배아 GFP 발현 마우스에서 전 Vivo Oculomotor 슬라이스 배양 Oculomotor 신경 파생의 시간 경과 화상 진찰을 위한

요약

ex vivo 슬라이스 분석은 oculomotor 신경 성장을 실시간으로 심상화할 수 있게 합니다. 슬라이스는 E10.5 Isl^MN:GFP 배아를 아가로오스에 포함시키고, 진동을 슬라이스하고, 스테이지 탑 인큐베이터에서 성장시킴으로써 생성됩니다. 축색 유도 경로의 역할은 배양 배지에 억제제추가에 의해 평가됩니다.

초록

정확한 눈 움직임은 시력에 매우 중요하지만, 안구 모터 시스템, 특히 축사 지도를 제어하는 분자 경로의 개발은 완전히 해명되지 않았습니다. 이것은 부분적으로 전통적인 축색 지도 방법의 기술적인 한계 때문이. 오큘로모터 신경에 영향을 미치는 추가적인 축삭 유도 신호를 식별하기 위해, 눈쪽으로 성장함에 따라 실시간으로 오큘로모터 신경을 이미지화하는 생체내 슬라이스 분석법이 개발되었다. E10.5 Isl^MN-GFP 배아는 아가로오스에 포함시키고, 진동체에 슬라이스한 다음, 24-72시간 동안 타임랩스 광현미경으로 현미경 스테이지 탑 인큐베이터에서 성장시켜 생체 내 조각을 생성하는 데 사용됩니다. 핵에서 궤도에 축산의 성장의 생체 내 타이밍. 소분자 억제제 또는 재조합 단백질은 배양 배지에 첨가되어 상이한 축세포 유도 경로의 역할을 평가할 수 있다. 이 방법은 축슨이 통과하는 국소 미세 환경을 더 많이 유지하고 성장하는 축축을 축축화하지 않고 궤적을 따라 여러 지점에서 축을 평가하는 장점이 있습니다. 또한 축색의 특정 하위 집합에 미치는 영향을 식별할 수 있습니다. 예를 들면, CXCR4의 억제는 통풍구보다는 오히려 등등 성장하는 중뇌 안에 아직도 축을 일으키는 원인이 됩니다, 그러나 이미 통풍구로 종료한 축산은 영향을 받지 않습니다.

서문

안구 모터 시스템은 축색 가이던스 메커니즘을 조사하기 위한 우아한 시스템을 제공합니다. 그것은 눈을 움직이는 6개의 외눈 근육 (EOMs)를 심두는 3개의 두개골 신경 및 눈꺼풀을 들어 올리는 levator palpebrae 우월증 (LPS)로 이루어져 있는 상대적으로 복잡하지 않습니다. oculomotor 신경은 LPS와 4개의 EOMs를 내심합니다 - 열등한 경사및 내측, 열등한, 및 우수한 직류 근육. 다른 두 신경, trochlear 및 abducens, 각각 하나의 근육을 내면, 우수한 경사 및 측면 직사각형 근육, 각각. 눈의 움직임은 쉽게 판독할 수 있으며, 내면이 적절한지, 누락되었는지, 또는 비정상적인지를 보여 줄 수 있습니다. 추가적으로, 선천적인 두개골 배화 무질서 (CCDDs)를 집합적으로 불리는 신경 발달 또는 축세포 지도에 있는 적자에서 유래하는 인간 눈 운동 무질서가^있습니다1.

