Ex Vivo Oculomotor Slice Coltura da embrionico GFP-Expressing Mice per Time-Lapse Imaging di Oculomotor Nerve Outgrowth

Riepilogo

Un test etta ex vivo permette di immaginare l'escrescenza del nervo oculomotore in tempo reale. Le fette vengono generate incorporando embrioni E10.5 Isl^MN:GFP in agarose, tagliando su un vibratoma e crescendo in un incubatore stage-top. Il ruolo dei percorsi di orientamento degli assoni viene valutato aggiungendo inibitori ai mezzi di coltura.

Abstract

Movimenti accurati degli occhi sono cruciali per la visione, ma lo sviluppo del sistema motorio oculare, in particolare le vie molecolari che controllano la guida degli assi, non è stato completamente chiarito. Ciò è in parte dovuto ai limiti tecnici dei tradizionali saggi di orientamento degli assoni. Per identificare ulteriori segnali di guida ascia che influenzano il nervo oculomotore, è stato sviluppato un saggio ex vivo per immaginare il nervo oculomotore in tempo reale man mano che cresce verso l'occhio. Gli embrioni E10.5 Isl^MN-GFP vengono utilizzati per generare fette ex vivo incorporandole in agarose, tagliandole su un vibratoma, per poi coltivarle in un'incubatrice a stadio al microscopio con fotomicroscopia time-lapse per 24-72 h. Le fette di controllo riassumono il ricapitolare il tempismo in vivo della crescita degli assoni dal nucleo all'orbita. Gli inibitori delle piccole molecole o le proteine ricombinanti possono essere aggiunti ai mezzi di coltura per valutare il ruolo dei diversi percorsi di guida degli assoni. Questo metodo ha i vantaggi di mantenere più del microambiente locale attraverso il quale gli assoni attraversano, non assiomizzando gli assoni in crescita e valutando gli assoni in più punti lungo la loro traiettoria. Può anche identificare gli effetti su specifici sottoinsiemi di assoni. Ad esempio, l'inibizione di CXCR4 fa sì che gli assoni ancora all'interno del midbrain crescano dorsalmente piuttosto che ventralmente, ma gli assoni che sono già usciti dal ventralsi non sono interessati.

Introduzione

Il sistema motore oculare fornisce un elegante sistema per studiare i meccanismi di guida degli assoni. È relativamente semplice, costituito da tre nervi cranici che innervadono sei muscoli extraoculari (EOM) che muovono l'occhio, e la superiorità levatore palpebra (LPS) che solleva la palpebra. Il nervo oculomotore innerva l'LPS e quattro EOM - i muscoli obliqui inferiori e mediali, inferiori e superiori. Gli altri due nervi, il trochlear e l'abducens, ognuno solo innervare un muscolo, il superiore obliquo e muscolo di retto laterale, rispettivamente. I movimenti oculari forniscono una facile lettura, mostrando se l'innervazione era appropriata, mancante o aberranti. Inoltre, ci sono disturbi del movimento dell'occhio umano che derivano da deficit nello sviluppo neuronale o guida assone, collettivamente chiamato i disturbi didisinnervazione cranica congeniti (CCDD)¹.

Nonostante questi vantaggi, il sistema motorio oculare è raramente utilizzato negli studi di guida degli assoni^{2,3,4,5,6,7,8, 9} (in vie ^{, 10}, a causa di inconvenienti tecnici. I saggi di guida assoni in vitro hanno molti svantaggi¹¹. I saggi di co-coltura, in cui gli espiante neuronali vengono coltivati insieme agli espianti del tessuto bersaglio¹² o delle cellule trasfette¹³, dipendono sia dalla simmetria dell'espianto che dal posizionamento preciso tra l'espianto e il tessuto bersaglio. I saggi Striscia^14,15, in cui due spunti sono disposti a strisce alternate e gli assoni sono valutati per la crescita preferenziale su una striscia, indicano solo che un substrato è preferibile all'altro, non che uno dei due sia attraente o ripugnante, o fisiologicamente rilevante. Le camere microfluidiche possono formare precisi gradienti chimici, ma soggetti a picconi in crescita per inclinare lo stress di taglio^16,17,18, che possono influenzare la loro crescita. Inoltre, in ciascuno di questi approcci, la raccolta di espianti o cellule dissociate richiede che gli assoni in crescita in crescita siano assitopi e quindi questi saggi esaminino effettivamente la rigenerazione degli assoni, piuttosto che la crescita iniziale degli assoni. Infine, questi approcci in vitro rimuovono il microambiente che influenza gli assoni e le loro risposte ai segnali lungo diversi punti del loro corso, e tradizionalmente testano solo un segnale in isolamento. A complicare questi svantaggi, le piccole dimensioni di ogni nucleo nel sistema motorio oculare rendono la dissezione tecnicamente difficile per gli espianti o per le colture dissociate. Inoltre, le colture primarie di motoneuroni oculari sono di solito eterogenee, hanno una morte cellulare significativa e dipendono dalla densità, richiedendo il raggruppamento di cellule da embrioni multipli (Ryosuki Fujiki, comunicazione personale). I metodi in vivo, tuttavia, compresi i modelli di topo a foratura, sono inappropriati da utilizzare per lo screening, dati i tempi e le spese richiesti.

