Bacterias etiquetadas fluorescentes como un rastreador para revelar nuevos caminos de flujo de carbono orgánico en ecosistemas acuáticos

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para una técnica monocelular basada en microscopía de epifluorescencia para cuantificar las tasas de pastoreo en eucariotas depredadores acuáticos con alta precisión y resolución taxonómica.

Resumen

La diluación de las interacciones tróficas, como la depredación y sus efectos, es una tarea frecuente para muchos investigadores en ecología. El estudio de las comunidades microbianas tiene muchas limitaciones, y determinar las tasas de depredadores, presas y depredadores a menudo es difícil. Aquí se presenta un método optimizado basado en la adición de presas etiquetadas fluorescentes como un trazador, que permite una cuantificación fiable de las tasas de pastoreo en eucariotas depredadores acuáticos y la estimación de la transferencia de nutrientes a niveles tróficos más altos.

Introducción

Los prokaryotes heterotróficos son un componente biológico clave en los sistemas acuáticos y representan una fracción significativa de la biomasa de plancton^1,2,3. Los factores que controlan su abundancia, diversidad y actividad son cruciales para entender su papel en el ciclo biogeoquímico (es decir, el destino del carbono orgánico y otros nutrientes y el flujo de energía de los prokaryotes a niveles tróficos más altos). El pastoreo de protozoos es uno de estos factores importantes. Bacterivory de nanoflagelados y ciliados heterotróficos impone un fuerte control descendente sobre la abundancia procariótica, la función comunitaria, la estructura, la diversidad e incluso la morfología celular y la tasa de crecimiento de determinados grupos bacterianos^{4, 5,6}. En algunos sistemas, los protistas sirven como la principal causa de mortalidad bacteriana^6,7.

El enfoque estándar utilizado para evaluar el bacterivory protozoario, que se ha utilizado desde hace algún tiempo, implica el uso de bacterias etiquetadas fluorescentesmente (FLB) como análogos de presas y microscopía de epifluorescencia. Las tasas de captación específicas de células se pueden determinar cuantificando el número de partículas de presa etiquetadas en vacuolas de alimentos protistán durante un curso de tiempo seleccionado⁸. Este enfoque tiene varias ventajas. Tracer se añade a muestras naturales con conjuntos naturales de depredadores y presas. Hay una manipulación mínima de la muestra antes de la incubación, la alteración mínima de la muestra por el trazador FLB añadido, y los tiempos de incubación son cortos para asegurar que los resultados sonoros obtenidos en condiciones cercanas a in situ. Alternativamente, en entornos con un bajo número de protistas bacterívoros o zooplancton (por ejemplo, sistemas marinos en alta mar), las tasas de desaparición de FLB añadidas a las muestras en cantidades bajas (2%-3% trazador) se pueden detectar a través de citometría de flujo a largo plazo (12-24 h) experimentos de incubación. A continuación, los números de FLB en los puntos inicial y final (integrando el impacto de todos los bacterívoros) se cuantifican mediante citometría de flujo (para más detalles, véase la publicación anterior⁹). Sin embargo, este parámetro sólo representa tasas totales agregadas de bacterivory que no pueden atribuirse directamente a ningún grupo o especie de protistán y pasto de zooplancton en particular.

En general, cuantificar las tasas de mortalidad bacteriana específicas de las especies de protistán o morfotipos en el medio acuático con precisión y con significado ecológico puede ser difícil. Algunos protistas son pastores selectivos, y el tamaño y la forma celular del trazador FLB añadido pueden distorsionar las tasas naturales de ingestión de presas^10,11. Además, la actividad y el metabolismo del protistán son altamente sensibles a la temperatura^12; por lo tanto, la cantidad de trazador FLB añadido debe manipularse cuidadosamente para cada tipo de muestra individual (no sólo en función de la abundancia natural, el tamaño y la morfología de las bacterias y los tipos predominantes de bacterívoros, sino también de la temperatura). La mayoría de los estudios se centran en la actividad de pastoreo de protistano a granel; sin embargo, el bacterivory de especies específicas de protistán a menudo tiene un valor de información mucho más alto y puede ser preferible. En este caso, se necesita el conocimiento taxonómico de las especies protistas presentes en una muestra y comprensión de su comportamiento. Por lo tanto, se requieren cantidades considerables de tiempo y mano de obra para obtener resultados sólidos sobre las tasas específicas de bacterivo de especies atribuibles a un grupo o especie de protistán en particular.

