Fluoreszierend markierte Bakterien als Tracer, um neuartige Wege des organischen Kohlenstoffflusses in aquatischen Ökosystemen zu enthüllen

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll für eine einzellige, epifluoreszenzmikroskopische Technik zur Quantifizierung der Weideraten in aquatischen Raub-Eukaryoten mit hoher Präzision und taxonomischer Auflösung vorgestellt.

Zusammenfassung

Die Aufklärung trophischer Wechselwirkungen, wie Raubund und ihre Auswirkungen, ist eine häufige Aufgabe für viele Forscher in der Ökologie. Das Studium von mikrobiellen Gemeinschaften hat viele Einschränkungen, und die Bestimmung eines Raubtiers, Beute und Raubtierraten ist oft schwierig. Präsentiert wird hier eine optimierte Methode, die auf der Zugabe von fluoreszierend gekennzeichneter Beute als Tracer basiert, die eine zuverlässige Quantifizierung der Weideraten in aquatischen Raub-Eukaryoten und die Schätzung des Nährstofftransfers zu höheren trophischen Werten ermöglicht.

Einleitung

Heterotrophe Prokaryoten sind eine wichtige biologische Komponente in aquatischen Systemen und machen einen signifikanten Anteil der Planktonbiomasse^1,2,3aus. Faktoren, die ihren Überfluss, ihre Vielfalt und ihre Aktivität kontrollieren, sind entscheidend für das Verständnis ihrer Rolle beim biogeochemischen Kreislauf (d. h. das Schicksal von organischem Kohlenstoff und anderen Nährstoffen und Energiefluss von Prokaryoten zu höheren trophischen Niveaus). Protozoen Weide ist einer dieser wichtigen Faktoren. Bacterivory von heterotrophen Nanoflagellaten und Ziliaraten erzwingt eine starke Kontrolle von oben nach unten über prokaryotische Fülle, Gemeinschaftsfunktion, Struktur, Vielfalt und sogar zelluläre Morphologie und Wachstumsrate bestimmter Bakteriengruppen^{4, 5,6}. In einigen Systemen dienen Protisten als Hauptursache für die bakterielle Sterblichkeit^6,7.

Der Standardansatz zur Bewertung von Protozoen-Bakterien, der seit einiger Zeit verwendet wird, beinhaltet die Verwendung fluoreszierend markierter Bakterien (FLB) als Beuteanaloga und Epifluoreszenzmikroskopie. Zellspezifische Aufnahmeraten können durch Quantifizierung der Anzahl der markierten Beutepartikel in Protistan-Lebensmittel-Vakuolen über einen ausgewählten Zeitverlauf bestimmt werden⁸. Dieser Ansatz hat mehrere Vorteile. Tracer wird natürlichen Proben mit natürlichen Raubtier- und Beuteansammlungen hinzugefügt. Es gibt minimale Probenmanipulationen vor der Inkubation, minimale Probenänderung durch den hinzugefügten FLB-Tracer und Inkubationszeiten sind kurz, um sicherzustellen, dass unter nahezu in-situ-Bedingungen fundierte Ergebnisse erzielt werden. Alternativ können in Umgebungen mit geringer Anzahl bakterivorer Protisten oder Zooplankton (z. B. Offshore-Meeressysteme) die Verschwindenraten von FLB, die Proben in geringen Mengen (2%-3% Tracer) zugesetzt werden, über die Durchflusszytometrie langfristig nachgewiesen werden (12-24 h) Inkubationsexperimente. Dann werden die FlB-Zahlen am Anfangs- und Endpunkt (die Die Auswirkungen aller Bakterivoren integrieren) durch Strömungszytometrie quantifiziert (Details siehe vorherige Publikation⁹). Ein solcher Parameter stellt jedoch nur die aggregierten Bakteriumsraten dar, die nicht direkt auf bestimmte Protistan- und Zooplankton-Weidegruppen oder -arten zurückgeführt werden können.

