Cultura ex vivo oculomotor Slice de camundongos que expressam GFP embrionário para a imagem de lapso temporal do crescimento do nervo oculomotor

Resumo

Um ensaio ex vivo da fatia permite que o conseqüência do nervo oculomotor seja imaged no tempo real. As fatias são geradas incorporando E 10.5 ISL^MN: embriões de GFP no agarose, cortando em um vibratome, e crescendo em uma incubadora do estágio-parte superior. O papel das vias de orientação do AXON é avaliado pela adição de inibidores aos meios de cultura.

Resumo

Os movimentos de olho exatos são cruciais para a visão, mas o desenvolvimento do sistema do motor da ocular, especial as vias moleculars que controlam a orientação do AXON, não foi elucidado inteiramente. Isto é em parte devido às limitações técnicas de ensaios tradicionais da orientação do AXON. Para identificar indicações adicionais da orientação do AXON que influenciam o nervo oculomotor, um ensaio ex vivo da fatia à imagem o nervo oculomotor no tempo real enquanto cresce para o olho foi desenvolvido. E 10.5 ISL^MN-os embriões de GFP são usados para gerar fatias ex vivo incorporando os no agarose, cortando em um vibratome, então crescendo os em uma incubadora do estágio-parte superior do microscópio com photomicroscopia do tempo-lapso para 24-72 h. fatias de controle recapitulam o tempo in vivo de crescimento de axônios do núcleo para a órbita. Os inibidores da molécula pequena ou as proteínas de recombinação podem ser adicionados aos meios de cultura para avaliar o papel de caminhos diferentes da orientação do AXON. Este método tem as vantagens de manter mais do microambiente local através do qual os axônios atravessam, não axotomizing os axônios crescentes, e avaliando os axônios em vários pontos ao longo de sua trajetória. Ele também pode identificar efeitos em subconjuntos específicos de axônios. Por exemplo, a inibição de CXCR4 provoca axônios ainda dentro do midbrain para crescer dorsalmente ao invés de ventralmente, mas axônios que já saíram ventralmente não são afetados.

Introdução

O sistema do motor da ocular fornece um sistema elegante para investigar mecanismos da orientação do AXON. É relativamente uncomplicated, consistindo em três nervos cranianos que inervam seis músculos extraocular (eoms) que movem o olho, e os da labii superioris do do levator (LPs) que levanta a pálpebra. O nervo oculomotor inerva os LPS e quatro EOMs-o oblíquo inferior e os músculos do músculo reto medial, inferior e superior. Os outros dois nervos, os troclear e os abducens, cada um somente inervam um músculo, o músculo oblíquo superior e lateral do reto, respectivamente. Os movimentos oculares proporcionam uma leitura fácil, mostrando se a inervação era apropriada, ausente ou aberrante. Adicionalmente, há uns distúrbios humanos do movimento do olho que resultam dos deficits no desenvolvimento neuronal ou na orientação do AXON, denominados coletivamente as desordens cranianas congênitas da disinervação (CCDDs)¹.

Apesar destas vantagens, o sistema do motor da ocular é usado raramente em estudos^2,3,⁴,^5,6,7,8 da orientação do AXON, ⁹ anos de ^{, 10}, devido aos inconvenientes técnicos. Os ensaios de orientação de AXON in vitro têm muitas desvantagens¹¹. Os ensaios da co-cultura, em que os explantes neuronal são cultivados junto com explantes do tecido do alvo¹² ou as pilhas transfected¹³, dependem da simetria do explante e do posicionamento preciso entre o explante e o tecido do alvo. Ensaios de listra^14,15, em que duas pistas são estabelecidas em listras alternadas e axônios são avaliados para o crescimento preferencial em uma listra, só indicam que um substrato é preferível ao outro, não que seja atraente ou repulsivo, ou fisiologicamente relevante. As câmaras de Microfluidics podem dar forma a Gradients químicos precisos, mas os axônios crescentes do assunto ao esforço de cisalhamento¹⁶,¹⁷,¹⁸, que podem afetar seu crescimento. Além disso, em cada uma dessas abordagens, a coleta de explantes ou células dissociadas requer que os axônios em crescimento sejam axotomizados e, portanto, esses ensaios realmente examinam a regeneração do AXON, em vez do crescimento inicial do AXON. Finalmente, essas abordagens in vitro removem o microambiente que influencia os axônios e suas respostas a pistas ao longo de diferentes pontos de seu curso, e tradicionalmente só testam uma sugestão isolada. Compondo estas desvantagens, o tamanho pequeno de cada núcleo no sistema do motor da ocular faz a dissecção que desafia tecnicamente para explantes ou culturas dissociada. Adicionalmente, as culturas preliminares de neurônios do motor da ocular são geralmente heterogêneas, têm a morte de pilha significativa, e são dependentes da densidade, exigindo o agrupamento das pilhas dos embriões múltiplos (Ryosuki Fujiki, uma comunicação pessoal). In vivo métodos, no entanto, incluindo modelos de mouse knockout, são inadequados para uso para triagem, dado o tempo e despesa necessária.

