水生生態系における有機炭素流の新しい経路を明らかにするトレーサーとしての蛍光標識細菌

要約

ここでは、高精度かつ分類分解能で水生捕食真核生物の放牧率を定量化する単細胞、エピ蛍光顕微鏡ベースの技術のためのプロトコルです。

要約

捕食やその効果などの栄養相互作用を解明することは、生態学の多くの研究者にとって頻繁な作業です。微生物群相の研究には多くの制限があり、捕食者、獲物、捕食速度の決定はしばしば困難です。ここでは、蛍光標識された獲物をトレーサーとして添加することに基づいて最適化された方法であり、水生捕食真核生物における放牧率の信頼性の高い定量化と、より高い栄養レベルへの栄養移動の推定を可能にする。

概要

ヘテロ栄養原核生物は、水生系における重要な生物学的成分であり、プランクトンバイオ^{マス1、2、3}のかなりの部分を占める。その豊富さ、多様性、および活動を制御する要因は、生物地球化学的サイクリング(すなわち、有機炭素およびその他の栄養素の運命と原核生物から高い栄養レベルへのエネルギーの流れ)におけるその役割を理解するために重要です。原生動物の放牧は、これらの重要な要因の一つです。異種栄養性ナノフラグラテスおよび毛様体の細菌学は、原核生物の豊富さ、コミュニティ機能、構造、多様性、さらには特定の細菌群の細胞形態および増殖速度に対して強力なトップダウン制御を課^{す4、 5,6}.いくつかのシステムでは、プロティストは細菌^{死亡率6、7}の主な原因として機能します。

現在しばらく使用されている原生菌を評価するために使用される標準的なアプローチは、蛍光標識細菌(FLB)を獲物類似体および上蛍光顕微鏡として使用することを含む。細胞特異的取り込み速度は、選択した^{時間経過8}にわたってプロテチスタン食品真空中の標識された獲物粒子の数を定量化することによって決定することができる。この方法にはいくつかの利点があります。トレーサーは、自然の捕食者と獲物の組み立てと自然なサンプルに追加されます。インキュベーションの前に最小サンプル操作、追加されたFLBトレーサーによる最小サンプル改変、およびインキュベーション時間は、その中で近い条件下で得られる音の結果を確実にするために短いです。あるいは、細菌性プロティストや動物プランクトンの数が少ない環境(例えば、沖合の海洋システム)では、低量(2%-3%トレーサー)でサンプルに添加されたFLBの消失率は、長期(12-24時間)のフローサイトメトリーを介して検出することができる。インキュベーション実験。次に、始点と終点におけるFLBの数(すべての細菌の影響を統合する)は、フローサイトメトリーによって定量される(詳細については、前の^出版物9を参照)。しかし、このようなパラメータは、特定のプロチスタンおよび動物プランクトン放牧者群または種に直接起因することができない総集約細菌学率のみを表す。

全体的に、水生環境におけるプロテスタン種または形態型特異的細菌死亡率を正確かつ生態学的意味で定量化することは困難であり得る。一部のプロティストは選択的な放牧者であり、追加されたFLBトレーサーの大きさおよび細胞形状は、獲物摂取の自然な速度を歪める可能性^{がある10、11。}さらに、プロティスタン活性と代謝は非常に温度^感受性12である。したがって、追加されたFLBトレーサーの量は、個々のサンプルタイプごとに慎重に操作する必要があります(細菌の自然な豊富さ、大きさ、形態、細菌の種類だけでなく、温度にも基づいて)。ほとんどの研究は、バルクプロテスタン放牧活性に焦点を当てています。しかしながら、特定のプロテスタン種の細菌学は、多くの場合、はるかに高い情報値を保持し、好ましい場合があります。この場合、サンプル中に存在するプロチスト種の分類知識と、その挙動を理解する必要がある。したがって、特定のプロテスタン属または種に起因する細菌類の細菌学的割合に関する健全な結果を得るためには、かなりの時間と労力が必要である。

これらの困難にもかかわらず、このアプローチは、自然な設定で前腺細菌を評価するために現在利用可能な最も適切なツールのままです。ここでは、水生微生物生態学研究のトレーサーとしてFLBを使用するための包括的で簡単に従う方法です。アプローチの前述の問題のある側面のすべてを説明し、改善されたワークフローが説明され、対照的な環境からの2つの実験だけでなく、対照的なシリアート種を例として説明する。

