JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يسمح فحص شريحة الجسم الحي السابق بالتصوير في الوقت الحقيقي. يتم إنشاء شرائح عن طريق تضمين E10.5 IslMN: GFP الأجنة في agarose، وتقطيع على الاهتزاز، وتنمو في حاضنة المرحلة العليا. يتم تقييم دور مسارات توجيه axon عن طريق إضافة مثبطات إلى وسائل الإعلام الثقافية.

Abstract

حركات العين دقيقة حاسمة للرؤية، ولكن تطوير نظام المحرك العين، وخاصة المسارات الجزيئية التي تسيطر على توجيه محور عصبي، لم يتم توضيحها بشكل كامل. ويرجع ذلك جزئياً إلى القيود التقنية على الاختبارات التقليدية لتوجيهات المحاور. لتحديد إشارات توجيه axon إضافية تؤثر على العصب oculomotor، تم تطوير اختبار شريحة الجسم الحي السابق لتصوير العصب الحركي في الوقت الحقيقي كما ينمو نحو العين. E10.5 يتم استخدام الأجنة Isl MN-GFP لتوليد شرائح الجسم الحي السابق عن طريق تضمينها في أغاروز، وتقطيعها على الاهتزاز، ثم زراعتها في حاضنة مجهر المرحلة أعلى مع التصوير المجهري الفاصل الزمني لمدة 24-72 ح. في توقيت الجسم الحي من نمو المحاور من النواة إلى المدار. يمكن إضافة مثبطات الجزيئات الصغيرة أو البروتينات المؤتلفة إلى وسائل الإعلام الثقافية لتقييم دور مسارات توجيه المحاور المختلفة. هذه الطريقة لديها مزايا الحفاظ على المزيد من البيئة الدقيقة المحلية التي من خلالها المحاور اجتياز، وليس الساكسوتوميس المحاور المتنامية، وتقييم المحاور في نقاط متعددة على طول مسارها. كما يمكن أن تحدد الآثار على مجموعات فرعية محددة من المحاور. على سبيل المثال، تثبيط CXCR4 يسبب المحاور لا تزال داخل الدماغ المتوسط لتنمو الظهرية بدلا من فينرالي، ولكن لا تتأثر المحاور التي خرجت بالفعل ventrally.

Introduction

يوفر نظام المحرك العيني نظام أنيق للتحقيق في آليات توجيه أكسون. وهو غير معقد نسبيا، ويتألف من ثلاثة أعصاب الجمجمة innervating ستة عضلات خارج العين (EOMs) التي تحرك العين، وlevator palpebrae superioris (LPS) الذي يرفع الجفن. العصب الحركي الداخلي LPS وأربعة EOMs - المائل السفلي والعضلات الوسيطة، السفلي، والمستقيمة متفوقة. أما الأعصاب الأخرى، وهي التروكلير وعبدهسين، فكل منهما يُعد عضلة واحدة فقط، وعضلة مستقيمة مائلة وجانبية متفوقة، على التوالي. توفر حركات العين قراءة سهلة، تظهر ما إذا كان التداخلي مناسبًا أو مفقودًا أو شاذًا. بالإضافة إلى ذلك، هناك اضطرابات حركة العين البشرية التي تنتج عن العجز في تطوير الخلايا العصبية أو توجيه axon، ويطلق عليها مجتمعة اضطرابات التأذيب القحفي الخلقية (CCDDs)1.