A pesar de estas dificultades, este enfoque sigue siendo la herramienta más adecuada actualmente disponible para evaluar el bacterivory protistán en entornos naturales. Aquí se presenta un método completo y fácil de seguir para utilizar flb como marcador en estudios de ecología microbiana acuática. Se tienen en cuenta todos los aspectos problemáticos mencionados del enfoque y se describe un flujo de trabajo mejorado, con dos experimentos de entornos contrastantes, así como de especies ciliadas contrastantes como ejemplos.

El primer estudio de caso se llevó a cabo en un entorno epilimónico a partir del depósito de agua mesófico de la República Checa, que muestra abundancias de pastoreo y bacterias comparables a la mayoría de los cuerpos de agua dulce superficiales (cf.^5,7). El segundo estudio de caso se llevó a cabo en el entorno altamente específico dentro de las trampas de la planta carnívora acuática Utricularia reflexa, que alberga un número extremadamente alto de ambos ciliados mixotricos de pastoreo (Tetrahymena utriculariae) y células bacterianas. Se muestran cálculos de las tasas de pastoreo específicas de las células y las existencias de pie bacteriana en ambos tipos de muestras. A continuación se discute una serie de interpretaciones ecológicas de los resultados, y finalmente se sugieren ejemplos de posibles estudios de seguimiento.

Protocolo

1. Recogida de muestras

1. Colección de muestras de agua de depósito:el primer caso de estudio (Exp I; menor depredador natural in situ y sistema de abundancia de presas)
   1. Recoja muestras de agua de la ubicación deseada a una profundidad adecuada. Mantener las muestras en un enfriador con temperatura controlada llena a temperatura in situ (evitando el choque de temperatura; debe tenerse en cuenta que las tasas de absorción de los protistas dependen de la temperatura) durante el transporte al laboratorio.
      NOTA: Nuestro muestreo se llevó a cabo en el reservorio meso-eutrófico en forma de cañón de éímov (Bohemia del Sur, volumen 34,5 x 10⁶ m^3,profundidad máxima 43 m, tiempo medio de retención 100 días, dimicéptico). El sitio de muestreo se encuentra a una profundidad de 30 m, cerca de la presa. Una muestra mixta a una profundidad de 0,5 m fue recogida por un muestreador de 2 l Friedinger.
   2. Continúe con la sección 1.2 tan pronto como sea posible.
2. Recolección de líquido de las trampas de plantas carnívoras de Utricularia reflexa: el segundo caso práctico (Exp II; un sistema con altas abundancias de depredadores y presas, volumen de muestra extremadamente pequeño)
   1. Agitar suavemente las plantas bajo el agua, retirar las del recipiente de cultivo y colocarlas en material absorbente para absorber el exceso de agua. Dependiendo de la robustez de las plantas y el tamaño de las trampas, elija 8-10 individuos de la planta.
   2. Divida cada brote en partes aproximadamente iguales contando los nodos de hojas que llevan órganos de captura. Cada segmento de brote servirá para recoger muestras mixtas que representan trampas jóvenes, de mediana edad y viejas.
   3. Coloque un capilar de vidrio fino y un vial de Eppendorf para la recogida de muestras en una bomba peristáltica. Proceda a insertar la punta capilar en la abertura de la trampa. Usando la bomba de vacío, succione todo el líquido de cada trampa hasta que se recojan 900 x 100 l de líquido de trampa para cada categoría de edad de trampa.
   4. Utilice submuestras triplicadas de 200 ml del fluido de trampa agrupado para experimentos de pastoreo de protistán. Procesarlos inmediatamente como se detalla en la sección 3. Conservar el resto de 300 ml de la muestra para todos los demás análisis de componentes microbianos que viven en el fluido, como se detalla a continuación (sección 2).
   5. Proceda inmediatamente a la sección 2.