Insgesamt kann die genaue und ökologische Quantifizierung der protistan-arten- oder morphotypspezifischen bakteriellen Sterblichkeitsraten in der aquatischen Umwelt eine Herausforderung darstellen. Einige Protisten sind selektive Weidetiere, und die Größe und Zellform des hinzugefügten FLB-Tracers kann die natürlichen Raten der Beuteaufnahme^10,11verzerren. Darüber hinaus sind Protistan Aktivität und Stoffwechsel hochtemperaturempfindlich¹²; Daher muss die Menge des hinzugefügten FLB-Tracers für jeden einzelnen Probentyp sorgfältig manipuliert werden (nicht nur basierend auf der natürlichen Häufigkeit, Größe und Morphologie von Bakterien und vorherrschenden Arten von Bakterienfressern, sondern auch auf der Temperatur). Die meisten Studien konzentrieren sich auf Bulk Protistan Weideaktivität; die Bakterivory bestimmter Protistan-Arten haben jedoch oft einen viel höheren Informationswert und können vorzuziehen sein. In diesem Fall ist taxonomisches Wissen über die protistischen Arten, die in einer Probe vorhanden sind, und das Verständnis ihres Verhaltens erforderlich. Daher sind erhebliche Mengen an Zeit und Arbeit erforderlich, um solide Ergebnisse über artspezifische Bacterivory-Raten zu erhalten, die einer bestimmten Protistan-Gruppe oder -Art zuzuschreiben sind.

Trotz dieser Schwierigkeiten bleibt dieser Ansatz das derzeit am besten geeignete Instrument zur Bewertung von Protistan-Bacterivory in natürlichen Umgebungen. Hier wird eine umfassende, leicht verständliche Methode zur Verwendung von FLB als Tracer in aquatischen mikrobiellen Ökologiestudien vorgestellt. Alle genannten problematischen Aspekte des Ansatzes werden berücksichtigt und ein verbesserter Workflow beschrieben, mit zwei Experimenten aus kontrastierenden Umgebungen sowie kontrastierenden Zilienarten als Beispiele.

Die erste Fallstudie wurde in einer epiimnetischen Umgebung aus dem mesotrophischen Wasserreservoir von Mov in der Tschechischen Republik durchgeführt, das Weide- und Bakterienmengen zeigt, die mit den meisten Oberflächensüßwasserkörpern vergleichbar sind (vgl.^5,7). Die zweite Fallstudie wurde in der hochspezifischen Umgebung in Fallen der aquatischen fleischfressenden Pflanze Utricularia reflexadurchgeführt, die eine extrem hohe Anzahl von beiden grasenden Mixotrophen(Tetrahymena utriculariae) beherbergt. und Bakterienzellen. Es werden Berechnungen der zellspezifischen Weideraten und der bakteriellen Bestandsbestände in beiden Stichprobentypen dargestellt. Anschließend wird eine Reihe ökologischer Interpretationen der Ergebnisse diskutiert und schließlich Beispiele für mögliche Folgestudien vorgeschlagen.