على الرغم من هذه المزايا، ونادرا ما يستخدم نظام السيارات العين في الدراسات التوجيهية axon2،3،4،5،6،7،8، 9 , 10، وذلك بسبب العيوب التقنية. في المختبر axon التوجيه الاختبارات لديها العديد من العيوب11. اختبار الثقافة المشتركة، التي يتم فيها زراعة explants الخلايا العصبية جنبا إلى جنب مع explants من الأنسجة المستهدفة12 أو الخلايا المنقولة13، تعتمد على كل من التماثل من explant وتحديد المواقع دقيقة بين explant والأنسجة المستهدفة. شريط الاختبارات14،15، التي يتم وضع اثنين من العظة في المشارب بالتناوب ويتم تقييم المحاور للنمو التفضيلي على شريط واحد، تشير فقط إلى أن الركيزة واحدة هي الأفضل من الأخرى، وليس أن أي منهما جذابة أو مثير للاشمئزاز، أو ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. غرف Microfluidics يمكن أن تشكل التدرجات الكيميائية الدقيقة، ولكن موضوع المحاور المتنامية لالقص الإجهاد16،17،18، والتي يمكن أن تؤثر على نموها. وعلاوة على ذلك، في كل من هذه النهج، يتطلب جمع النباتات الخارجية أو الخلايا المفككة أن تكون المحاور المتناجة، وبالتالي فإن هذه الاختبارات تدرس في الواقع تجديد أكسون، بدلاً من نمو المحاور الأولي. وأخيراً، فإن هذه النُهُج في المختبر تزيل البيئة الدقيقة التي تؤثر على المحاور واستجاباتها للإشارات على امتداد نقاط مختلفة من مسارها، وتختبر عادة إشارة واحدة فقط في عزلة. ومما يضاعف من هذه العيوب، أن صغر حجم كل نواة في نظام المحرك العيني يجعل التشريح صعباً من الناحية التقنية إما بالنسبة للنباتات المنقطعة أو الثقافات المفككة. بالإضافة إلى ذلك، الثقافات الأولية للخلايا العصبية الحركية العينية عادة ما تكون غير متجانسة، لديها موت خلايا كبير، وتعتمد على الكثافة، مما يتطلب تجميع الخلايا من أجنة متعددة (Ryosuki Fujiki، الاتصال الشخصي). في طرق الجسم الحي، ومع ذلك، بما في ذلك نماذج الماوس خروج المغلوب، غير مناسبة للاستخدام للفحص، نظرا للوقت والنفقات المطلوبة.

الطرق التي تم تطويرها لثقافة الأجنة الكاملة19 تسمح بوسم الخلايا المهاجرة20 أو حصار جزيئات محددة21، ولكن الثقافات الجنينية كلها تتطلب الحضانة في زجاجات الأسطوانة التي تحول دون التصوير في الوقت الحقيقي من المسمى الهياكل. التقنيات الجراحية التي تسمح بالتلاعب في الجنين ومن ثم مزيد من التطور اللاحق إما في الرحم أو في بطن الأم (الحفاظ على اتصال المشيمة)22 ممكنة أيضا، ولكن هذه أيضا لا تسمح بفاصل زمني التصوير.

للتغلب على العقبات من الاختبارات في المختبر والسماح بالفحص السريع لمسارات الإشارات، تم تطوير تقنية ثقافة الشريحة الجنينية من الجسم الحي السابق23، مقتبسة من بروتوكول نشر سابقا لنمو الأعصاب المحيطية24. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن تصوير العصب الحركي النامي مع مرور الوقت في وجود العديد من الهياكل المحيطة على طول مساره، بما في ذلك أهداف EOM. من خلال إضافة مثبطات جزيء صغير، وعوامل النمو، أو العظة التوجيه إلى وسائل الإعلام الثقافة، يمكننا تقييم الاضطرابات التوجيه في نقاط متعددة على طول مسار محور محور محور، مما يسمح بتقييم أسرع للنمو المحتمل ة وعوامل التوجيه.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الأعمال الحيوانية الموصوفة هنا وتنفيذها وفقا لبروتوكولات لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للالحيوانات (IACUC) في مستشفى بوسطن للأطفال.

1. التزاوج في الوقت المناسب

  1. مكان ISLMN:GFP (جزيرة الخلايا العصبية الحركية بروتين الفلورسنت الأخضر; MGI: J:132726; جاكس Tg (Isl-EGFP *) 1Slp / J الأسهم رقم: 017952) الذكور والإناث الفئران معا بين عشية وضحاها. وزن الإناث والأوزان القياسية قبل التزاوج.
    ملاحظة: ISLMN:GFP تسميات على وجه التحديد الخلايا العصبية الحركية مع GFP farnesylated التي ليست سامة للخلايا، وتوطين غشاء الخلية من الخلايا العصبية الحركية ومحاورها، ويسمح للأعصاب أن تصور خلال التنمية25. ويمكن أيضا استخدام خطوط أخرى تحمل علامة الفلورسنت.
  2. تحقق من وجود سدادات مهبلية في الصباح الباكر. يتم تعيين تاريخ تحديد المكونات على أنه E0.5.
  3. تأكد من الحمل باستخدام زيادة الوزن و/أو الموجات فوق الصوتية في E10.5. السدود الحامل يجب أن اكتسبت ما لا يقل عن 1 غرام يمكن رؤية الأجنة على الموجات فوق الصوتية في E10.5.