2. Fijación de muestras recogidas

1. Exp I y II: fijar submuestras de fluidode agua/trampa para la enumeración bacteriana (sección 4; aproximadamente 20 ml y 0,3 ml, respectivamente) con formaldehído durante al menos 1 h para obtener un volumen final del 2%: concentración de volumen en cada muestra.
   NOTA: Manipule el formaldehído exclusivamente en la campana de humos y use guantes en todo momento mientras manipula las muestras.

3. Filtración de muestras

1. Dilución de la muestra (Exp I): no se necesita dilución para las muestras de agua del depósito. (Exp II): diluir la muestra de fluido de trampa 10x-100x con agua MQ libre de partículas para lograr una distribución adecuada de los microbios objetivo en superficies de filtro antes de contar a través de microscopía de epifluorescencia.
2. Filtrar 1-2 ml (Exp I) del agua del depósito o 10-30 l (Exp II) de la submuestra del líquido trampa para contar bacterianos en filtros negros de 0,2 m de tamaño poro, utilizando un embudo de filtración (25 mm de diámetro).
3. Mancha los filtros con DAPI (4',6-diamidino-2'-phenylindole dihydrochloride, 0.2% concentración final) durante 4 min.
   NOTA: Evite la contaminación de la piel y la superficie de trabajo, y use guantes.
4. Coloque el filtro con microbios concentrados en una gota de aceite de inmersión (para microscopía fluorescente) en una diapositiva del microscopio. Coloque otra gota de aceite en el centro del filtro y cubra con un cubreobjetos, asegurándose de que el aceite se distribuya uniformemente.
5. En este punto, preferiblemente procese las muestras inmediatamente, o alternativamente, guárdelas en el congelador (-20 oC) durante varias semanas o meses hasta un análisis posterior.

4. Enumeración de números bacterianos en los filtros

1. Coloque la corredera debajo del microscopio de epifluorescencia (con el conjunto de filtros correspondiente al DAPI fluorocromo). Coloque una rejilla de recuento de 10 x 10 en uno de los oculares. Mueva la diapositiva a una posición aleatoria.
2. Cuantifique las células bacterianas (fluorescencia azul) en el área de la cuadrícula de recuento (bajo el aumento 1000x). En los recuentos, incluya las celdas que cruzan los bordes izquierdo e superior de la cuadrícula de recuento, excluyendo las situadas a través de los bordes derecho e inferior.
3. Muévase a otra posición aleatoria y repita la enumeración en al menos 10-15 cuadrículas de recuento, lo que equivale a 500 celdas contadas en total.
4. Establecer un factor de conversión para un microscopio y aumento determinados, basado en el conocimiento de la relación del área de una rejilla con el área de filtración efectiva total del filtro. Luego, divida el número total de células contadas por el número de cuadrículas contadas, produciendo un número promedio de bacterias por cuadrícula.
5. Multiplique este último parámetro por el factor de conversión establecido y normalice el número resultante por ml de una muestra (dependiendo del volumen de la muestra filtrada) para obtener la abundancia bacteriana total por ml.

5. Determinación de la abundancia de protistán

1. Fijar la muestra de agua (Exp I) o el fluido de trampa (Exp II) submuestras con glutaraldehído (1% concentración final, más adecuado para muestras con la presencia de partículas que contienen clorofila que deben ser procesadas días a semanas después de la fijación) o utilizando el técnica de decoloración formol-tiosulfato especificada a continuación.
   NOTA: Ambas técnicas de conservación previenen la gestión del material ingerido a partir de vacuolas alimentarias de protistas^8.
2. En cuanto a la técnica de decoloración formol-tiosulfato, añada 100 l/1 l de la solución de Lugol en 20 ml/200 ml de la submuestra de líquido de agua/trampa (Exp I/Exp II, respectivamente).
3. Siga inmediatamente con la adición de 0,5 ml/50 l de formalina tamponada con borato y luego 20 l/2 l de tiosulfato sódico al 3% (Exp I/Exp II, respectivamente).
   NOTA: El tiosulfato sódico decolora el color amarillo de Lugol para permitir la observación de células bajo el microscopio de epifluorescencia⁸.
4. Filtrar un volumen conocido de muestra (dependiendo del número de protistas objetivo) en filtros de policarbonato negro del tamaño de un poro de 1 m.
5. Estimar el número de la especie protista es contando al menos 200 células bajo aumento 600x usando la cuadrícula de recuento (ver arriba).
6. Reduzca el volumen de la muestra bajo vacío en el embudo de filtración por vacío bajo a aproximadamente 2 ml. A continuación, suelte la subpresión y añada el fluorocromo DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride¹³, 0.2% concentración final) durante 2 min.