Métodos desenvolvidos para a cultura de embriões inteiros¹⁹ permitir a rotulagem de células migratórias²⁰ ou bloqueio de moléculas específicas²¹, mas culturas embrionária inteiras exigem incubação em garrafas de rolos que impede a imagem em tempo real de rotulados Estruturas. Técnicas cirúrgicas que permitem a manipulação do embrião e, em seguida, subsequente desenvolvimento posterior quer no útero ou no abdômen da mãe (manutenção da conexão placentária)²² também são possíveis, mas estes também não permitem lapso de tempo Imaging.

Para superar os obstáculos de ensaios in vitro e permitir a rápida triagem de vias de sinalização, desenvolveu-se uma técnica de cultura de fatia embrionária ex vivo²³, adaptada de um protocolo previamente publicado para o crescimento do nervo periférico²⁴. Usando este protocolo, o nervo oculomotor de desenvolvimento pode ser imaged sobre o tempo na presença de muitas das estruturas circunvizinhas ao longo de sua trajetória, incluindo alvos de EOM. Ao adicionar inibidores de pequenas moléculas, fatores de crescimento ou indicações de orientação aos meios de cultura, podemos avaliar perturbações de orientação em vários pontos ao longo da trajetória do AXON, permitindo uma avaliação mais rápida dos potenciais fatores de crescimento e orientação.

Protocolo

Todos os trabalhos em animais aqui descritos foram aprovados e realizados em conformidade com os protocolos do Comitê de cuidados e uso de animais (IACUC) do Boston Children ' s hospital.

1. acasalamentos cronometrados

1. Lugar ISL^MN: GFP (proteína fluorescente verde do Neuron do motor de Islet; MGI: J:132726; Jax TG (ISL-EGFP *) 1Slp/J estoque: 017952) ratos masculinos e fêmeas junto durante a noite. Pesar as fêmeas e pesos recorde antes do acasalamento.
   Nota: o ISL^MN: GFP especificamente rotula os neurônios motores com um GFP farnesylated que não seja cytotoxic, localiza à membrana de pilha de neurônios de motor e de seus axônios, e permite que os nervos sejam visualizados durante o desenvolvimento²⁵. Outras linhas com rótulo cDNAs também podem ser usadas.
2. Verifique se há plugues vaginais no início da manhã. A data em que um plugue é identificado é designado como E 0.5.
3. Confirme a gravidez usando o ganho de peso e/ou ultra-som em E 10.5. As represas grávidas devem ter ganhado pelo menos 1 g. os embriões podem ser vistos no ultra-som em E 10.5.