Protokoll

1. Probensammlung

1. Sammlung von Reservoir-Wasser-Probe: die erste Fallstudie (Exp I; niedrigere natürliche in situ Raubtier und Beute Fülle System)
   1. Sammeln Sie Wasserproben von der gewünschten Stelle in geeigneter Tiefe. Bewahren Sie die Proben in einem temperaturgeregelten Kühler auf, der bei In-situ-Temperatur gefüllt wird (Vermeidung von Temperaturschock; es ist zu beachten, dass die Aufnahmeraten von Protisten temperaturabhängig sind) während des Transports zum Labor.
      ANMERKUNG: Unsere Probenahme wurde im meso-eutrophen Canyon-förmigen Reservoir von Mov durchgeführt (Südböhmen, Volumen 34,5 x 10⁶ m³, maximale Tiefe 43 m, mittlere Retentionszeit 100 Tage, dimictic). Die Probenahmestelle befand sich in einer Tiefe von 30 m in der Nähe des Staudamms. Eine gemischte Probe in einer Tiefe von 0,5 m wurde von einem 2-l Friedinger Sampler gesammelt.
   2. Fahren Sie so schnell wie möglich mit Abschnitt 1.2 fort.
2. Sammlung von Flüssigkeit aus den Fallen fleischfressender Utricularia-Reflexa-Pflanzen: die zweite Fallstudie (Exp II; ein System mit hoher Raubtier- und Beutemenge, extrem geringes Probenvolumen)
   1. Schütteln Sie die Pflanzen vorsichtig unter Wasser, entfernen Sie sie aus dem Anbaubehälter und legen Sie sie auf saugfähiges Material, um überschüssiges Wasser aufzunehmen. Je nach Robustheit der Pflanzen und Größe der Fallen wählen Sie 8-10 Pflanzenpersonen.
   2. Teilen Sie jeden Trieb in etwa gleiche Teile auf, indem Sie Blattknoten zählen, die Fangorgane tragen. Jedes Triebsegment dient dazu, gemischte Proben zu sammeln, die junge, mittlere und alte Fallen darstellen.
   3. Befestigen Sie eine dünne Glaskapillare und eine Eppendorf-Durchstechflasche zur Probenentnahme an einer Peristaltikpumpe. Setzen Sie die Kapillarspitze in die Fallöffnung ein. Mit der Vakuumpumpe saugen Sie die gesamte Flüssigkeit aus jeder Falle heraus, bis für jede Fallalterskategorie 900 x 100 l Fallenflüssigkeit gesammelt werden.
   4. Verwenden Sie für Protistan-Weideexperimente dreifache Subsamples von 200 l der gepoolten Fallenflüssigkeit. Verarbeiten Sie diese sofort, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Bewahren Sie die verbleibenden 300 l der Probe für alle anderen Analysen der in der Flüssigkeit lebenden mikrobiellen Komponenten auf, wie unten beschrieben (Abschnitt 2).
   5. Fahren Sie sofort mit Abschnitt 2 fort.

2. Fixierung der gesammelten Proben

1. Exp I und II: Fix wasser/trap fluid sub-proben für die bakterielle Aufzählung (Abschnitt 4; ca. 20 ml bzw.) mit Formaldehyd für mindestens 1 h, um eine 2% Endvolumen-Volumen-Volumenkonzentration in jeder Probe zu erhalten.
   HINWEIS: Behandeln Sie Formaldehyd ausschließlich in der Dunstabzugshaube und tragen Sie bei der Manipulation von Proben jederzeit Handschuhe.

3. Probenfiltration

1. Probenverdünnung (Exp I): Für die Wasserproben des Reservoirs ist keine Verdünnung erforderlich. (Exp II): Verdünnen Sie die Trap-Flüssigkeitsprobe 10x-100x mit partikelfreiem MQ-Wasser, um eine geeignete Verteilung der Zielmikroben auf Filteroberflächen zu erreichen, bevor sie über die Epifluoreszenzmikroskopie gezählt werden.
2. Filtern Sie 1-2 ml (Exp I) des Reservoirwassers oder 10-30 l (Exp II) der Unterprobe der Trapflüssigkeit für die bakterielle Zählung auf schwarze Filter mit einer Porengröße von 0,2 m, wobei ein Filtertrichter (25 mm Durchmesser) verwendet wird.
3. Die Filter mit DAPI (4',6-diamidino-2'-phenylindole dihydrochlorid, 0,2% Endkonzentration) für 4 min färben.
   HINWEIS: Vermeiden Sie Haut- und Arbeitsflächenkontamination und tragen Sie Handschuhe.
4. Legen Sie den Filter mit konzentrierten Mikroben auf einen Tropfen Tauchöl (für die Fluoreszenzmikroskopie) auf einem Mikroskopschlitten. Legen Sie einen weiteren Öltropfen auf die Mitte des Filters und decken Sie mit einem Deckel, um sicherzustellen, dass das Öl gleichmäßig verteilt ist.
5. An dieser Stelle, vorzugsweise Prozessproben sofort, oder alternativ, lagern Sie sie im Gefrierschrank (-20 °C) für mehrere Wochen bis Monate bis zu einer weiteren Analyse.