2. إعداد الكواشف والاهتزاز لثقافة شريحة

  1. إعداد 500 مل من العازلة التقطيع: إضافة 5 مل من HEPES و 5 مل من البنسلين / العقديات إلى 500 مل من محلول الملح المتوازن هانك (HBSS) دون Ca2 + و Mg2+.  البرد إلى 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: يجب تخزين المخزن المؤقت تشريح إضافية في 4 °C ويمكن استخدامها لتجارب ثقافة الشريحة في المستقبل.
  2. إعداد 50 مل من وسائل الإعلام الثقافة: في غطاء محرك السيارة المعقمة، إضافة 12.5 مل من HBSS، 12.5 مل من مصل البقر الجنيني، 250 ميكرولتر من الجلوكوز، 250 ميكرولتر من L-الجلوتامين، 125 ميكرولتر من HEPES إلى 24.4 مل من DMEM فلوروبرايت. (التركيزات النهائية: FlouroBright DMEM مع 25٪ HBSS، 25٪ FBS، 0.5٪ الجلوكوز، 1 MM الجلوتامين، و 2.5 مليون متر HEPES.).  تُسخّن وسائل الإعلام الثقافية إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي معقم.
    ملاحظة: يمكن تخزين وسائط الثقافة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع.
    1. في غطاء محرك السيارة العقيم، إضافة 1.5 مل من وسائل الإعلام الثقافة إلى كل بئر من لوحة 6 جيدا.  إضافة إدراج ثقافةالخلية (جدول المواد) إلى كل بئر.  توضع في حاضنة معقمة 37 درجة مئوية و 5% من ثاني أكسيد الكربون.
  3. إعداد 4٪ درجة حرارة منخفضة ذوبان أغاروز: حل 2 غرام من درجة الحرارة منخفضة ذوبان أجاروز في 50 مل من PBS المعقمة. الميكروويف في فترات 30-60 s حتى يذوب بالكامل. توضع في حمام مائي 40 درجة مئوية للحفاظ على السائل.
    ملاحظة: يمكن تخزين أغاروز إضافية في درجة حرارة الغرفة (RT) وذاب لتجارب ثقافة شريحة في المستقبل.
  4. إعداد الاهتزاز: وضع شفرة جديدة على الاهتزاز. التحقق من الإعدادات: سمك 400-450 درجة مئوية. ضع بعض الثلج في الغرفة الخارجية استخدام غرفة ومرحلة مخصصة للشرائح الحية. لا تستخدم نفس غرفة الاهتزاز للأنسجة الثابتة كما المثبت المتبقية يمكن أن تكون ضارة للشرائح.
  5. إعداد مرحلة المجهر أعلى حاضنة إلى 37درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  6. الاستعداد للتشريح: أدوات جراحية نظيفة ورذاذ مع الإيثانول 70٪. ملء اثنين من أطباق بيتري مع HBSS، ووضع على الجليد. فتح 12 لوحة ثقافة الأنسجة جيدا ووضع الغطاء على الجليد مع الجانب السفلي التي تواجه ما يصل. فتح 6 لوحة ثقافة الأنسجة جيدا ووضع إدراج غشاء ثقافة الخلية و 1.5 مل وسائل الإعلام ثقافة الخلية في كل بئر. قبل تسخين لوحة في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.

3. حصاد E10.5 الأجنة وإعداد شرائح

ملاحظة: يجب أن يتم إجراء كافة الخطوات من هذه النقطة في أسرع وقت ممكن. إبقاء الأجنة على الجليد في جميع الأوقات.