2. preparação dos reagentes e do do para a cultura da fatia

1. Prepare 500 mL de tampão de fatiamento: Adicione 5 mL de HEPES e 5 mL de penicilina/estreptomicina a 500 mL de solução de sal balanceada de Hank (HBSS) sem CA^{2 +} e mg^{2 +}.  Chill a 4 ° c.
   Nota: o tampão de fatiamento extra deve ser armazenado em 4 ° c e pode ser usado para experiências futuras da cultura da fatia.
2. Preparar 50 mL de meios de cultura: em um capuz estéril, adicione 12,5 mL de HBSS, 12,5 mL de soro bovino fetal, 250 μL de glicose, 250 μL de L-glutamina, 125 μL de HEPES para 24,4 mL de Fluorobright DMEM. (Concentrações finais: FlouroBright DMEM com 25% HBSS, 25% FBS, 0,5% glicose, 1 milímetro glutamine, e 2,5 milímetros HEPES.).  Aqueça os meios de cultura a 37 ° c em um banho de água estéril.
   Nota: a mídia de cultura pode ser armazenada a 4 ° c por até 3 semanas.
   1. Em uma capa estéril, adicione 1,5 mL de meios de cultura a cada poço de uma placa de 6 poços.  Adicione uma inserção de cultura de célula (tabela de materiais) a cada poço.  Coloc em um 37 ° c estéril e em uma incubadora de 5% CO₂ .
3. Prepare o agarose da temperatura do baixo-derretimento de 4%: Dissolva 2 g do agarose da temperatura do baixo-derretimento em 50 mL do PBS estéril. Microondas em intervalos de 30-60 s até totalmente dissolvido. Coloc em um banho de água do ° c 40 para manter o líquido.
   Nota: o agarose extra pode ser conservado na temperatura ambiente (RT) e derretido para experiências futuras da cultura da fatia.
4. Configurar o vibratome: Coloque uma nova lâmina no vibratome. Verifique as configurações: espessura 400-450 μm. pré-Chill o estágio do. Coloque gelo na Câmara exterior. Use uma câmara e um estágio dedicados a fatias ao vivo. Não use a mesma Câmara do para o tecido fixo como o fixador residual poderia ser prejudicial às fatias.
5. Prepare a incubadora superior do estágio do microscópio a 37 ° c e a 5% CO₂.
6. Prepare-se para dissecção: Limpe os instrumentos cirúrgicos e pulverize com 70% etanol. Encha dois pratos de Petri com HBSS, coloque no gelo. Abra uma placa da cultura do tecido de 12 poços e coloc a tampa no gelo com a parte inferior virada para cima. Abra uma placa da cultura do tecido de 6 poços e coloc inserções da membrana da cultura da pilha e 1,5 meios de cultura da pilha do mL em cada poço. Pré-aqueça a placa em uma incubadora de 37 ° c e de 5% CO₂ .

3. colheita e 10,5 embriões e preparação de fatias

Nota: todas as etapas deste ponto devem ser feitas o mais rápido possível. Mantenha os embriões em gelo o tempo todo.