4. Aufzählung der Bakterienzahlen auf den Filtern

1. Platzieren Sie den Schlitten unter das Epifluoreszenzmikroskop (mit dem Filtersatz, der dem Fluorchrom-DAPI entspricht). Legen Sie ein 10 x 10 Zählgitter in eines der Okularen. Verschieben Sie die Folie in eine zufällige Position.
2. Quantifizieren Sie Bakterienzellen (blaue Fluoreszenz) im Bereich des Zählgitters (unter der Vergrößerung 1000x). Schließen Sie in die Zählungen die Zellen ein, die den linken und oberen Rand des Zählrasters kreuzen, während diejenigen, die sich über den rechten und unteren Rand befinden, ausgeschlossen sind.
3. Wechseln Sie zu einer anderen zufälligen Position und wiederholen Sie die Aufzählung auf mindestens 10-15 Zählrastern, die insgesamt 500 Zellen zählen.
4. Erstellen Sie einen Umrechnungsfaktor für ein gegebenes Mikroskop und eine Vergrößerung, basierend auf dem Wissen über das Verhältnis der Fläche eines Rasters zur gesamten effektiven Filtrationsfläche des Filters. Teilen Sie dann die Gesamtzahl der Zellen, die durch die Anzahl der gezählten Gitter gezählt werden, wodurch eine durchschnittliche Anzahl von Bakterien pro Raster ergibt.
5. Multiplizieren Sie den letztgenannten Parameter mit dem ermittelten Umrechnungsfaktor und normalisieren Sie die resultierende Anzahl pro ml einer Probe (abhängig vom Volumen der gefilterten Probe), um die gesamte bakterielle Häufigkeit pro ml zu erhalten.

5. Bestimmung der Protistan-Fülle

1. Befestigen Sie die Wasserproben (Exp I) oder Trap-Flüssigkeit (Exp II) mit Glutaraldehyd (1% Endkonzentration, besser geeignet für Proben mit dem Vorhandensein von Chlorophyll enthaltenden Partikeln, die Tage bis Wochen nach der Fixierung verarbeitet werden) oder Formol-Thiosulfat-Dekofarbierungstechnik unten angegeben.
   HINWEIS: Beide Konservierungstechniken verhindern die Verunglimpfung des aufgenommenen Materials aus Nahrungsvakuumen von Protisten⁸.
2. Fügen Sie in Bezug auf die Formol-Thiosulfat-Dekofarbierungstechnik 100 l/1 l der Lugol-Lösung in 20 ml/200 l der Unterprobe Wasser/Trap-Flüssigkeit (Exp I/Exp II) hinzu.
3. Folgen Sie sofort mit der Zugabe von 0,5 ml/50 l Borat-gepuffertes Formalin dann 20 l/2 l l von 3% Natriumthiosulfat (Exp I/Exp II).
   HINWEIS: Das Natriumthiosulfat entfärbt die gelbe Farbe von Lugol, um die Beobachtung von Zellen unter dem Epifluoreszenzmikroskop⁸zu ermöglichen.
4. Filtern Sie ein bekanntes Probenvolumen (abhängig von der Anzahl der Zielprotisten) auf 1 m Poren-große Schwarze-Polycarbonat-Filter.
5. Schätzen Sie die Anzahl der protistischen Arten ist durch Zählen von mindestens 200 Zellen unter Vergrößerung 600x mit dem Zählgitter (siehe oben).
6. Reduzieren Sie das Volumen der Probe unter einem Vakuum im Filtrationstrichter durch niedriges Vakuum auf ca. 2 ml. Dann lassen Sie den Unterdruck los und fügen Sie das DAPI-Fluorchrom (4',6-Diamidino-2-Phenylindole-Dihydrochlorid¹³, 0,2% Endkonzentration) für 2 min hinzu.

6. Bestimmung der Gemeinschaftsstruktur von Zilien in Planktonproben

HINWEIS: Ciliate Gemeinschaften in Süßwasser-Lebensräume sind sehr vielfältig^14,15,16,¹⁸, und ihre mikroskopische Bestimmung ist eine Herausforderung. Die Sortierung der Ziliengruppen in funktionelle Gilden^10,14,16,17 ermöglicht eine detailliertere Analyse verschiedener Ziliengruppen als pelagische Bakterivoren.