Metodi sviluppati per la coltura di embrioni interi¹⁹ consentono l'etichettatura delle cellule migratorie²⁰ o il blocco di molecole specifiche²¹, ma le colture intere embrionali richiedono incubazione in bottiglie a rulli che preclude l'imaging in tempo reale di etichettato Strutture. Sono possibili anche tecniche chirurgiche che consentono la manipolazione dell'embrione e il successivo ulteriore sviluppo sia nell'utero che nell'addome della madre (mantenendo la connessione placentare)^22, ma anche queste non consentono il time-lapse Imaging.

Per superare gli ostacoli dei saggi in vitro e consentire uno screening rapido dei percorsi di segnalazione, è stata sviluppata una tecnica di coltura a fette embrionale ex vivo²³, adattata da un protocollo precedentemente pubblicato per la escrescenza del nervo periferico²⁴. Utilizzando questo protocollo, il nervo oculomotore in via di sviluppo può essere immaginato nel tempo in presenza di molte delle strutture circostanti lungo la sua traiettoria, compresi gli obiettivi dell'oOM. Aggiungendo inibitori di piccole molecole, fattori di crescita o indicazioni guida ai media di coltura, possiamo valutare le perturbazioni di orientamento in più punti lungo la traiettoria dell'assone, consentendo una valutazione più rapida dei potenziali fattori di crescita e di guida.

Protocollo

Tutto il lavoro sugli animali qui descritto è stato approvato ed eseguito in conformità con i protocolli del Boston Children's Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Accoppiamenti a tempo

1. Posizionare ISL^MN:GFP (Islet Motor Neuron Green Fluorescent Protein; MGI: J:132726; Jax Tg(Isl-EGFP)1Slp/J Stock No: 017952) topi maschi e femmine insieme durante la notte. Pesare le femmine e registrare i pesi prima dell'accoppiamento.
   NOTA: ISL^MN:GFP etichetta specificamente i motoneuroni con un GFP farnesillated che non è citotossico, si localizza alla membrana cellulare dei motoneuroni e dei loro assoni e consente di visualizzare i nervi durante lo sviluppo²⁵. Potrebbero essere utilizzate anche altre linee con etichetta fluorescente.
2. Verificare la presenza di spine vaginali al mattino presto. La data in cui una spina viene identificata è designata come E0.5.
3. Confermare la gravidanza utilizzando l'aumento di peso e/o gli ultrasuoni a E10.5. Le dighe incinte devono aver guadagnato almeno 1 g. Gli embrioni possono essere visti con ultrasuoni a E10.5.