  1. قتل الرجل في السد الحامل (E10.5) في غرفة CO2. إجراء خلع عنق الرحم.
  2. رش البطن مع الإيثانول 70٪. قطع فتح البطن مع مقص، وإزالة الرحم ووضعها في طبق بيتري مع HBSS الجليد الباردة لغسل الدم بسرعة. نقل الرحم غسلها إلى بيتري الثانية مليئة طبق الجليد HBSS.
  3. تحت نطاق تشريح، إزالة الأجنة من قرن الرحم والحصاق السلوي الفردية. ضع الأجنة على الجانب السفلي من غطاء طبق 12 بئر. حافظ على الثلج
  4. تحت نطاق تشريح، استخدم ورقة التصفية لإزالة أي سائل يحيط بكل جنين.
    ملاحظة: سوف تلتصق الأجنة بورقة التصفية إذا تم لمسها.
  5. تضمين الأجنة في أغاروز. صب الأغروز المذاب على كل جنين لتغطية ذلك. حافظ على الثلج بمجرد أن تصلب الأجاروز، الوجه كل جنين وصب أجاروز إضافية على الجانب الآخر. حافظ على الثلج
  6. باستخدام نطاق تشريح الفلورسنت، تقليم الأجاروز حول كل جنين لذلك سيتم توجيهها بشكل صحيح عند لصقها على مرحلة الاهتزاز. النواة الحركية وفرط الأكسون المبكر هي الفلورسنت. محاذاة الجنين بحيث تشكل النواة، والمحاور التي تنمو، والعين خطًا، وتقليم الأجاروز بشفرة حلاقة مقطوعة بالتوازي مع هذا الخط (الظهرية للجنين، انظر الشكل 1A).
    ملاحظة: هذا سيكون الجانب لصقها على مرحلة الاهتزاز (سيتم وضع الجنين على ظهره، رئيس أقرب إلى شفرة الاهتزاز). يجب أن يكون الخط بين النواة الحركية والعين موازية لشفرة الاهتزاز.
  7. ملء غرفة الاهتزاز مع الجليد الباردة شريحة العازلة. Superglue الجنين إلى مرحلة الاهتزاز بحيث شفرة سوف تكون موازية مع نواة oculomotor والعينين. بمجرد أن يجف الغراء الفائق، غمر مرحلة الاهتزاز حتى يتم توجيه الجنين التي تواجه بعيدا عن شفرة.
  8. شريحة 400-450 شرائح ميكرومتر.  جمع كل شريحة مع الأنابيب نقل معقمة. توضع في مخزن مؤقت للتقطيع البارد.
  9. تحت نطاق تشريح، واختيار شريحة تحتوي على النوى oculomotor والعينين. باستخدام أنبوب نقل معقمة، وضعه على ثقافة الخلية إدراج في لوحة الآبار 6. العودة لوحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية. بدلا من ذلك، يكون شخص واحد تشريح وآخر وضع الشرائح. تقليل الوقت بين التقطيع ووضعها في الحاضنة.
    ملاحظة: يجب توجيه الشرائح بطريقة تكون فيها الفلورة القصوى المنبعثة من النوى والمحاور الأقرب إلى هدف مجهر التصوير. على المجهر المقلوب ، يجب وضع الشرائح على الغشاء مع النوى والمحاور الأقرب إلى الهدف تحت اللوحة.
  10. إزالة أغاروز المتبقية من مرحلة الاهتزاز، superglue الجنين التالي إلى المرحلة وتكرار الخطوات 3.7-3.9 حتى يتم تقطيع جميع الأجنة ومطلي.
  11. إضافة مثبط أو جزيء المؤتلف من الاختيار إلى وسائل الإعلام في كل بئر لخلق منحنى الجرعة استجابة.  تمييع في المذيبات المناسبة.
    ملاحظة: في حالة استخدام DMSO، استخدم درجة زراعة الأنسجة فقط DMSO. بدلا من ذلك، يمكن وضع حبات البروتين eluting في مواقع محددة على شريحة.
  12. ضععلى المجهر في غرفة 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.  تعيين المجهر لاتخاذ التباين المرحلة والصور الفلورية من كل شريحة كل 30 دقيقة (أو في كثير من الأحيان إذا رغبت في ذلك). يمكن الحفاظ على شرائح لمدة 48-72 ساعة.