이러한 장점에도 불구하고, 안구 모터 시스템은 거의 축사 유도 연구^{2,3,4,5,6,7,8에}사용되지않습니다. ^{9개 , 10}, 기술적 인 단점으로 인해. 시험관 내 축색안내는 많은 단점을 가지고^11. 공동 배양 분석, 있는 뉴런 이식 대상 조직¹² 또는 형질 감염 세포^13의이종과 함께 배양되는, 이식의 대칭 과 이식 과 표적 조직 사이의 정확한 위치 모두에 의존한다. 스트라이프 어세이^14,15, 두 개의 큐가 교대로 줄무늬에 배치되고 축사가 하나의 스트라이프에 우선 성장을 위해 평가되는 경우, 하나의 기판이 다른 기판보다 바람직하다는 것을 나타냅니다. 또는 반발, 또는 생리학적으로 관련이 있습니다. 미세 유체 챔버는 정확한 화학 구배를 형성 할 수 있지만, 대상 성장 축은 응력^16,17,18을전단, 이는 자신의 성장에 영향을 미칠 수 있습니다. 더욱이, 이 접근의 각각에서, 이식 또는 해리세포를 수집하는 것은 성장하는 축삭이 축삭을 축삭화하고 따라서 이 계산이 실제로 초기 축삭 자성장 보다는 오히려 축삭 재생을 검토한다는 것을 요구합니다. 마지막으로, 이러한 시험관 내 접근법은 축축한 축세포에 영향을 미치는 미세 환경을 제거하고 코스의 다른 지점을 따라 큐에 대한 반응, 전통적으로 격리된 하나의 큐만 테스트합니다. 이러한 단점을 복합화, 안구 모터 시스템에서 각 핵의 작은 크기는 해부 기술적으로 이식 또는 해리 된 문화에 대한 도전한다. 추가적으로, 안구 운동 뉴런의 1 차적인 배양은 일반적으로 이질적이고, 중요한 세포 죽음이 있고, 다중 태아에게서 세포의 풀링을 요구하는 밀도 의존적입니다 (료스키 후지키, 개인적인 커뮤니케이션). 그러나 녹아웃 마우스 모델을 포함한 생체 내 방법은 필요한 시간과 비용을 감안할 때 스크리닝에 사용하기에 적합하지 않습니다.

배양 전체 배아^19에 개발된 방법은 이동 세포^20의 라벨링 또는 특정 분자^21의봉쇄를 허용하지만, 전체 배아 배양은 라벨의 실시간 이미징을 배제하는 롤러 병에서 배양을 필요로 합니다. 구조. 태아의 조작을 허용하고 그 후에 추가 발달을 허용하는 외과 기술은 자궁에서 또는 어머니의 복부에 있는 (태반 연결을 유지함)^22또한 가능합니다, 그러나 이들은 또한 시간 경과를 허용하지 않습니다 이미징.

시험관내 분석의 장애물을 극복하고 신호 경로의 신속한 스크리닝을 허용하기 위해, 생체내 배아 슬라이스 배양 기법은^23,말초 신경 발생에 대한 이전에 발표된 프로토콜로부터 적응된^24. 이 프로토콜을 사용하여, 개발 oculomotor 신경은 EOM 표적을 포함하여 그것의 궤도를 따라 그것의 궤도의 많은 의 존재에서 시간이 지남에 따라 영상화될 수 있습니다. 배양 배지에 소분자 억제제, 성장 인자 또는 안내 신호를 추가함으로써 축색 궤적을 따라 여러 지점에서 지침 교란을 평가하여 잠재적 인 성장 및 지침 요인을 보다 신속하게 평가할 수 있습니다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 동물 작업은 보스턴 아동 병원 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC) 프로토콜을 준수하여 승인및 수행되었습니다.

1. 시간 적시 짝짓기

1. 장소 ISL^MN:GFP (아일렛 모터 뉴런 녹색 형광 단백질; MGI: J:132726; Jax Tg (Isl-EGFP*)1Slp/J 스톡 번호: 017952)수컷 및 암컷 마우스를 하룻밤 동안 함께. 짝짓기 전에 암컷의 무게와 기록 가중치를 측정합니다.
   참고: ISL^MN:GFP는 특히 세포독성이 없는 원거리 GFP로 운동 뉴런을 분류하고, 운동 뉴런과 축삭의 세포막을 국소화하고, 개발²⁵동안 신경을 시각화할 수 있게 한다. 다른 형광 표지 된 라인도 사용할 수 있습니다.
2. 이른 아침에 질 플러그를 확인합니다. 플러그가 식별된 날짜는 E0.5로 지정됩니다.
3. E10.5에서 체중 증가 및 / 또는 초음파를 사용하여 임신을 확인하십시오. 임신 한 댐은 적어도 1 g을 얻었어야합니다.