最初のケーススタディは、チェコ共和国のメソトロフィック・ジモフ水溜所からエピリムネティック環境で行われ、ほとんどの表面淡水体に匹敵する放牧者と細菌の豊富さを示した(cf.^5,7)。第2のケーススタディは、両方の放牧ミキシック性毛様の非常に高い数を有する水生肉食植物ウトリピア反射のトラップ内の非常に特異的な環境で行われた(テトラヒメナutriculariae)と細菌細胞。両方のサンプルタイプの細胞特異的放牧率と細菌スタンディングストックの計算が示されています。その後、結果の生態学的解釈の範囲が議論され、可能なフォローアップ研究の例が最終的に提案されます。

プロトコル

1. サンプルコレクション

1. 貯水池水サンプルの採取:最初のケーススタディ(Exp I;その地の捕食者と獲物の豊富なシステムにおける低い自然)
   1. 適切な深さで所望の場所から水のサンプルを収集します。実験室への輸送中に、サンプルを温度制御されたクーラーに入れて保管してください(温度ショックを避け、プロティストの取り込み速度は温度に依存することに留意してください)。
      注:私たちのサンプリングは、メソ・エトロフィック・キャニオン形のシモフ貯水池(南ボヘミア、体積34.5 x 10⁶ m^3、最大深さ43m、平均保持時間100日、小数点以下)で行われました。サンプリングサイトは、ダムに近い30メートルの深さに位置していました。深さ0.5mの混合サンプルを2lフリードンガーサンプラーで採取した。
   2. できるだけ早くセクション 1.2 に進みます。
2. 肉食性ウトリピア反射植物のトラップからの流体のコレクション:第2のケーススタディ(Exp II;高い捕食者と獲物の豊富さ、非常に小さなサンプル量を持つシステム)
   1. 水中で植物をゆっくりと振り、栽培容器から取り出し、吸収性物質の上に置いて余分な水分を吸収します。植物の堅牢性とトラップのサイズに応じて、8-10植物の個体を選択します。
   2. トラップ器官を持つ葉のノードを数えることによって、各シュートをほぼ等しい部分に分割します。各シュートセグメントは、若い、中年、および古いトラップを表す混合サンプルを収集するのに役立ちます。
   3. 薄いガラスキャピラリーとエッペンドルフバイアルを取り付け、サンプル収集用に蠕動ポンプに取り付けます。トラップ開口部に毛細血管の先端を挿入する手順に進みます。真空ポンプを使用して、各トラップからすべての流体を吸い出し、900 ±100 μLのトラップ流体が各トラップ年齢カテゴリに回収されるまで採取します。
   4. プロチスタン放牧実験には、プールされたトラップ液の200μLのトリプリケートサブサンプルを使用します。セクション 3 で詳しく説明したように、これらを直ちに処理します。以下に詳述するように、流体中に生息する微生物成分の他のすべての分析のために、サンプルの残りの±300 μLを保持します(セクション2)。
   5. 直ちにセクション 2 に進みます。

2. 収集したサンプルの固定

1. Exp IおよびII:細菌列挙のための水/トラップ流体サブサンプル(セクション4、それぞれ約20 mLおよび0.3 mL)をホルムアルデヒドで少なくとも1時間固定し、各サンプルの2%の最終容積:体積濃度を得る。
   注:ホルムフードの中でホルムアルデヒドを排他的に取り扱い、サンプルを操作しながら常に手袋を着用してください。

3. サンプルろ過

1. サンプル希釈(Exp I):貯水池の水サンプルに希釈は必要ありません。(Exp II):トラップ液サンプルを粒子フリーMQ水で10x-100x希釈し、エピ蛍光顕微鏡でカウントする前にフィルター表面上の標的微生物の適切な分布を達成します。
2. 濾過漏器(直径25mm)を用いた濾過器を用いた黒い0.2 μmの細孔サイズフィルターに対する細菌用トラップ液のサブサンプルの貯留水の1-2 mL(Exp II)または10-30 μL(Exp II)をフィルターします。
3. DAPI(4',6-diamidino-2'-フェニリンドール二塩酸塩,0.2%最終濃度)で4分間フィルターを汚します。
   注:皮膚や作業面の汚染を避け、手袋を着用してください。
4. 濃縮された微生物を含むフィルターを、顕微鏡スライド上の浸漬油(蛍光顕微鏡検査用)の上に置きます。フィルターの中央に別のオイルドロップを置き、カバースリップでカバーし、オイルが均等に分配されていることを確認します。
5. この時点で、好ましくは直ちに試料を処理し、または代わりに、さらに分析するまで数週間から数ヶ月間冷凍庫(-20°C)に保存する。

4. フィルター上の細菌数の列挙

1. スライドをエピ蛍光顕微鏡の下に置きます(フルオロクロムDAPIに対応するフィルターセット付き)。10 x 10 のカウント グリッドを眼の 1 つに配置します。スライドをランダムな位置に移動します。
2. カウントグリッドの面積(倍率1000倍下)で細菌細胞(青色蛍光)を定量する。カウントには、棚卸グリッドの左端と上端を横切るセルを含め、右端と下端に位置するセルを除外します。
3. 別のランダムな位置に移動し、合計でカウントされる 500 個のセルに相当する少なくとも 10 ~ 15 個のカウント グリッドで列挙を繰り返します。
4. フィルタの総有効濾過面積に対する1グリッドの面積の比率に関する知識に基づいて、所定の顕微鏡および倍率の変換係数を確立する。次に、カウントされたセルの合計数をカウントしたグリッド数で除算し、グリッドあたりの平均細菌数を生成します。
5. 後者のパラメータに設定された変換係数を乗算し、サンプルのmL当たりの結果数を正規化し(濾過されたサンプルの量に応じて)、mL当たりの総細菌量を得ます。

5. プロティスタンの豊富さの決定

1. グルタルアルデヒド(1%最終濃度1%、固定後数日から数週間処理される粒子を含むクロロフィルの存在を有するサンプルに適した)またはトラップ流体(Exp II)サブサンプルを固定するフォルモルチオ硫酸塩脱色技術は、以下に示す。
   注:両方の保存技術は、プロティスト8の食物空洞からの摂取材料のエジェストを防^ぎます。
2. フォルモルチオ硫酸塩脱色技術に関しては、水/トラップ流体サブサンプル(Exp I/Exp II)の20mL/200 μLにLugolの溶液の100 μL/1 μLを追加します。
3. 直ちに0.5mL/50 μLのボレート緩衝ホルマリンを加え、次いで3%チオスルフェートナトリウムの20 μL/2 μL(それぞれExp I/Exp II)を加えて従ってください。
   注:チオ硫酸ナトリウムは、上蛍光^顕微鏡8の下で細胞の観察を可能にするために、ルゴルの黄色の色を脱色します。
4. 既知のサンプル量(標的前駆体の数に応じて)を1 μmの細孔サイズの黒いポリカーボネートフィルターに濾過します。
5. 前駆体種の数を推定する場合は、カウントグリッドを用いて倍率600倍以下の少なくとも200細胞を数えることによってである(上記参照)。
6. ろ過漏斗内の真空下の試料の体積を低真空で約2mLに減らします。次いで、アンダープレッシャーを放出し、DAPIフルオロクロム(4',6-ジアミド-2-フェニリンドール二塩^{酸塩13,0.2%}最終濃度)を2分間添加する。

6. プランクトンサンプルにおける毛様体のコミュニティ構造の決定

注:淡水生息地のciliateコミュニティは非常に多様である14、15、16、18、そして彼らの顕微鏡的な決定は挑戦的です。ciliate基を機能ギルド10、14、16、17に分類^すると、ペラジックバクテリボレスとして異なる毛様基のより詳細な分析が可能になります。

1. 次を組み合わせて、ciliate コミュニティ構造を評価します。
   1. 上蛍光顕微鏡におけるDAPI染色サンプル(異なるサイズおよび形態のマクロ核および微小核の明るい蛍光を有する毛様細胞を局在化させる)と蛍光標識細菌の取り込み(FLB^8;詳細については、以下を参照してください)は、細菌を養うために毛様の能力を追跡します。
   2. 選択した^症例17,19のライブサンプル観察。ciliates を異なる分類カテゴリにグループ化するために使用される上記のアプローチと基準の詳細については、前の出版物^16,17を参照してください。
      注:引用された研究は、シチコトリシア(ジェネラ・ハルテリアとペラゴハルテリア)とオリゴトリシア(すなわちリモストロミジウム属)の中で最も重要なペラジック消費者であることを示しています。淡水生息地の大部分でバクテリオプランクトン^10,17,18.