1. Eutanizar a represa grávida (E 10.5) em uma câmara de CO₂ . Realize luxação cervical.
2. Pulverize o abdômen com 70% de etanol. Corte abrir o abdômen com tesoura, retire o útero e coloque-o em uma placa de Petri com gelo frio HBSS para lavar rapidamente afastado o sangue. Mova o útero lavado a um segundo Petri enchido com o gelo gelado HBSS do prato.
3. um espaço de dissecação, remova os embriões do chifre uterine e dos sacos líquido amniótico individuais. Coloque os embriões na parte inferior da tampa de uma placa de 12 poços. Mantenha o gelo.
4. um escopo de dissecação, use papel de filtro para remover qualquer líquido em torno de cada embrião.
   Nota: os embriões vão ficar com o papel de filtro se tocado.
5. Incorporar embriões em agarose. Despeje o agarose derretido sobre cada embrião para cobri-lo. Mantenha o gelo. Assim que o agarose endureceu, vire cada embrião e despeje agarose adicional do outro lado. Mantenha o gelo.
6. Usando um espaço de dissecação fluorescente, apare o agarose em torno de cada embrião assim que será orientado corretamente quando colado ao estágio do do. O núcleo oculomotor e o conseqüência adiantado do AXON são fluorescentes. Alinhe o embrião para que o núcleo, os axônios em crescimento e o olho formem uma linha, e corte o agarose com uma lâmina de barbear paralela a esta linha (dorsal ao embrião, ver Figura 1a).
   Nota: este será o lado colado ao estágio do (o embrião será posicionado em suas costas, cabeça mais próxima da lâmina do). Uma linha entre o núcleo oculomotor e o olho deve ser paralela à lâmina do.
7. Encha a câmara do com o tampão gelo-frio da fatia. Supercole o embrião ao estágio do do de modo que a lâmina seja paralela com o núcleo e os olhos do oculomotor. Uma vez que o super cola está seco, submergir o estágio do assim que o embrião é orientado virado para longe da lâmina.
8. Cortar fatias de 400-450 μm.  Colete cada fatia com um Pipet de transferência estéril. Coloque em buffer de corte frio.
9. o escopo de dissecação, escolha a fatia que contém os núcleos oculomotores e os olhos. Usando um Pipet de transferência estéril, coloc o na inserção da cultura da pilha na placa de 6 poços. Devolva a placa à incubadora de 37 ° c. Alternativamente, ter uma pessoa fatiando e outra colocando as fatias. Minimize o tempo entre fatiar e coloc na incubadora.
   Nota: as fatias devem ser orientadas de forma que a fluorescência máxima emitida a partir dos núcleos e axônios seja mais próxima do objetivo do microscópio de imagem. Em um microscópio invertido, as fatias devem ser colocadas na membrana com os núcleos e axônios mais próximos ao objetivo embaixo da placa.
10. Retire o agarose residual do estágio do do, supercole o próximo embrião ao estágio e repita etapas 3.7-3.9 até que todos os embriões estejam cortados e chapeados.
11. Adicione o inibidor ou a molécula de recombinação da escolha aos meios em cada poço para criar uma curva da dose-resposta.  Diluir em solvente apropriado.
    Nota: se utilizar DMSO, utilize apenas a classe de cultura de tecido DMSO. Alternativamente, as esferas da proteína-eluição podem ser coloc em posições específicas na fatia.
12. Coloc no microscópio no ° c 37 e na câmara de 5% CO₂ .  Ajuste o microscópio para tomar o contraste de fase e as fotografias fluorescentes de cada fatia cada 30 minutos (ou mais frequentemente se desejado). As fatias podem ser mantidas para 48-72 h.

Resultados

Resultados normais: a Figura 1 fornece um esquema do experimento. Começando tão cedo quanto E 9.5 no rato, os primeiros axônios começam a emergir do núcleo oculomotor²⁶. Por E 10.5, um nervo oculomotor fasciculado, que contenha os neurônios pioneiros adiantados, pode ser visto no mesenchyme. Há uma variabilidade significativa entre os embriões em E 10.5 (mesmo dentro da mesma maca) em como distante o nervo progrediu para a órbita, provável devido às diferen...

Discussão

Este protocolo ex vivo da cultura da fatia fornece vantagens significativas sobre os ensaios tradicionais da orientação do AXON²³. O tamanho de cada núcleo do motor craniano não é um fator limitante, e nenhuma dissecção difícil é necessária. O microambiente endógeno através do qual os axônios viajam são mantidos, permitindo a modificação de uma via de sinalização, mantendo outras vias de sinalização. Adicionalmente, os efeitos podem ser avaliados em diferentes pontos ao longo d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-Well Tissue Culture Plate	Genesee Scientific	25-107
6-Well Tissue Culture Plate	Genesee Scientific	25-105
Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass)	VWR	14672-200
Fine Forceps	Fine Science Tools	11412-11
Fluorobrite DMEM	Thermo Fisher Scientific	A1896701
Glucose (200 g/L)	Thermo Fisher Scientific	A2494001
Hank's Balanced Salt Solution (1X)	Thermo Fisher Scientific	14175-095
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11550H
HEPES Buffer Solution (1M)	Thermo Fisher Scientific	15630106
L-Glutamine (250 nM)	Thermo Fisher Scientific	25030081
Loctite Superglue	Loctite
Low Melting Point Agarose	Thermo Fisher Scientific	16520050
Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um)	Millipore Sigma	PICM03050
Moria Mini Perforated Spoon	Fine Science Tools	10370-19
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri Dish (100 x 15mm)	Genesee Scientific	32-107G
Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4)	Thermo Fisher Scientific	10010049
Razor Blades	VWR	55411-050
Surgical Scissors - Blunt	Fine Science Tools	14000-12
Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF	Nikon
Vibratome (VT 1200S)	Leica	1491200S001
Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel)	Ted Pella, Inc.	121-6