1. Bewerten Sie die Ciliate-Community-Struktur, indem Sie Folgendes kombinieren:
   1. DAPI-gefleckte Proben in der Epifluoreszenzmikroskopie (zur Lokalisierung der Ziliatzellen mit heller Fluoreszenz von Makro- und Mikrokernen unterschiedlicher Größe und Morphologie) kombiniert mit der Aufnahme fluoreszierend markierter Bakterien (FLB⁸; für Details, siehe unten), die Fähigkeit von Ziliaten verfolgen, sich von Bakterien zu ernähren.
   2. Live-Probenbeobachtung in ausgewählten Fällen^17,19. Weitere Einzelheiten zu den oben genannten Ansätzen und Kriterien für die Gruppierung von Zilien in verschiedene taxonomische Kategorien finden Sie in früheren Veröffentlichungen^16,17.
      ANMERKUNG: Zitierte Studien haben gezeigt, dass unter den Zilien, Omnivoren arten aus Stichotrichia (Genera Halteria und Pelagohalteria)und Oligotrichia (nämlich Rimostrombidium spp.) die wichtigsten pelagischen Verbraucher von Bakterioplankton in einer überwiegenden Mehrheit der Süßwasserlebensräume^10,17,18.

7. Schätzung der Zilien-Weideraten

1. Berechnen Sie die Aufnahmeraten von Zilien auf Bakterien auf der Grundlage von Veränderungen in der durchschnittlichen Anzahl von Tracer [d.h. FLB⁸ pro Zilit im Zusammenhang mit der Zeit der Inkubation (5-15 min)] und Tracer Menge an FLB hinzugefügt, wobei höchstens 5%-15% der gesamten Bakterien.
2. Um die Aufnahmeraten zwischen verschiedenen Protistan-Arten zu vergleichen, normalisieren Sie die Aufnahmeraten als Anzahl der Bakterien pro Zilit pro Stunde, wobei Berechnungen auf der Grundlage der tatsächlichen Inkubationszeit und des Anteils des Tracers FLB hinzugefügt werden.
   ANMERKUNG: Das allgemeine Schema der ANWENDUNG der FLB-Methode zur Schätzung sowohl zell- als auch artspezifischer und massenhäliger Bakterbakterienraten in natürlichen Proben ist in Abbildung 1dargestellt.
3. Herstellung von FLB aus Bakterienstämmen, die in einer Süßwasserumgebung heimisch sind⁸
   1. Wählen Sie eine geeignete Größe (mittleres Zellvolumen = MCV) und Morphologie von Bakterien, so dass sie effektiv die typischen Größen von Bakterioplankton/Bakterienzellen im untersuchten aquatischen System imitieren.
      HINWEIS: Für Exp I wurde eine Mischung aus isolierten Stämmen aus dem Studienort der Gattung Limnohabitans und Polynucleobacter verwendet (d. h. typisch, reichlich Bakterioplankton in Seen und Teichen)²⁰. Einzelheiten zur Morphologie und Größe der Stämme finden Sie in früheren Publikationen^3,17,18,21.
   2. Ernten Sie Bakterienzellen aus der Kultur durch Zentrifugation (5.000 x g) für 15 min in der frühen stationären Phase und mischen Sie sie in einem numerischen Verhältnis, das MCV - SD der Zellen in der Mischung ergibt, die der typischen MCV von Bakterien an der gewählten Stelle entspricht.
   3. Die Pellets in 10 ml phosphatgepufferter Saline (PBS; pH = 9) aussetzen.
   4. 2 mg des gelbgrünen Fluoreszenzfarbstoffs 5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl)-Aminofluorescein (DTAF, bindet an Proteine) in die Zellsuspension im Phosphat-Salzin-Puffer geben und in einem 60 °C-Wasserbad für 2 h brüten.
   5. Zentrifugieren Sie nach der Inkubation die Zellen nach unten, dekantieren Sie die DTAF-Lösung und waschen und zentrifugieren 3x mit PBS.
   6. Nach der letzten Wäsche die Zellen in 20 mldes PP i-Saline-Puffers wieder aufhängen.
   7. Die FLB-Aufhängung und Pipette 1,5 ml in 2 ml Kryo-Fläschchen vortex, dann gefroren(bei -20 °C) im PP i-Salin-Puffer bis zum Gebrauch.
   8. Vorfilter PP_i-saline Puffer durch einen 0,2 m Polycarbonatfilter für den nächsten Schritt.
   9. Zur Bestimmung der FLB-Konzentration einen kleinen Aliquot (in der Regel 20-40 l) auf 2 ml partikelfreien_{PP-I-Salz-Puffer}übertragen, bei 30 W für mehrere 2 s Bursts beschallen und auf 0,2 m Polycarbonat-Schwarzfilter zur Aufzählung über Epifluoreszenz filtern Mikroskopie (1.000X Vergrößerung) unter optischen Filtereinstellungen für DTAF (448 nm/520-540 nm).