2. 슬라이스 배양시 시약 및 진동 준비

1. 슬라이스 버퍼 500 mL 준비: Ca 2+ 및 Mg²⁺없이 500 mL의 행크의 균형 잡힌 소금 솔루션 (HBSS)에 500 mL에 HEPES 5 mL과 페니실린/스트렙토마이신 5 mL를 추가하십시오.  4 °C로 냉각.
   참고: 추가 슬라이스 버퍼는 4°C에 저장해야 하며 향후 슬라이스 배양 실험에 사용할 수 있습니다.
2. 배양 배지 50 mL 준비: 멸균 후드에 HBSS 12.5 mL, 태아 소 세럼 12.5 mL, 포도당 250 μL, L-글루타민 250 μL, HEPES 125 μL을 Fluorobright DMEM 의 24.4 mL에 추가하십시오. (최종 농도: 25% HBSS, 25% FBS, 0.5% 포도당, 1 mM 글루타민, 및 2.5 mM HEPES를 가진 FlouroBright DMEM.).  멸균 수조에서 배양 배지를 37°C로 데운다.
   참고: 배양 배지는 최대 3주 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.
   1. 멸균 후드에 6웰 플레이트의 각 웰에 1.5 mL의 배양 배지를 추가합니다.  각 웰에 세포배양 삽입(재료 표)을 추가합니다.  멸균 37°C 및 5%_CO2 인큐베이터에 놓습니다.
3. 4% 저용융 온도 아가로즈 준비: 멸균 PBS 50 mL에 저용융 온도 아가로즈 2 g을 용해시다. 완전히 녹을 때까지 30-60s 간격으로 전자레인지에 돌리자. 액체를 유지하기 위해 40 °C 의 수조에 놓습니다.
   참고: 여분의 아가로즈는 실온(RT)에 보관하고 향후 슬라이스 배양 실험을 위해 용융될 수 있습니다.
4. 비브라토메 설정: 비브라토메에 새 블레이드를 놓습니다. 설정 확인: 두께 400-450 μm. 진동 스테이지를 미리 냉각시. 바깥 챔버에 얼음을 놓습니다. 라이브 슬라이스 전용 챔버와 무대를 사용합니다. 잔류 고정제는 슬라이스에 손상을 줄 수 있기 때문에 고정 된 조직에 동일한 진동 챔버를 사용하지 마십시오.
5. 37°C 및 5% CO2로 현미경 스테이지 상부인큐베이터를 준비한다.
6. 해부 준비: 외과 용 기구를 청소하고 70 % 에탄올로 스프레이하십시오. HBSS로 페트리 요리 두 개를 채우고 얼음 위에 놓습니다. 12 개의 잘 조직 배양 판을 열고 아래쪽을 위로 향하여 얼음 위에 뚜껑을 놓습니다. 6개의 웰 조직 배양판을 열고 세포배양막 삽입체와 1.5 mL 세포배양배지를 각각 잘 배치한다. 플레이트를 37°C 및 5% CO2 인큐베이터로 예온시.

3. E10.5 배아 수확 및 슬라이스 준비

참고: 이 시점의 모든 단계는 가능한 한 빨리 수행해야 합니다. 배아를 항상 얼음 위에 두십시오.