النتائج

النتائج العادية: يوفر الشكل 1 مخططًا للتجربة. بدءا من وقت مبكر من E9.5 في الماوس، تبدأ المحاور الأولى في الخروج من نواة oculomotor26. بواسطة E10.5، يمكن رؤية العصب الحركي اللفاف، الذي يحتوي على الخلايا العصبية الرائدة في وقت مبكر، في mesenchyme. هناك تباين كبير بين الأجنة في E10...

Discussion

يوفر هذا البروتوكول ثقافة شريحة الجسم الحي السابق مزايا كبيرة على الاختبارات التوجيه axon التقليدية23. حجم كل نواة المحرك القحفي ليس عاملا ً مقيداً، وليس من الضروري إجراء تشريح صعب. البيئة الدقيقة الذاتية التي يتم من خلالها الحفاظ على مسارات المحاور، مما يسمح بتعديل مسار إشارة ...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

التمويل المقدم من المعهد الوطني للعيون [5K08EY027850]، المعهد الوطني لصحة الطفل ونمائه [U54HD090255]، برنامج هارفارد فيجن لتطوير العلماء السريريين [5K12EY016335]، مؤسسة فرسان تمبلر للعيون [بداية مهنية] منحة] ومؤسسة طب العيون في مستشفى الأطفال [جائزة اكتشاف الكلية]. اللجنة الاقتصادية لأوروبا هو محقق معهد هوارد هيوز الطبي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
24-Well Tissue Culture PlateGenesee Scientific25-107
6-Well Tissue Culture PlateGenesee Scientific25-105
Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass)VWR14672-200
Fine ForcepsFine Science Tools11412-11
Fluorobrite DMEMThermo Fisher ScientificA1896701
Glucose (200 g/L)Thermo Fisher ScientificA2494001
Hank's Balanced Salt Solution (1X)Thermo Fisher Scientific14175-095
Heat Inactivated Fetal Bovine SerumAtlanta BiologicalsS11550H
HEPES Buffer Solution (1M)Thermo Fisher Scientific15630106
L-Glutamine (250 nM)Thermo Fisher Scientific25030081
Loctite SuperglueLoctite
Low Melting Point AgaroseThermo Fisher Scientific16520050
Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um)Millipore SigmaPICM03050
Moria Mini Perforated SpoonFine Science Tools10370-19
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122 
Petri Dish (100 x 15mm)Genesee Scientific32-107G
Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4)Thermo Fisher Scientific10010049
Razor BladesVWR55411-050
Surgical Scissors - BluntFine Science Tools14000-12
Ti Eclipse Perfect Focus with TIRFNikon
Vibratome (VT 1200S)Leica1491200S001
Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel)Ted Pella, Inc.121-6

References

  1. Whitman, M. C., Engle, E. C. Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance. Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).
  2. Giger, R. J., et al. Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins. Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).
  3. Chen, H., et al. Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections. Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).
  4. Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
  5. Cheng, L., et al. Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling. Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).
  6. Tischfield, M. A., et al. Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance. Cell. 140 (1), 74-87 (2010).
  7. Kim, M., et al. Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction. Developmental Biology. 399 (1), 68-79 (2015).
  8. Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).
  9. Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
  10. Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
  11. Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).
  12. Ebendal, T., Jacobson, C. O. Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia. Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).
  13. Dazert, S., et al. Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro. Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).
  14. Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons. Development. 101 (4), 909-913 (1987).
  15. Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).
  16. Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).
  17. Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture. Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).
  18. Keenan, T. M., Folch, A. Biomolecular gradients in cell culture systems. Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).
  19. Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. Tangential migration in neocortical development. Developmental Biology. 244 (1), 155-169 (2002).
  20. Miquelajauregui, A., et al. LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).
  21. Garcia-Pena, C. M., et al. Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).
  22. Ngo-Muller, V., Muneoka, K. In utero and exo utero surgery on rodent embryos. Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).
  23. Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative ophthalmology & visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
  24. Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth. Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).
  25. Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).
  26. Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. Initial tract formation in the mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).
  27. Michalak, S. M., et al. Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle. Investigative ophthalmology & visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).
  28. Lewellis, S. W., et al. Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay. The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).
  29. Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145 (10), (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

149oculomotoraxon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved