentato qui è un protocollo per una tecnica a singola cellula, basata sulla microscopia a epifluorescenza per quantificare i tassi di pascolo negli eucarioti predatori acquatici con alta precisione e risoluzione tassonomica.

Abstract

Chiarire le interazioni trofiche, come la predazione e i suoi effetti, è un compito frequente per molti ricercatori in ecologia. Lo studio delle comunità microbiche ha molte limitazioni, e determinare un predatore, preda, e tassi predatori è spesso difficile. Presentato qui è un metodo ottimizzato basato sull'aggiunta di prede fluorescenti etichettate come tracciante, che consente una quantificazione affidabile dei tassi di pascolo negli eucarioti predatori acquatici e la stima del trasferimento di nutrienti a livelli trofici più elevati.

Introduzione

I prokaryote eterotrofici sono una componente biologica chiave nei sistemi acquatici e rappresentano una frazione significativa di plancton biomassa^1,2^,3. I fattori che controllano la loro abbondanza, diversità e attività sono cruciali per comprendere il loro ruolo nel ciclismo biogeochimico (cioè il destino del carbonio organico e di altri nutrienti e il flusso di energia dai procarioti ai livelli più alti del trofico). Il pascolo protozoo è uno di questi fattori importanti. Bacterivoryo di nanoflagellati e ciliati eterotrofici impone un forte controllo dall'alto verso il basso sull'abbondanza procaritmica, funzione della comunità, struttura, diversità, e anche morfologia cellulare e tasso di crescita di particolari gruppi batterici^{4, 5,6}. In alcuni sistemi, i protisti servono come la principale causa di mortalità batterica^6,7.

L'approccio standard utilizzato per valutare il batterio protozoo, che è stato utilizzato da qualche tempo, prevede l'uso di batteri etichettati fluorescentmente (FLB) come analoghi prede e microscopia epifluorescenza. I tassi di assorbimento specifici delle cellule possono essere determinati quantificando il numero di particelle di prede etichettate nei vacuoli alimentari del Prozistan in un corso temporale selezionato⁸. Questo approccio presenta diversi vantaggi. Tracer viene aggiunto a campioni naturali con assemblaggi di predatori naturali e prede. C'è una manipolazione minima del campione prima dell'incubazione, un'alterazione minima del campione da parte del tracciante FLB aggiunto e i tempi di incubazione sono brevi per garantire risultati sonori ottenuti in condizioni vicine alle condizioni in situ. In alternativa, in ambienti con un basso numero di protisti batteriosi o zooplancton (ad esempio, sistemi marini offshore), i tassi di scomparsa di FLB aggiunti a campioni in quantità basse (2%-3% tracciante) possono essere rilevati tramite citometria di flusso a lungo termine (12-24 h) esperimenti di incubazione. Quindi, i numeri di FLB all'inizio e all'estremità (integrando l'impatto di tutti i batteri) sono quantificati dalla citometria di flusso (per i dettagli, vedi la precedente pubblicazione⁹). Tuttavia, tale parametro rappresenta solo i tassi totali di bacterivory aggregati che non possono essere direttamente attribuiti a particolari gruppi di pascoli o specie di protistan e zooplancton.

Nel complesso, quantificare con precisione e con significato ecologico i tassi di mortalità batterica specifici delle specie di prozie o del morfotipo nell'ambiente acquatico può essere difficile. Alcuni protisti sono pascoli selettivi, e la dimensione e la forma cellulare del tracciante FLB aggiunto può distorcere i tassi naturali di ingestione delle prede^10,11. Inoltre, l'attività e il metabolismo del prozistan sono altamente sensibili alla temperatura¹²; pertanto, la quantità di tracciante FLB aggiunto deve essere attentamente manipolata per ogni singolo tipo di campione (non solo in base all'abbondanza naturale, alle dimensioni e alla morfologia dei batteri e ai tipi prevalenti di batteri, ma anche sulla temperatura). La maggior parte degli studi si concentrano sull'attività di pascolo del protistan di massa; tuttavia, il batterio di specifiche specie protivazie spesso ha un valore informativo molto più elevato e può essere preferibile. In questo caso, è necessaria la conoscenza tassonomica delle specie protistiche presenti in un campione e la comprensione del loro comportamento. Di conseguenza, sono necessarie notevoli quantità di tempo e manodopera per ottenere risultati sonori su tassi specifici di batterio attribuibili a un particolare gruppo o specie di protistan.