1. _CO2 챔버에서 임신 한 댐 (E10.5)을 안락사시하십시오. 자궁 경부 탈구를 수행합니다.
2. 복부에 70 % 에탄올을 뿌린다. 가위로 복부를 열고 자궁을 제거하고 얼음 차가운 HBSS가있는 페트리 접시에 놓아 혈액을 빨리 씻어 냅니다. 씻은 자궁을 차가운 HBSS 접시얼음으로 채워진 두 번째 페트리로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮기다.
3. 해부 범위에서 자궁 경적과 개별 양수 낭에서 배아를 제거하십시오. 배아를 12개의 우물 판의 뚜껑 밑면에 놓습니다. 얼음에 보관하십시오.
4. 해부 범위에서 필터 페이퍼를 사용하여 각 배아를 둘러싼 액체를 제거합니다.
   참고: 배아는 만지면 필터 용지에 달라붙습니다.
5. 아가로즈에 배아를 포함시다. 녹은 아가로스를 각 배아에 부어 덮습니다. 얼음에 보관하십시오. 아가로즈가 굳어지자마자, 각 배아를 뒤집어서 다른 쪽에 아가로스를 부었다. 얼음에 보관하십시오.
6. 형광 해부 범위를 사용하여 각 배아 주위의 아가로스를 다듬어 진동 단계에 접착할 때 제대로 방향을 잡을 수 있도록 합니다. 오큘로 운동 핵과 초기 축슨 자성장은 형광입니다. 배아를 정렬하여 핵, 자라나는 축사 및 눈이 선을 형성하도록 하고, 이 선과 평행하게 절단된 면도날로 아가로즈를 다듬습니다(배아에 등쪽, 그림 1A참조).
   참고 : 이것은 진동 단계에 붙어있는 측면이 될 것입니다 (배아는 뒤쪽에 위치하며 진동 블레이드에 가장 가까운 머리). 오큘로모터 핵과 눈 사이의 선은 진동 블레이드와 평행해야 합니다.
7. 얼음 차가운 슬라이스 버퍼로 비브라토메 챔버를 채웁니다. 블레이드가 oculomotor 핵 및 눈과 평행하게 되도록 비브라토메 단계에 배아를 초접착제. 수퍼글루가 마르면 진동 기를 잠수하여 배아가 칼날에서 멀어지도록 합니다.
8. 슬라이스 400-450 μm 슬라이스.  멸균 전사 파이펫으로 각 슬라이스를 수집합니다. 차가운 슬라이스 버퍼에 넣습니다.
9. 해부 범위에서, oculomotor 핵과 눈을 포함하는 슬라이스를 선택합니다. 멸균 전사 파이펫을 사용하여, 6웰 플레이트에 세포 배양 인서트 위에 놓는다. 플레이트를 37°C 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 또는 한 사람이 슬라이스하고 다른 사람이 슬라이스를 배치하게 합니다. 슬라이스와 인큐베이터에 배치하는 사이의 시간을 최소화합니다.
   참고: 핵과 축세포에서 방출되는 최대 형광이 이미징 현미경 목표에 가장 가까운 방식으로 슬라이스를 지향해야 합니다. 거꾸로 된 현미경에서, 조각은 플레이트 아래의 목표에 가장 가까운 핵과 축색과 멤브레인에 배치해야합니다.
10. 진비암 단계에서 잔류 아가로스를 제거하고, 다음 배아를 단계로 슈퍼 접착제로 만들고 모든 배아가 슬라이스되고 도금될 때까지 3.7-3.9 단계를 반복합니다.
11. 억제제 또는 재조합 분자를 각각의 웰에 매개체에 첨가하여 투여-반응 곡선을 생성한다.  적절한 용매로 희석하십시오.
    참고: DMSO를 사용하는 경우 조직 배양 등급 DMSO만 사용하십시오. 대안적으로, 단백질 용출 비드는 슬라이스의 특정 위치에 배치될 수 있다.
12. 37°C 및 5% CO2 챔버에 현미경을 놓습니다.  현미경을 설정하여 각 조각의 위상 대비 및 형광 사진을 30 분마다 (또는 원하는 경우 더 자주) 촬영하십시오. 슬라이스는 48-72 시간 동안 유지 될 수있다.

결과

일반 결과: 그림 1은 실험의 개략적 을 제공합니다. 마우스에서 E9.5부터 시작하여, 첫 번째 축색은 oculomotor 핵^26에서나오기 시작합니다. E10.5에 의해, 초기 개척자 뉴런을 포함하는 매혹적인 oculomotor 신경은, 중간엽에서 볼 수 있습니다. E10.5에서 배아 사이의 상당한 가변성이 있다 (심지어 같은 쓰레기 내에서) 얼마나 멀리 신경 궤도쪽으로 진행 되었습니다., ...

토론

이러한 생체내 슬라이스 배양 프로토콜은 전통적인 축삭유도 분석(23)에 비해 상당한 이점을 제공한다. 각 두개골 운동 핵의 크기는 제한 요인이 아니며 어려운 해부가 필요하지 않습니다. 축사 이동을 통해 내인성 미세 환경은 다른 신호 경로를 유지하면서 하나의 신호 통로의 수정을 허용. 또한 축색 궤적을 따라 다른 지점에서 효과를 평가할 수 있습니다. 축색 안내는 경로

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-Well Tissue Culture Plate	Genesee Scientific	25-107
6-Well Tissue Culture Plate	Genesee Scientific	25-105
Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass)	VWR	14672-200
Fine Forceps	Fine Science Tools	11412-11
Fluorobrite DMEM	Thermo Fisher Scientific	A1896701
Glucose (200 g/L)	Thermo Fisher Scientific	A2494001
Hank's Balanced Salt Solution (1X)	Thermo Fisher Scientific	14175-095
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11550H
HEPES Buffer Solution (1M)	Thermo Fisher Scientific	15630106
L-Glutamine (250 nM)	Thermo Fisher Scientific	25030081
Loctite Superglue	Loctite
Low Melting Point Agarose	Thermo Fisher Scientific	16520050
Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um)	Millipore Sigma	PICM03050
Moria Mini Perforated Spoon	Fine Science Tools	10370-19
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri Dish (100 x 15mm)	Genesee Scientific	32-107G
Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4)	Thermo Fisher Scientific	10010049
Razor Blades	VWR	55411-050
Surgical Scissors - Blunt	Fine Science Tools	14000-12
Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF	Nikon
Vibratome (VT 1200S)	Leica	1491200S001
Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel)	Ted Pella, Inc.	121-6