6. Determinación de la estructura comunitaria de los ciliados en muestras de plancton

NOTA: Las comunidades ciliada en hábitats de agua dulce son muy diversas^14,15,16,18, y su determinación microscópica es un reto. La clasificación de los grupos ciliados en gremios funcionales^10,14,16,17 permite un análisis más detallado de diferentes grupos ciliados como bacterívoros pelágicos.

1. Evalúe la estructura de la comunidad ciliada combinando lo siguiente:
   1. Muestras manchadas de DAPI en microscopía de epifluorescencia (para localizar las células ciliadas con fluorescencia brillante de macro y micronúcleos de diferentes tamaños y morfología) combinadas con la absorción de bacterias etiquetadas fluorescentesmente (FLB^8;para más detalles, ver a continuación), el seguimiento de la capacidad de los ciliados para alimentarse de bacterias.
   2. Observación de muestras en vivo en casos seleccionados^17,19. Para más detalles de los enfoques y criterios anteriores utilizados para agrupar ciliados en diferentes categorías taxonómicas, véanse las publicaciones anteriores^16,17.
      NOTA: Estudios citados han indicado que entre los ciliados, las especies omnívoras de Stichotrichia (genera Halteria y Pelagohalteria)y Oligotrichia (a saber, Rimostrombidium spp.) son los consumidores pelágicos más importantes de bacterioplancton en la gran mayoría de los hábitats de agua dulce^10,17,18.