2. Preparazione di reagenti e vibratome per la coltura della sezione

1. Preparare 500 mL di tampone di affettare: aggiungere 5 mL di HEPES e 5 mL di penicillina/streptomicina a 500 mL di Soluzione di sale equilibrato di Hank (HBSS) senza Ca² e Mg².  Raffreddare a 4 gradi centigradi.
   NOTA: il buffer di affettatura supplementare deve essere memorizzato a 4 gradi centigradi e può essere utilizzato per futuri esperimenti di coltura delle fette.
2. Preparare 50 mL di supporti di coltura: In un cofano sterile, aggiungere 12,5 mL di HBSS, 12,5 mL di siero fetale bovino, 250 litri di glucosio, 250 -L di L-glutammina, 125 l di HEPES a 24,4 mL di Fluorobright DMEM. (concentrazioni finali: FlouroBright DMEM con 25% HBSS, 25% FBS, 0.5% glucosio, 1 mM glutammina, e 2.5 mM HEPES.).  Riscaldare i mezzi di coltura a 37 gradi centigradi in un bagno d'acqua sterile.
   NOTA: I supporti di coltura possono essere conservati a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 settimane.
   1. In un cappuccio sterile, aggiungere 1,5 mL di supporti di coltura ad ogni pozzo di una piastra di 6 pozze.  Aggiungere un inserimento di impostazioni cultura delle celle (Tabella dei materiali) a ogni pozzo.  Mettere in un'incubatrice sterile di 37 e 5% di CO 2.
3. Preparare il 4% di agarose a bassa temperatura di fusione: sciogliere 2 g di agarose a bassa temperatura di fusione in 50 mL di PBS sterile. Microonde a intervalli di 30-60 s fino a completa dissoluzione. Mettere in un bagno d'acqua a 40 gradi centigradi per mantenere il liquido.
   NOTA: l'agarose extra può essere conservato a temperatura ambiente (RT) e fuso per futuri esperimenti di coltura delle fette.
4. Set up vibratome: Posiziona una nuova lama sul vibratome. Controllare le impostazioni: spessore 400-450 m. Pre-raffreddare lo stadio vibratoma. Mettere del ghiaccio nella camera esterna. Utilizzare una camera e un palco dedicati alle fette vive. Non utilizzare la stessa camera vibratoma per il tessuto fisso in quanto il fissativo residuo potrebbe danneggiare le fette.
5. Preparare l'incubatrice superiore dello stadio al microscopioa 37 gradi centigradi e al 5% di CO 2.
6. Preparare la dissezione: Pulire gli strumenti chirurgici e spruzzare con 70% etanolo. Riempire due piatti Petri con HBSS, posto sul ghiaccio. Aprire una piastra di coltura del tessuto 12 pozzo e posizionare il coperchio sul ghiaccio con la parte inferiore rivolta verso l'alto. Aprire una piastra di coltura dei tessuti a 6 pozze e posizionare inserti di membrana di coltura cellulare e 1,5 mL di coltura cellulare in ogni pozzo. Preriscaldare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi centigradi e al 5% di CO 2.

3. Raccogliere embrioni E10.5 e preparare fette

NOTA: Tutti i passaggi da questo punto devono essere eseguiti il più rapidamente possibile. Mantenere gli embrioni sempre sul ghiaccio.