4. Tracer-Technik zur Schätzung von Zilien-Bacterivory
   1. Für Weideexperimente in natürlichen planktonischen Lebensräumen 300 ml Proben in gut geschnittene 1 L-Flaschen geben und bei In-situ-Temperatur 15 min inkubieren (damit sich Protisten vom Handhabungsschock erholen können).
   2. Fügen Sie FLB-Tracer hinzu, um 5%-15% der gesamten Bakterien zu machen, wobei die Mengen je nach Jahreszeit und Wassertemperatur hinzugefügt werden.
      ANMERKUNG: Es gibt ein sehr breites, saisonabhängiges Spektrum in ziliten artenspezifischen Aufnahmeraten, die mehrere Größenordnungen umfassen (d. h. von 10¹-10⁴ Bakterien zililiat^-1 pro Stunde)^{10,16, 17,18,22,23,24}.
   3. In Zeiten des verstärkten Auftretens von Zilien mit hohen Aufnahmeraten (in der Regel im Sommer) führen Sie auch eine parallele Inkubation mit sehr geringen FLB-Zusätzen durch, die nur 2%-4% der Gesamtbakterien ausmachen, um eine übermäßige Belastung von Ziliolen durch Tracer FLB zu vermeiden (siehe Beispiele in Abbildung 2).
   4. Zilien-/Planktonproben mit FLB für 5-15 min inkubieren.
   5. Es gibt zwei Möglichkeiten zur Probenfixierung, um die Zeutung des aufgenommenen Materials aus Nahrungsvakuumen von Protisten zu verhindern⁸. Beenden Sie die Inkubationen durch Zugabe von 1% Glutaraldehyd (Endkonzentration, die besser für Proben mit Chlorophyll-haltigen Partikeln, wie Algen, geeignet ist). Alternativ können Sie die Lösung von Lugol mit 100 l/10 l in eine Unterprobe von 20 ml/200 l Wasser/Trap-Flüssigkeit verwenden, gefolgt von der Zugabe von 0,5 ml/10 l Borat-gepuffertem Formalin und dann 200 l/2 l von 3 % Natriumthiosulfat (Exp I/Exp II).
5. Nach Zugabe des Fixativs lassen Sie die Proben mindestens 1 h im Dunkeln bei 4 °C ruhen, um eine gründliche Konservierung der Zilitzellen zu gewährleisten.
6. Nehmen Sie natürliche Plankton-Subsamples von 4-30 ml/10-30 l (Exp I/Exp II; das Volumen hängt von der Ciliath-Fülle ab) und Färben mit DAPI (Endkonzentration 0,2% wt/vol; für Details siehe Schritt 3.2 oben).
7. Durchqueren Sie 1 'm schwarz Filter und inspizieren Sie über die Epifluoreszenzmikroskopie, um Ziliarate zu zählen (600x Vergrößerung) und die Anzahl der aufgenommenen FLB-Tracer (meist bei 1000-facher Vergrößerung) aufzuzählen, wie in früheren Veröffentlichungen^2,17 . Proben innerhalb von 7 Tagen nach konservierungsnehmen.
8. Um die gesamte protozoanische/artspezifische Beweidung zu schätzen, multiplizieren Sie die durchschnittlichen Aufnahmeraten aller Zilien oder nur der Zilienarten, wie sie durch in situ-Überfluss nachgewiesen werden.
9. Das Beispiel für die Berechnung der Aufnahmeraten pro Zelle aus In-situ-Daten aus dem Wasserreservoir von Mov wird wie folgt beschrieben:
   1. Angenommen, die bakterielle Konzentration beträgt 3,55 x 10⁶ Bakterien/ml und Tracer FLB hinzugefügt ist 0,25 x 10⁶ FLB/ml, was eine Summe von 3,8 x 10⁶ Bakterien/ml der gesamten bakteriellen Partikel ergibt (natürliche Bakterien + FLB = 100% der Beutepartikel) phagotrophischen Protisten in der natürlichen Probe zur Verfügung stehen.
      HINWEIS: Die hinzugefügten FLB-Tracer machen somit 6,58 % (ein Projekt von 0,25/0,038) der gesamten bakteriellen Partikel aus. Die durchschnittliche Anzahl der FLB pro Halteria sp. beträgt 6,2 FLB in 5 min Inkubationen.
   2. Um die Aufnahme pro Stunde zu normalisieren, verwenden Sie die folgende Berechnung: (6,2 x 12)/(6.58/100) = 1131 Bakterien pro Halteria-Zelle/h.
      ANMERKUNG: Weitere Beispiele für die Verteilung einzelner Aufnahmeraten von Halteria sp., die unter variablen Wassertemperaturen, Mengen (in Prozent) des Tracer FLB und unterschiedlicheinkubationszeiten mit FLB nachgewiesen wurden, finden Sie in Abbildung 3.

