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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Un présagéex-invivo permet d'imaginer l'excroissance du nerf oculomoteur en temps réel. Les tranches sont générées par l'intégration d'embryons E10.5 IslMN:GFP dans l'agarose, en coupant sur un vibratome et en grandissant dans un incubateur de toit de scène. Le rôle des voies de guidage d'axone est évalué en ajoutant des inhibiteurs aux médias de culture.

Résumé

Les mouvements précis des yeux sont cruciaux pour la vision, mais le développement du système moteur oculaire, en particulier les voies moléculaires contrôlant le guidage des axones, n'a pas été entièrement élucidé. Cela est dû en partie aux limitations techniques des essais traditionnels de guidage d'axone. Pour identifier les indices additionnels de guidage d'axone influençant le nerf oculomoteur, un assay de tranche ex vivo pour imager le nerf oculomoteur en temps réel pendant qu'il se développe vers l'oeil a été développé. E10.5 Les embryons Isl MN-GFP sont utilisés pour générer des tranches ex vivo en les incorporant dans l'agarose, en les coupant sur un vibratome, puis en les cultivant dans un incubateur au microscope avec photomicroscopie en accéléré de 24 à 72 h. Les tranches de contrôle récapitulent le moment in vivo de la croissance des axones du noyau à l'orbite. Des inhibiteurs de petites molécules ou des protéines recombinantes peuvent être ajoutés au support culturel pour évaluer le rôle de différentes voies de guidage des axones. Cette méthode a l'avantage de maintenir une plus grande partie du microenvironnement local par lequel les axones traversent, et non pas d'axotomiser les axones en croissance, et d'évaluer les axones à plusieurs points le long de leur trajectoire. Il peut également identifier des effets sur des sous-ensembles spécifiques d'axones. Par exemple, l'inhibition du CXCR4 provoque une croissance dorale des axones dans le cerveau moyen plutôt que ventrale, mais les axones qui sont déjà sortis ventrales ne sont pas affectés.

Introduction

Le système moteur oculaire fournit un système élégant pour étudier les mécanismes de guidage des axones. Il est relativement simple, composé de trois nerfs crâniens intériorisant six muscles extraoculaires (EOM) qui déplacent l'œil, et le levator palpebrae superioris (LPS) qui soulève la paupière. Le nerf oculomoteur intémine les LPS et quatre EOM - les muscles inférieurs obliques et les muscles rectus médiaux, inférieurs et supérieurs. Les deux autres nerfs, le trochlear et les abducens, chacun seulement innervate un muscle, le muscle supérieur oblique et latéral de rectus, respectivement. Les mouvements des yeux fournissent une lecture facile, montrant si l'innervation était appropriée, manquante ou aberrante. En outre, il y a des désordres humains de mouvement d'oeil qui résultent des déficits dans le développement neuronal ou le guidage d'axone, collectivement appelé les désordres crâniens congénitaux de disinnervation (CCDDs)1.

Malgré ces avantages, le système moteur oculaire est rarement utilisé dans les études de guidage d'axone2,3,4,5,6,7,8, 9 (en) , 10, en raison d'inconvénients techniques. Les tests de guidage d'axone in vitro ont beaucoup d'inconvénients11. Les essais de co-culture, dans lesquels les explants neuronaux sont cultivés ensemble avec des explants de tissu cible12 ou des cellules transfectées13,dépendent à la fois de la symétrie de l'explantation et du positionnement précis entre l'explante et le tissu cible. Les essais à rayures14,15, dans lesquels deux indices sont posés en rayures alternées et les axones sont évalués pour une croissance préférentielle sur une bande, indiquent seulement qu'un substrat est préférable à l'autre, non pas que l'un ou l'autre est attrayant répugnant, ou physiologiquement pertinent. Les chambres microfluidiques peuvent former des gradients chimiques précis, mais les axones de plus en plus de sujet pour cisailler le stress16,17,18, qui peuvent affecter leur croissance. En outre, dans chacune de ces approches, la collecte d'explants ou de cellules dissociées exige que les axones de croissance soient axotomisés et donc ces essais examinent réellement la régénération d'axone, plutôt que la croissance initiale d'axone. Enfin, ces approches in vitro éliminent le microenvironnement qui influence les axones et leurs réponses aux indices le long de différents points de leur cours, et traditionnellement seulement tester un signal dans l'isolement. En plus de ces inconvénients, la petite taille de chaque noyau dans le système moteur oculaire rend la dissection techniquement difficile pour les explantations ou les cultures dissociées. En outre, les cultures primaires des neurones moteurs oculaires sont habituellement hétérogènes, ont la mort cellulaire significative, et sont dépendantes de densité, exigeant la mise en commun des cellules des embryons multiples (Ryosuki Fujiki, communication personnelle). Les méthodes in vivo, cependant, y compris les modèles de souris knock-out, sont inappropriés à utiliser pour le dépistage, compte tenu du temps et des dépenses requises.