Nonostante queste difficoltà, questo approccio rimane lo strumento più adatto attualmente disponibile per valutare il protivo in ambienti naturali. Presentato qui è un metodo completo e facile da seguire per l'utilizzo di FLB come tracciante negli studi di ecologia microbica acquatica. Tutti gli aspetti problematici menzionati dell'approccio sono presi in considerazione e viene descritto un flusso di lavoro migliorato, con due esperimenti da ambienti contrastanti e specie di ciliato a contrasto come esempi.

Il primo caso di studio è stato condotto in un ambiente epiliminico dal serbatoio di acqua mesotrofica di zmov nella Repubblica Ceca, che mostra abbondanze di pascolo e batteri comparabili alla maggior parte dei corpi d'acqua dolce di superficie (cfr^5,7). Il secondo caso di studio è stato condotto nell'ambiente altamente specifico all'interno di trappole della pianta carnivora acquatica Utricularia reflexa, che ospita un numero estremamente elevato di entrambi i ciliati mixotrofici al pascolo (Tetrahymena utriculariae) cellule batteriche. Vengono mostrati i calcoli dei tassi di pascolo specifici delle cellule e delle scorte permanenti batteriche in entrambi i tipi di campione. Viene quindi discussa una serie di interpretazioni ecologiche dei risultati e vengono infine suggeriti esempi di possibili studi di follow-up.

Protocollo

1. Raccolta di campioni

1. Raccolta del campione di acqua del serbatoio: il primo caso di studio (Exp I; basso ambiente in situ predatore e sistema di abbondanza di prede)
   1. Raccogliere i campioni d'acqua dalla posizione desiderata ad una profondità adeguata. Conservare i campioni in un dispositivo di raffreddamento a temperatura controllata riempito a temperatura situ (evitando lo shock della temperatura; va notato che i tassi di assorbimento dei protisti sono dipendenti dalla temperatura) durante il trasporto in laboratorio.
      NOTA: Il nostro campionamento è stato condotto nel serbatoio di zourov a forma di canyon meso-eutrofica (Boemia meridionale, volume 34,5 x 10⁶ m³, profondità massima 43 m, tempo medio di ritenzione 100 giorni, dimictico). Il sito di campionamento era situato ad una profondità di 30 m, vicino alla diga. Un campione misto a una profondità di 0,5 m è stato raccolto da un campionatore Friedinger 2-l.
   2. Proseguire fino alla sezione 1.2 il prima possibile.
2. Raccolta di liquidi dalle trappole delle piante carnivore Utricularia reflexa: il secondo caso di studio (Exp II; un sistema con elevata abbondanza di predatori e prede, volume campione estremamente ridotto)
   1. Scuotere delicatamente le piante sott'acqua, togliere dal contenitore di coltivazione e metterle su materiale assorbente per assorbire l'acqua in eccesso. A seconda della robustezza delle piante e delle dimensioni delle trappole, scegli 8-10 individui vegetali.
   2. Dividere ogni tiro in parti approssimativamente uguali contando nodi foglia cuscinetto organi intrappolamento. Ogni segmento di tiro servirà a raccogliere campioni misti che rappresentano trappole giovani, di mezza età e vecchie.
   3. Attaccare una sottile fiala di vetro e una fiala Eppendorf per la raccolta dei campioni in una pompa peristaltica. Procedere per inserire la punta capillare nell'apertura della trappola. Utilizzando la pompa a vuoto, aspirare tutto il fluido da ogni trappola fino a 900 x 100 l di fluido trappola viene raccolto per ogni categoria di età trappola.
   4. Utilizzare sottocampioni triplicati di 200 gradi l del fluido trappola raggruppato per esperimenti di pascolo protistan. Elaborarli immediatamente come descritto nella sezione 3. Conservare i restanti 300 l. del campione per tutte le altre analisi dei componenti microbici che vivono nel fluido, come descritto di seguito (sezione 2).
   5. Procedere immediatamente alla sezione 2.

2. Fissazione dei campioni raccolti

1. Exp I e II: fissare sottocampioni di acqua/fluido trap per l'enumerazione batterica (sezione 4; circa 20 mL e 0,3 mL, rispettivamente) con formaldeide per almeno 1 h per ottenere una concentrazione di volume:volume finale del 2% in ogni campione.
   NOTA: Maneggiare la formaldeide esclusivamente nella cappa dei fumi e indossare i guanti in ogni momento manipolando i campioni.

3. Filtrazione del campione

1. Diluizione del campione (Exp I): non è necessaria alcuna diluizione per i campioni di acqua del serbatoio. (Exp II): diluire il campione di fluido di trappola 10x-100x con acqua MQ priva di particelle per ottenere una distribuzione adeguata dei microbi bersaglio sulle superfici filtranti prima del conteggio tramite microscopia epifluorescenza.
2. Filtrare 1-2 mL (Exp I) dell'acqua del serbatoio o 10-30 -L (Exp II) del sottocampione del fluido trappola per il conteggio batterico su filtri neri da 0,2 m a dimensione dei pori, utilizzando un imbuto di filtrazione (diametro di 25 mm).
3. Macchiare i filtri con DAPI (4',6-diamidino-2'-phenylindole dihydrochlor, 0.2% concentrazione finale) per 4 min.
   NOTA: Evitare la contaminazione della pelle e della superficie di lavoro e indossare guanti.
4. Posizionare il filtro con microbi concentrati su una goccia di olio di immersione (per la microscopia fluorescente) su un vetrino del microscopio. Posizionare un'altra goccia d'olio al centro del filtro e coprire con un coperchio, assicurandosi che l'olio sia distribuito uniformemente.
5. A questo punto, preferibilmente i campioni di processo immediatamente, o in alternativa, conservarli in freezer (-20 gradi centigradi) per diverse settimane o mesi fino a ulteriori analisi.

4. Enumerazione dei numeri batterici sui filtri

1. Posizionare il vetrino al microscopio dell'epifluorescenza (con il filtro impostato corrispondente al DAPI fluorocro). Inserire una griglia di conteggio 10 x 10 in uno degli oculari. Spostare la diapositiva in una posizione casuale.
2. Quantificare le cellule batteriche (fluorescenza blu) nell'area della griglia di conteggio (sotto l'ingrandimento 1000x). Nei conteggi, includere le celle che attraversano i bordi sinistro e superiore della griglia di conteggio, escludendo quelle situate sui bordi destro e inferiore.
3. Passare a un'altra posizione casuale e ripetere l'enumerazione su almeno 10-15 griglie di conteggio, pari a 500 celle contate in totale.
4. Stabilire un fattore di conversione per un determinato microscopio e ingrandimento, basato sulla conoscenza del rapporto tra l'area di una griglia e l'area di filtrazione effettiva totale del filtro. Quindi, dividere il numero totale di cellule contate per il numero di griglie contate, producendo un numero medio di batteri per griglia.
5. Moltiplicare quest'ultimo parametro per il fattore di conversione stabilito e normalizzare il numero risultante per mL di un campione (a seconda del volume del campione filtrato) per ottenere l'abbondanza batterica totale per mL.

5. Determinazione dell'abbondanza del prozieno

1. Fissare il campione d'acqua (Exp I) o i sottocampioni del fluido trap (Exp II) con glutaraldeide (1% di concentrazione finale, più adatto per i campioni con presenza di particelle contenenti clorofilla da trattare giorni a settimane dopo la fissazione) o utilizzando il tecnica di decolorazione formol-thiosulfate specificata di seguito.
   NOTA: Entrambe le tecniche di conservazione impediscono l'egestione del materiale ingerito dai vacuoli alimentari dei protisti⁸.
2. Per quanto riguarda la tecnica di decolorazione formol-thiosulfate, aggiungete 100 l/1 di soluzione di Lugol in 20 mL/200 L del sottocampione del fluido acqua/trappola (rispettivamente Exp I/Exp II).
3. Seguire immediatamente con l'aggiunta di 0,5 mL/50 l di formalina con buffer borate, quindi 20 l/2 l del 3% di sodio thiosulphate (rispettivamente Exp I/Exp II).
   NOTA: Il tiosulfato di sodio decolora il colore giallo di Lugol per consentire l'osservazione delle cellule al microscopio a epifluorescenza⁸.
4. Filtrare un volume noto di campione (a seconda del numero di protisti bersaglio) su filtri in policarbonato nero di dimensioni di pori di 1 m.
5. Stimare il numero delle specie protistiche contando almeno 200 cellule sotto ingrandimento 600x utilizzando la griglia di conteggio (vedi sopra).
6. Ridurre il volume del campione sotto vuoto nell'imbuto di filtrazione con vuoto basso a circa 2 mL. Quindi, rilasciare la sottopressione e aggiungere il fluorocro DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochlor¹³, 0.2% concentrazione finale) per 2 min.