7. 毛様の放牧率の推定

1. トレーサーの平均数の変化(すなわち、インキュベーション時間(5〜15分)に関連する毛様化当^たりFLB8)とFLBのトレーサー量に基づいて細菌に対する毛様の取り込み率を計算し、全細菌の5%~15%を占める。
2. 異なるプロテチスタン種間の取り込み率を比較するために、取り込み速度を1時間当たりの細菌数として正規化し、実際のインキュベーション時間とトレーサーFLBの割合に基づく計算を加えた。
   注:FLB法アプリケーションの一般的なスキームは、天然サンプル中の細胞または種特異的およびバルクバクテリア率の両方を推定する図1に示されている。
3. 細菌株から淡水環境へのFLBの調製⁸
   1. 調査対象の水生系におけるバクテリプランクトン/細菌細胞の典型的なサイズを効果的に模倣できるように、適切なサイズ(平均細胞体積=MCV)と細菌の形態を選択します。
      注:Exp Iの場合、リムノビアン属およびポリヌクレオバクター属の研究場所から単離された株の混合物が使用された(すなわち、典型的な、湖沼における非常に豊富なバクテリオプランクトン)20。菌株の形態とサイズの詳細については、以前の^{出版物3、17、18、21を}参照してください。
   2. 初期の静止期で15分間遠心分離(5,000 x g)で培養から細菌細胞を収穫し、選択した場所で細菌の典型的なMCVに対応する混合物中の細胞のMCV±SDを得る数値比でそれらを混合する。
   3. リン酸緩衝生理食べ物の10mLでペレットを中断する(PBS;pH=9)。
   4. 黄緑色蛍光色素5-(4,6-ジクロロトリアジン-2-yl)の2mgをリン酸生理食塩水バッファー内の細胞懸濁液に添加し、2時間60°Cの水浴中でインキュベートする。
   5. インキュベーション後、細胞を遠心分離し、DTAF溶液をデカントし、PBSで洗浄および遠心分離機3倍を洗浄する。
   6. 最終洗浄後、PP_i-生理液バッファーの20mLで細胞を再中断する。
   7. FLBサスペンションとピペット1.5mLアリコートを2mLクライオバイアルに渦を入れ、使用するまでPP i-salineバッファで凍結(-20°C)を保ちます。
   8. 次のステップで使用するための0.2 μmポリカーボネートフィルターを通してPP_i-生理食べ物バッファを事前にフィルタリングします。
   9. FLB濃度を決定するには、小さなアリコート(通常は20-40 μL)を粒子フリーPP i-salineバッファーの2 mLに移し、30Wで30Wで超音波処理を行い、0.2 μmのポリカーボネートブラックフィルターに濾過して、上蛍光を介して列挙します。DTAF(448 nm/520-540 nm)の光学フィルタ設定下で顕微鏡検査(1,000倍)。
4. 毛様性細菌の推定のためのトレーサー技術
   1. 自然なプランクトン生息地での放牧実験では、300 mLサンプルを十分にすすりすいで1Lフラスコに分配し、15分間その中の温度でインキュベートします(プロティストがハンドリングショックから回復できるようにします)。
   2. FLBトレーサーを追加して、季節と水温に応じて添加した量で、全細菌の5%~15%を構成します。
      注:大きさのいくつかの順序にまたがる毛様種特異的取り込み速度(すなわち、10^1-104細菌^{から-1時間あたりの-1)10、16、16}に及ぶ非常に広^い、季節依存性スペクトルがあります。 ^{17,18,22,23,24}.
   3. 取り込み率の高い毛様の発生が増加した期間(通常は夏の間)、また、非常に低いFLB添加物で並列インキュベーションを実行し、トレーサーFLBによる毛様化真空の過剰な負荷を避けるために、総細菌の2%-4%のみを構成する(参照)図 2の例)。
   4. FLBでシリート/プランクトンサンプルを5~15分間インキュベートします。
   5. プロティ^スト8の食品バキュールから摂取した材料のエジェストを防ぐためにサンプル固定のための2つの可能性があります。1%グルタルアルデヒド(藻類などのクロロフィル含有粒子を有するサンプルに適した最終濃度)を添加してインキュベーションを終了する。あるいは、Lugolの溶液の100 μL/10 μLを水/トラップ流体サブサンプルの20 mL/200 μLに使用し、その直後にボレート緩衝ホルマリンの0.5 mL/10 μLを添加し、次いで3%チオスルフェートナトリウム(ExpI/Exp II)の200 μL/2 μLを添加する。
5. 固定剤を添加した後、サンプルを4°Cの暗闇の中で少なくとも1時間休止させ、毛様細胞の完全な保存を確保します。
6. 4-30 mL/10-30 μL(Exp I/Exp II、体積はそれぞれ毛様数に依存)から自然プランクトンサブサンプルを採取し、DAPI(最終濃度0.2%wt/vol;詳細については、上記のステップ3.2を参照)で染色します。
7. 1 μmの黒いフィルターを通過し、上蛍光顕微鏡を介して検査して、毛様化(600倍倍)を数え、以前の^{出版物2、17}で詳述したように、摂取したFLBトレーサーの数(主に1000倍倍)を列挙する.保存後7日以内に検査を行います。
8. 原虫/種特異的放牧の合計を推定するには、すべての毛様体の平均取り込み速度、またはその中で検出された種のみを乗算します。
9. シモフ水貯水池からのその場データからの細胞ごとの取り込み率の計算の例は、以下のように説明します。
   1. 細菌濃度が3.55 x 10^6細菌/mLであり、FLBが加えられたトレーサーFLBが0.25 x 10⁶ FLB/mLであると仮定すると、総細菌粒子の合計は3.8 x 10⁶細菌/mL(天然細菌+FLB =獲物粒子の100%)自然なサンプルの咽頭のプロティストに利用できる。
      注:このように追加されたFLBトレーサーは、総細菌粒子の6.58%(0.25/0.038のプロジェクト)を表します。ハルテリアsp.当たりのFLBの平均数は、5分のインキュベーションで6.2 FLBです。
   2. 1 時間あたりの取り込み取り込みを正規化するには、次の計算を使用します: (6.2 x 12)/(6.58/100) =ハルテリアセル/hあたり 1131 細菌。
      注:変動水温下で検出されたハルテリアsp.の個々の取り込み速度の分布のより多くの例、トレーサーFLBの量(パーセントとして)が追加され、FLBとの異なるインキュベーション時間は、図3を参照してください。