7. Estimación de las tasas de pastoreo ciliado

1. Calcular las tasas de ingesta de cilios en bacterias basándose en los cambios en el número medio de trazador [es decir, FLB⁸ por ciliar relacionado con el tiempo de incubación (5-15 min)] y la cantidad de FLB añadida, representando como máximo entre el 5% y el 15% del total de bacterias.
2. Para comparar las tasas de captación entre diferentes especies de protistán, normalice las tasas de captación como el número de bacterias por ciliado por hora, con cálculos basados en el tiempo de incubación real y la proporción del FLB trazador añadido.
   NOTA: En la Figura 1se muestra el esquema general de la aplicación del método FLB para estimar las tasas de bacterivory tanto celulares como específicos de especies y a granel en muestras naturales.
3. Preparación de FLB a partir de cepas bacterianas autóctonas a un ambiente de agua dulce⁸
   1. Seleccione un tamaño adecuado (volumen de célula s/promedio de MCV) y morfología de las bacterias para que imite eficazmente los tamaños típicos de las células bacterioplancton/bacterianas en el sistema acuático que se está investigando.
      NOTA: Para Exp I, se utilizó una mezcla de cepas aisladas de la ubicación de estudio del género Limnohabitans y Polynucleobacter (es decir, bacterioplancton típico y muy abundante en lagos y estanques)²⁰. Para más detalles sobre la morfología y el tamaño de las cepas, véanse las publicaciones anteriores^3,17,18,21.
   2. Cosechar células bacterianas del cultivo por centrifugación (5.000 x g) durante 15 minutos en la fase estacionaria temprana y mezclarlas en una proporción numérica que produzca MCV - SD de las células en la mezcla correspondiente al MCV típico de bacterias en el lugar elegido.
   3. Suspenda los pellets en 10 ml de solución salina con fosfato (PBS; pH n.o 9).
   4. Añadir 2 mg de aminofluoresceína de color amarillo-verde 5-(4,6-diclorotriazina-2-yl) (DTAF, se une a las proteínas) a la suspensión celular en el tampón fosfato-salino, e incubar en un baño de agua de 60 oC durante 2 h.
   5. Después de la incubación, centrifugar las células hacia abajo, decantar la solución DTAF, y lavar y centrifugar 3veces con PBS.
   6. Después del lavado final, vuelva a suspender las células en 20 ml del búfer PP_i-salino.
   7. Vortex la suspensión FLB y la pipeta 1,5 ml alícuotas en crioviales de 2 ml, luego mantener congelado (a -20 oC) en el tampón PP_i-salino hasta su uso.
   8. Prefiltro PP_i-saline buffer a través de un filtro de policarbonato de 0,2 m para su uso en el siguiente paso.
   9. Para determinar la concentración de FLB, transfiera una pequeña alícuota (generalmente 20-40 l) a 2 ml de tampón PP_i-salino libre de partículas, sonicar a 30 W durante varias ráfagas de 2 s y filtre en un filtro negro de policarbonato de 0,2 m para su enumeración a través de epifluorescencia microscopía (aumento de 1.000X) en los ajustes de filtro óptico para DTAF (448 nm/520-540 nm).
4. Técnica de trazador para la estimación del bacterivory ciliado
   1. Para experimentos de pastoreo en hábitats planctónicos naturales, dispensar muestras de 300 ml en matraces bien enjuagados e incubar a temperatura in situ durante 15 minutos (para permitir que los protistas se recuperen del amortiguador de manipulación).
   2. Añadir trazadores FLB para constituir 5%-15% del total de bacterias, con las cantidades añadidas dependiendo de la temporada y la temperatura del agua.
      NOTA: Hay un espectro muy amplio, dependiente de la temporada en las tasas de admisión específicas de las especies ciliadas que abarcan varios órdenes de magnitud (es decir, de 10¹-10⁴ bacterias ciliar^-1 por hora)^{10,16, 17,18,22,23,24}.
   3. En períodos de mayor aparición de ciliados con altas tasas de admisión (generalmente durante el verano), también se ejecuta una incubación paralela con adiciones muy bajas de FLB, constituyendo sólo 2%-4% del total de bacterias para evitar la carga excesiva de vacuolos ciliados por el trazador FLB (ver ejemplos en la Figura 2).
   4. Incubar muestras de ciliado/plancton con FLB durante 5-15 min.
   5. Existen dos posibilidades de fijación de muestras para evitar la gestión del material ingerido a partir de vacuolas alimentarias de los protistas^8. Terminar las incubaciones mediante la adición de 1% de glutaraldehído (concentración final que es más adecuada para muestras con partículas que contienen clorofila, como algas). Alternativamente, utilice 100 l/10 l de la solución de Lugol en 20 ml/200 ml de submuestra de líquido de agua/trampa, seguido inmediatamente por la adición de 0,5 ml/10 l de formalina tamponada con borato y, a continuación, 200 ml/2 l de tiosulfato sódico al 3% (Exp I/Exp II, respectivamente).
5. Después de añadir el fijador, deje reposar las muestras durante al menos 1 h en la oscuridad a 4 oC para asegurar la preservación minuciosa de las células ciliada.
6. Tomar submuestras de plancton naturales de 4-30 mL/10-30 l (Exp I/Exp II, respectivamente; el volumen depende de la abundancia de ciliar) y manchar con DAPI (concentración final 0,2% wt/vol; para más detalles, ver paso 3.2 anterior).
7. Pasar a través de filtros negros de 1 m e inspeccionar a través de microscopía de epifluorescencia para contar los ciliados (aumento de 600x) y enumerar el número de trazadores FLB ingeridos (principalmente con aumento de 1000x) como se detalla en publicaciones anteriores^2,17 . Inspeccione las muestras dentro de los 7 días posteriores a la conservación.
8. Para estimar el pastoreo total protozoario/específico de la especie, multiplique las tasas medias de ingesta de todos los ciliados, o sólo de las especies ciliadas detectadas por la abundancia in situ.
9. Ejemplo del cálculo de las tasas de admisión por célula a partir de los datos in situ del depósito de agua de éímov se describe de la siguiente manera:
   1. Supongamos que la concentración bacteriana es de 3,55 x 10⁶ bacterias/ml y el trazador FLB añadido es de 0,25 x 10⁶ FLB/mL, lo que produce una suma de 3,8 x 10⁶ bacterias/ml de partículas bacterianas totales (bacterias naturales + FLB a 100% de las partículas de presas) protistas fagotróficas en la muestra natural.
      NOTA: Los trazadores FLB añadidos representan así el 6,58% (un proyecto de 0,25/0,038) de partículas bacterianas totales. El número medio de FLB por Halteria sp. es de 6,2 FLB en incubaciones de 5 minutos.
   2. Para normalizar la suatoma por hora, utilice el siguiente cálculo: (6,2 x 12)/(6,58/100) a 1131 bacterias por célula de halteria/h.
      NOTA: Para obtener más ejemplos de distribuciones de las tasas de admisión individuales de Halteria sp. detectadas bajo temperaturas variables del agua, cantidades (como porcentajes) de FLB de trazador añadido y diferentes tiempos de incubación con FLB, véase la Figura 3.