6. Determinazione della struttura comunitaria dei ciliati in campioni di plancton

NOTA: le comunità di ciliate in habitat d'acqua dolce sono molto diverse^14,15, 16^,18, e la loro determinazione microscopica è impegnativo. Ordinare i gruppi di ciliati in gilde funzionali^10,14,16,17 consente un'analisi più dettagliata di diversi gruppi di ciliati come batteriativori pelagici.

1. Valutare la struttura della comunità ciliate combinando quanto segue:
   1. Campioni macchiati DAPI nella microscopia a epifluorescenza (per localizzare le cellule ciliato con fluorescenza luminosa di macro e micronuclei di diverse dimensioni e morfologia) combinate con l'assorbimento di batteri fluorescenti etichettati (FLB⁸; per i dettagli, vedere sotto), tracciando la capacità dei ciliati di nutrirsi di batteri.
   2. Osservazione del campione dal vivo in casi selezionati^17,19. Per ulteriori dettagli sugli approcci e sui criteri di cui sopra utilizzati per raggruppare i ciliati in diverse categorie tassonomiche, vedere le pubblicazioni precedenti^16,17.
      NOTA: Studi citati hanno indicato che tra i ciliati, le specie onnivore della Sticofia (generazioni Halteria e Pelagohalteria)e Oligotrichia (vale a dire Rimostrombidium spp.) sono i più importanti consumatori pelagici di batterioplancton in una stragrande maggioranza degli habitat d'acqua dolce^10,17,18.