結果

実験の例は、捕食者や獲物の豊富さが低い自然の自然地であるシモフ水貯水池(南ボヘミア、CZ)で実施した。代表的なデータは、ピコプランクトン(<2 μm)^{粒子10、16、17、18}の豊富で効率的なグレイザーである全能の毛様種ハルテリア・グランジネラについて報告されています。

ディスカッション

水生系における栄養相互作用の解読は、特にプロティストとその獲物である細菌を含むナノプランクトンスケールにおいて、常^に28に挑戦している。栄養摂取経路と定量に関しては、生物学的相互作用の複雑さが高いため、より高い栄養レベルで正常に使用される方法の適用は不可能です。これらには、例えば、安定した同位板標識アプローチが含まれる。このプロトコル?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2-µm pore-size filters	SPI supplies, https://www.2spi.com/	B0225-MB	Black, polycarbonate track etch membrane filters, diameter approprite for filtering apparatus used
5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluorescein (DTAF)	Any brand
Automatic pipettes with adjustable volumes	Any brand, various sizes
Centrifuge	22 000 x g
Cryovials	Any brand, 2 mL size
DAPI (4´,6-Diamidino-2´-phenylindole dihydrochloride)	Any brand		1 mg ml-1
Epiflorescence microscope	Magnification from 400 x up to 1000 x
	Filters appropriate for viewing in the DAPI and DTAF range
	Counting grid in one of the oculars
Filtering apparatus	Usually with a diameter of 25 mm
Formaldehyde	A brand for microscopy
Glutaraldehyde	A brand for microscopy
Immersion oil for microscopy	Specific oil with low fluorescence
Lugol´s solution	Any brand or see comment		Make an alkaline Lugol' solution as follows: Solution 1 - dissolve  10 g of potassium iodide in 20 ml in MQ water, then add 5 g of iodine. Solution 2 - add 5 g of sodium acetate  to 50 ml of MQ water. Add the solution 2 to the solution 1 and thoroughly mix
Methanol stabilized formalin	Any brand available for microscopy purposes
Microscope slides and cover slips	Any brand produced for microscopy purposes
MQ water for diluting samples	Any brand
Phosphate-buffered saline (PBS; pH = 9)	Any brand		0.05 M Na2HPO4-NaCl solution, adjusted to pH 9
PPi-saline buffer	Any brand		0.02 M Na4P2O7-NaCl solution. Add 0.53 g Na4P2O7 to 100 ml of MQ water plus 0.85 g NaCl
Sampling device	Appropriate for obtaining representative sample		e.g. Friedinger sampler for lake plankton
Sodium thiosulfate solution	Any brand		3% solution is used in the protocol
Sonicator	Any brand		30 W
Vortex	Any brand allowing  thorough mixing of the solutes and samples
Water bath	Any brand allowing temperature to be maintained at 60 °C