1. Eutanasia la diga incinta (E10.5) in una camera DI CO_2. Eseguire lussazione cervicale.
2. Spruzzare l'addome con il 70% di etanolo. Tagliare l'addome con le forbici, rimuovere l'utero e metterlo in una teglia Petri con HBSS ghiacciato per lavare rapidamente via il sangue. Spostare l'utero lavato in un secondo Petri riempito con piatto ghiaccio freddo HBSS.
3. Sotto un ambito di dissezione, rimuovere gli embrioni dal corno uterino e sacche amniotiche individuali. Posizionare gli embrioni sulla parte inferiore del coperchio di una piastra di 12 pozze. Tieniti sul ghiaccio.
4. Sotto un ambito di dissezione, utilizzare la carta da filtro per rimuovere qualsiasi liquido che circonda ogni embrione.
   NOTA: Gli embrioni si attaccano alla carta da filtro se toccati.
5. Incorporare gli embrioni in agarose. Versare l'agarosa sciolta su ogni embrione per coprirlo. Tieniti sul ghiaccio. Non appena l'agarose si è indurita, capovolgere ogni embrione e versare agarose aggiuntive sull'altro lato. Tieniti sul ghiaccio.
6. Utilizzando un ambito di dissetazione fluorescente, tagliare l'agarose intorno a ogni embrione in modo che sia orientata correttamente quando incollata allo stadio vibratoma. Il nucleo oculomotore e la rapida escrescenza assonale sono fluorescenti. Allineare l'embrione in modo che il nucleo, gli assoni in crescita e l'occhio formino una linea, e tagliare l'agarose con una lama di rasoio tagliata parallelamente a questa linea (dorsale all'embrione, vedere Figura 1A).
   NOTA: Questo sarà il lato incollato allo stadio vibratoma (l'embrione sarà posizionato sulla schiena, la testa più vicina alla lama del vibratoma). Una linea tra il nucleo oculomotore e l'occhio deve essere parallela alla lama vibratoma.
7. Riempire la camera vibratoma con tampone a fette ghiacciate. Superincollare l'embrione allo stadio vibratoma in modo che la lama sia parallela al nucleo oculomotore e agli occhi. Una volta che la supercolla è asciutta, immergere lo stadio vibratoma in modo che l'embrione sia orientato verso l'allontanamento dalla lama.
8. Affettare 400-450 fette di m.  Raccogliere ogni fetta con un pipet di trasferimento sterile. Mettere nel buffer di affettare a freddo.
9. Sotto il mirino di dissezione, scegliere la fetta contenente i nuclei oculomotori e gli occhi. Utilizzando un pipet di trasferimento sterile, posizionarlo sul inserto di coltura cellulare nella piastra 6 pozzo. Riportare la piastra all'incubatrice di 37 gradi centigradi. In alternativa, chiedi a una persona di affettare e a un'altra di posizionare le fette. Ridurre al minimo il tempo che intersechi e lo inserimento nell'incubatrice.
   NOTA: Le fette devono essere orientate in modo che la massima fluorescenza emessa dai nuclei e dagli assoni sia più vicina all'obiettivo del microscopio di imaging. In un microscopio invertito, le fette devono essere posizionate sulla membrana con i nuclei e gli assoni più vicini all'obiettivo sotto la piastra.
10. Togliere l'agarose residua dallo stadio vibratoma, superincollare l'embrione successivo allo stadio e ripetere i passaggi 3.7-3.9 fino a quando tutti gli embrioni sono stati affettati e placcati.
11. Aggiungere inibitore o molecola ricombinante di scelta ai media in ogni pozzo per creare una curva dose-risposta.  Diluire in un solvente appropriato.
    NOTA: se si utilizza DMSO, utilizzare solo DMSO di grado di coltura dei tessuti. In alternativa, le perle proteiche possono essere posizionate in posizioni specifiche della fetta.
12. Posizionare al microscopio nella camera 37 e 5% CO 2.  Impostare il microscopio per scattare il contrasto di fase e le fotografie fluorescenti di ogni fetta ogni 30 min (o più spesso se lo si desidera). Le fette possono essere mantenute per 48-72 h.

Risultati

Risultati normali: la figura 1 fornisce uno schema dell'esperimento. A partire dall'E9.5 nel topo, i primi assoni cominciano ad emergere dal nucleo oculomotore²⁶. Con E10.5, un nervo oculomotore a fasciculato, che contiene i primi neuroni pionieri, può essere visto nel mesenchyme. C'è una significativa variabilità tra gli embrioni a E10.5 (anche all'interno della stessa lettiera) in quanto il nervo è progredito verso l'orbita, probabilmente a causa delle differenz...

Discussione

Questo protocollo di coltura delle fette ex vivo offre vantaggi significativi rispetto alle tradizionali indicazioni degli assoni²³. La dimensione di ogni nucleo motorio cranico non è un fattore limitante, e non è necessaria alcuna dissezione difficile. Il microambiente endogeno attraverso il quale gli assoni viaggiano, consentendo la modifica di un percorso di segnalazione pur mantenendo altri percorsi di segnalazione. Inoltre, gli effetti possono essere valutati in punti diversi lungo la traie...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-Well Tissue Culture Plate	Genesee Scientific	25-107
6-Well Tissue Culture Plate	Genesee Scientific	25-105
Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass)	VWR	14672-200
Fine Forceps	Fine Science Tools	11412-11
Fluorobrite DMEM	Thermo Fisher Scientific	A1896701
Glucose (200 g/L)	Thermo Fisher Scientific	A2494001
Hank's Balanced Salt Solution (1X)	Thermo Fisher Scientific	14175-095
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11550H
HEPES Buffer Solution (1M)	Thermo Fisher Scientific	15630106
L-Glutamine (250 nM)	Thermo Fisher Scientific	25030081
Loctite Superglue	Loctite
Low Melting Point Agarose	Thermo Fisher Scientific	16520050
Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um)	Millipore Sigma	PICM03050
Moria Mini Perforated Spoon	Fine Science Tools	10370-19
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri Dish (100 x 15mm)	Genesee Scientific	32-107G
Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4)	Thermo Fisher Scientific	10010049
Razor Blades	VWR	55411-050
Surgical Scissors - Blunt	Fine Science Tools	14000-12
Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF	Nikon
Vibratome (VT 1200S)	Leica	1491200S001
Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel)	Ted Pella, Inc.	121-6