7. Stima dei tassi di pascolo delle ciliati

1. Calcolare i tassi di assorbimento dei ciliati sui batteri in base alle variazioni del numero medio di traccianti [cioè, FLB⁸ per ciliato relativo al tempo di incubazione (5-15 min)] e alla quantità di tracciante di FLB aggiunto, che rappresenta al massimo il 5%-15% dei batteri totali.
2. Per confrontare i tassi di assorbimento tra le diverse specie protivedi, normalizzare i tassi di assorbimento come il numero di batteri per ciliato all'ora, con calcoli basati sul tempo effettivo di incubazione e sulla proporzione del tracciante FLB aggiunto.
   NOTA: Lo schema generale dell'applicazione del metodo FLB per stimare sia i tassi di bacteridi di bacterivory specifici delle cellule o specie che quelli di bacteridi di massa in campioni naturali è illustrato nella Figura 1.
3. Preparazione di FLB da ceppi batterici indigeni in un ambiente d'acqua dolce⁸
   1. Selezionare una dimensione adatta (volume medio delle cellule e morfologia dei batteri) e la morfologia dei batteri in modo da imitare efficacemente le dimensioni tipiche delle cellule batterioplancton/batteriche nel sistema acquatico in fase di studio.
      NOTA: Per Exp I è stata utilizzata una miscela di ceppi isolati dalla posizione di studio del genere Limnohabitans e Polynucleobacter (cioè, tipico, batterioplancton altamente abbondante in laghi e laghetti)²⁰. Per informazioni dettagliate sulla morfologia e sulle dimensioni dei ceppi, vedere le pubblicazioni precedenti^3,17,18,21.
   2. Raccogliere le cellule batteriche dalla coltura per centrifugazione (5.000 x g) per 15 min nella prima fase stazionaria e mescolarle ad un rapporto numerico che produce MCV - SD delle cellule nella miscela corrispondente al tipico MCV dei batteri nella posizione scelta.
   3. Sospendere i pellet in 10 mL di salina con buffer fosfato (PBS; pH - 9).
   4. Aggiungere 2 mg del colorante fluorescing giallo-verde 5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluoresceina (DTAF, si lega alle proteine) alla sospensione cellulare nel tamponamento fosfato-salina, e incubare in un bagno d'acqua di 60 gradi centigradi per 2 h.
   5. Dopo l'incubazione, centrificare le cellule verso il basso, denegare la soluzione DTAF e lavare e centrifugare 3x con PBS.
   6. Dopo il lavaggio finale, sospendere nuovamente le cellulein 20 mL del tampone PP i-saline.
   7. Vorticare le sospensioni FLB e pipetta 1,5 mL aliquote in 2 mL crio-flacone, quindi mantenere congelati (a -20 ) in PP_i-saline buffer fino all'uso.
   8. Pre-filtro PP_i-saline buffer attraverso un filtro in policarbonato da 0,2 m da utilizzare nella fase successiva.
   9. Per determinare la concentrazione di FLB, trasferire un piccolo aliquota (di solito 20-40 L) a 2 mL di buffer PP_i-saline privo di particelle, sonicare a 30 W per diversi 2 s raffiche e filtrare su uno 0,2 m di filtro nero policarbonato per l'enumerazione tramite epifluorescenza microscopia (ingrandimento 1.000X) con le impostazioni del filtro ottico per DTAF (448 nm/520-540 nm).
4. Tecnica di tracciamento per la stima del bacterivory di ciliato
   1. Per gli esperimenti di pascolo in habitat planctonici naturali, erogare campioni da 300 mL in flaconi da 1 L ben risciacquati e incubare a temperatura in situ per 15 min (per consentire ai protisti di riprendersi dallo shock di movimentazione).
   2. Aggiungere i traccianti FLB per costituire il 5%-15% dei batteri totali, con le quantità aggiunte a seconda della stagione e della temperatura dell'acqua.
      NOTA: C'è uno spettro molto ampio, dipendente dalla stagione nei tassi di assorbimento specifici delle specie di ciliato che coprono diversi ordini di grandezza (cioè, da 10¹-10⁴ batteri ciliati^-1 all'ora)^{10,16, 17,18,22,}23^,24.
   3. Nei periodi di maggiore occorrenza di ciliati con alti tassi di assorbimento (di solito durante l'estate), eseguire anche un'incubazione parallela con aggiunte FLB molto basse, costituendo solo il 2%-4% dei batteri totali per evitare un carico eccessivo di vacuoli di ciliato da parte del tracciante FLB (vedi esempi nella Figura 2).
   4. Incubare campioni di ciliato/plancton con FLB per 5-15 min.
   5. Ci sono due possibilità per la fissazione del campione per prevenire l'egestione del materiale ingerito da vacuoli alimentari dei protisti⁸. Terminare le incubazioni con l'aggiunta dell'1% di glutaraldeide (concentrazione finale che è più adatta per campioni con particelle contenenti clorofilla, come le alghe). In alternativa, utilizzare 100 l/10 l della soluzione di Lugol in un sottocampione di 20 mL/200 L di acqua/fluido trap, seguito immediatamente dall'aggiunta di 0,5 mL/10 l di formalina con tampone di borate, quindi 200 l/2 l del 3% di sodio thiosulphate (Exp I/Exp II).
5. Dopo aver aggiunto il fissativo, lasciare riposare i campioni per almeno 1 h al buio a 4 gradi centigradi per garantire una conservazione accurata delle cellule ciliate.
6. Prendiamo i sottocampioni naturali del plancton da 4-30 mL/10-30 -L (rispettivamente Exp I/Exp II; il volume dipende dall'abbondanza di ciliati) e macchia con DAPI (concentrazione finale dello 0,2% wt/vol; per i dettagli, vedi il passo 3.2 sopra).
7. Passare attraverso 1 filtri neri m e ispezionare tramite microscopia epifluorescenza per contare ciliati (ingrandimento 600x) ed enumerare il numero di traccianti FLB ingeriti (per lo più a ingrandimento 1000x) come descritto nelle pubblicazioni precedenti^2,17 . Ispezionare i campioni entro 7 giorni dalla conservazione.
8. Per stimare il pascolo totale protozoo/specie specifico, moltiplicare i tassi medi di assorbimento di tutti i ciliati, o solo delle specie di ciliati rilevate dall'abbondanza in situ.
9. L'esempio del calcolo dei tassi di assorbimento per cellula da dati in situ provenienti dal serbatoio dell'acqua di zmov è descritto come segue:
   1. Si supponga che la concentrazione batterica sia 3,55 x 10⁶ batteri/mL e il tracciante FLB aggiunto sia 0,25 x 10⁶ FLB/mL, che produce una somma di 3,8 x 10⁶ batteri/mL delle particelle batteriche totali (batteri naturali - FLB - 100% di particelle di preda) disponibile per i protisti fagotrofi nel campione naturale.
      NOTA: I traccianti FLB aggiunti rappresentano quindi il 6,58% (un progetto di 0,25/0,038) di particelle batteriche totali. Il numero medio di FLB per Halteria sp. è di 6,2 FLB in incubazioni di 5 min.
   2. Per normalizzare l'assorbimento all'ora, utilizzare il seguente calcolo: (6,2 x 12)/(6,58/100) - 1131 batteri per cellula Halteria/h.
      NOTA: per ulteriori esempi di distribuzioni dei singoli tassi di assorbimento di Halteria sp. rilevati sotto temperature variabili dell'acqua, quantità (come percentuali) di tracciante FLB aggiunto e diversi tempi di incubazione con FLB, vedere figura 3.