Ergebnisse

Beispiel Experiment Ich wurde in der Wasserreservoir von 'mov (Südböhmen, CZ) durchgeführt, die eine natürliche Stätte mit geringerer natürlicher in situ Raubtier und Beute Fülle ist. Repräsentative Daten werden für die Allesfresser-Zilienart Halteria grandinellagemeldet, die ein reichlich vorhandener und effizienter Weidevon Picoplanktonpartikeln (<2 m) ist^10,16,17,

Diskussion

Die Entschlüsselung der trophischen Interaktion in aquatischen Systemen ist immer eine Herausforderung²⁸, vor allem auf der Nano-Plankton-Skala mit Protisten und ihre Beute, Bakterien. Wenn es um Nährstoffaufnahmewege und Quantifizierung geht, ist die Anwendung von Methoden, die erfolgreich auf höheren trophischen Ebenen eingesetzt werden, aufgrund der hohen Komplexität biotischer Wechselwirkungen weniger möglich. Dazu gehören beispielsweise stabile Isotopenkennzeichnungsansätze. Dieses Pro...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2-µm pore-size filters	SPI supplies, https://www.2spi.com/	B0225-MB	Black, polycarbonate track etch membrane filters, diameter approprite for filtering apparatus used
5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluorescein (DTAF)	Any brand
Automatic pipettes with adjustable volumes	Any brand, various sizes
Centrifuge	22 000 x g
Cryovials	Any brand, 2 mL size
DAPI (4´,6-Diamidino-2´-phenylindole dihydrochloride)	Any brand		1 mg ml-1
Epiflorescence microscope	Magnification from 400 x up to 1000 x
	Filters appropriate for viewing in the DAPI and DTAF range
	Counting grid in one of the oculars
Filtering apparatus	Usually with a diameter of 25 mm
Formaldehyde	A brand for microscopy
Glutaraldehyde	A brand for microscopy
Immersion oil for microscopy	Specific oil with low fluorescence
Lugol´s solution	Any brand or see comment		Make an alkaline Lugol' solution as follows: Solution 1 - dissolve  10 g of potassium iodide in 20 ml in MQ water, then add 5 g of iodine. Solution 2 - add 5 g of sodium acetate  to 50 ml of MQ water. Add the solution 2 to the solution 1 and thoroughly mix
Methanol stabilized formalin	Any brand available for microscopy purposes
Microscope slides and cover slips	Any brand produced for microscopy purposes
MQ water for diluting samples	Any brand
Phosphate-buffered saline (PBS; pH = 9)	Any brand		0.05 M Na2HPO4-NaCl solution, adjusted to pH 9
PPi-saline buffer	Any brand		0.02 M Na4P2O7-NaCl solution. Add 0.53 g Na4P2O7 to 100 ml of MQ water plus 0.85 g NaCl
Sampling device	Appropriate for obtaining representative sample		e.g. Friedinger sampler for lake plankton
Sodium thiosulfate solution	Any brand		3% solution is used in the protocol
Sonicator	Any brand		30 W
Vortex	Any brand allowing  thorough mixing of the solutes and samples
Water bath	Any brand allowing temperature to be maintained at 60 °C