Resultados

Ejemplo de experimento que se ejecutó en el embalse de agua de Oímov (Bohemia del Sur, CZ), que es un sitio natural con menor depredador natural in situ y abundancia de presas. Se informa de datos representativos de la especie ciliada omnívora Halteria grandinella, que es un pastor abundante y eficiente de partículas de picoplancton (<2 m)^{10,16,17,18 ,}<...

Discusión

Descifrar la interacción trófica en los sistemas acuáticos siempre es un desafío^28,especialmente a escalas de nanoplancton que involucran a los protistas y sus presas, bacterias. Cuando se trata de vías de acumulación de nutrientes y cuantificación, la aplicación de métodos utilizados con éxito en niveles tróficos más altos es menos posible, debido a la alta complejidad de las interacciones bióticas. Estos incluyen, por ejemplo, enfoques estables de etiquetado de isótopos. Este proto...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2-µm pore-size filters	SPI supplies, https://www.2spi.com/	B0225-MB	Black, polycarbonate track etch membrane filters, diameter approprite for filtering apparatus used
5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluorescein (DTAF)	Any brand
Automatic pipettes with adjustable volumes	Any brand, various sizes
Centrifuge	22 000 x g
Cryovials	Any brand, 2 mL size
DAPI (4´,6-Diamidino-2´-phenylindole dihydrochloride)	Any brand		1 mg ml-1
Epiflorescence microscope	Magnification from 400 x up to 1000 x
	Filters appropriate for viewing in the DAPI and DTAF range
	Counting grid in one of the oculars
Filtering apparatus	Usually with a diameter of 25 mm
Formaldehyde	A brand for microscopy
Glutaraldehyde	A brand for microscopy
Immersion oil for microscopy	Specific oil with low fluorescence
Lugol´s solution	Any brand or see comment		Make an alkaline Lugol' solution as follows: Solution 1 - dissolve  10 g of potassium iodide in 20 ml in MQ water, then add 5 g of iodine. Solution 2 - add 5 g of sodium acetate  to 50 ml of MQ water. Add the solution 2 to the solution 1 and thoroughly mix
Methanol stabilized formalin	Any brand available for microscopy purposes
Microscope slides and cover slips	Any brand produced for microscopy purposes
MQ water for diluting samples	Any brand
Phosphate-buffered saline (PBS; pH = 9)	Any brand		0.05 M Na2HPO4-NaCl solution, adjusted to pH 9
PPi-saline buffer	Any brand		0.02 M Na4P2O7-NaCl solution. Add 0.53 g Na4P2O7 to 100 ml of MQ water plus 0.85 g NaCl
Sampling device	Appropriate for obtaining representative sample		e.g. Friedinger sampler for lake plankton
Sodium thiosulfate solution	Any brand		3% solution is used in the protocol
Sonicator	Any brand		30 W
Vortex	Any brand allowing  thorough mixing of the solutes and samples
Water bath	Any brand allowing temperature to be maintained at 60 °C