Risultati

Esempio di esperimento che ho eseguito nel bacino idrico di Omov (Boemia meridionale, in C), che è un sito naturale con un predatore in situ in situ inferiore e abbondanza di prede. I dati rappresentativi sono riportati per la specie onnivora di ciliato Halteria grandinella, che è un pascolo abbondante ed efficiente di picoplancton (<2 zm) particelle^10,16,17,18

Discussione

Decifrare l'interazione trofica nei sistemi acquatici è sempre impegnativo²⁸, soprattutto nelle scale nano-plancton che coinvolgono protisti e le loro prede, batteri. Quando si tratta di percorsi di assorbimento dei nutrienti e quantificazione, l'applicazione di metodi utilizzati con successo a livelli trofici più elevati è meno possibile, a causa dell'elevata complessità delle interazioni biotiche. Questi includono, ad esempio, approcci stabili di etichettatura degli isotopi. Questo protocoll...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2-µm pore-size filters	SPI supplies, https://www.2spi.com/	B0225-MB	Black, polycarbonate track etch membrane filters, diameter approprite for filtering apparatus used
5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluorescein (DTAF)	Any brand
Automatic pipettes with adjustable volumes	Any brand, various sizes
Centrifuge	22 000 x g
Cryovials	Any brand, 2 mL size
DAPI (4´,6-Diamidino-2´-phenylindole dihydrochloride)	Any brand		1 mg ml-1
Epiflorescence microscope	Magnification from 400 x up to 1000 x
	Filters appropriate for viewing in the DAPI and DTAF range
	Counting grid in one of the oculars
Filtering apparatus	Usually with a diameter of 25 mm
Formaldehyde	A brand for microscopy
Glutaraldehyde	A brand for microscopy
Immersion oil for microscopy	Specific oil with low fluorescence
Lugol´s solution	Any brand or see comment		Make an alkaline Lugol' solution as follows: Solution 1 - dissolve  10 g of potassium iodide in 20 ml in MQ water, then add 5 g of iodine. Solution 2 - add 5 g of sodium acetate  to 50 ml of MQ water. Add the solution 2 to the solution 1 and thoroughly mix
Methanol stabilized formalin	Any brand available for microscopy purposes
Microscope slides and cover slips	Any brand produced for microscopy purposes
MQ water for diluting samples	Any brand
Phosphate-buffered saline (PBS; pH = 9)	Any brand		0.05 M Na2HPO4-NaCl solution, adjusted to pH 9
PPi-saline buffer	Any brand		0.02 M Na4P2O7-NaCl solution. Add 0.53 g Na4P2O7 to 100 ml of MQ water plus 0.85 g NaCl
Sampling device	Appropriate for obtaining representative sample		e.g. Friedinger sampler for lake plankton
Sodium thiosulfate solution	Any brand		3% solution is used in the protocol
Sonicator	Any brand		30 W
Vortex	Any brand allowing  thorough mixing of the solutes and samples
Water bath	Any brand allowing temperature to be maintained at 60 °C