Les méthodes développées pour la culture d'embryons entiers19 permettent l'étiquetage des cellules migratrices20 ou le blocus de molécules spécifiques21, mais les cultures d'embryons entiers nécessitent l'incubation dans des bouteilles à rouleaux, ce qui empêche l'imagerie en temps réel de l'étiquetage Structures. Les techniques chirurgicales qui permettent la manipulation de l'embryon, puis le développement ultérieur soit dans l'utérus ou dans l'abdomen de la mère (maintien de la connexion placentaire)22 sont également possibles, mais ceux-ci ne permettent pas non plus time-lapse Imagerie.

Pour surmonter les obstacles des essais in vitro et permettre un dépistage rapide des voies de signalisation, une technique de culture de tranches embryonnaires ex vivo a été développée23, adaptée d'un protocole précédemment publié pour la croissance nerveuse périphérique24. Grâce à ce protocole, le nerf oculomoteur en développement peut être représenté au fil du temps en présence de nombreuses structures environnantes le long de sa trajectoire, y compris les cibles de l'OME. En ajoutant des inhibiteurs de petites molécules, des facteurs de croissance ou des indices de guidage aux médias de culture, nous pouvons évaluer les perturbations de guidage à plusieurs points le long de la trajectoire d'axone, permettant une évaluation plus rapide des facteurs de croissance et d'orientation potentiels.

Protocole

Tous les travaux sur les animaux décrits ici ont été approuvés et exécutés conformément aux protocoles du Boston Children's Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Accouplements chronométrés

  1. Placez ISLMN:GFP (Islet Motor Neuron Green Fluorescent Protein; MGI: J:132726; Jax Tg (Isl-EGFP)1Slp/J Stock No: 017952) souris mâles et femelles ensemble pendant la nuit. Peser les femelles et enregistrer les poids avant l'accouplement.
    REMARQUE: ISLMN:GFP étiquette spécifiquement les neurones moteurs avec un GFP farnésilé qui n'est pas cytotoxique, localise à la membrane cellulaire des neurones moteurs et de leurs axones, et permet aux nerfs d'être visualisés pendant le développement25. D'autres lignes étiquetées fluorescentes pourraient également être utilisées.
  2. Vérifiez s'il y a des prises vaginales tôt le matin. La date à laquelle une prise est identifiée est désignée comme E0.5.
  3. Confirmer la grossesse en utilisant un gain de poids et/ou une échographie à E10.5. Les barrages enceintes auraient dû gagner au moins 1 g. Les embryons peuvent être vus à l'échographie à E10.5.

2. Préparation des réactifs et du vibratome pour la culture des tranches

  1. Préparer 500 ml de tampon de tranchage : ajouter 5 ml de HEPES et 5 ml de pénicilline/streptomycine à 500 ml de solution de sel équilibrée de Hank (HBSS) sans Ca2 et Mg2.  Réfrigérer jusqu'à 4 oC.
    REMARQUE : Le tampon de coupe supplémentaire doit être stocké à 4 oC et peut être utilisé pour de futures expériences de culture de tranches.
  2. Préparer 50 ml de supports culturels : Dans une hotte stérile, ajouter 12,5 mL de HBSS, 12,5 ml de sérum bovin fœtal, 250 l de glucose, 250 l de L-glutamine, 125 oL de HEPES à 24,4 ml de Fluorobright DMEM. (Concentrations finales: FlouroBright DMEM avec 25% HBSS, 25% FBS, 0.5% glucose, 1 mM glutamine, et 2.5 mM HEPES.).  Réchauffer les supports culturels à 37 oC dans un bain d'eau stérile.
    REMARQUE : Les supports culturels peuvent être stockés à 4 oC pendant une température pouvant aller jusqu'à 3 semaines.
    1. Dans une hotte stérile, ajouter 1,5 ml de support culturel à chaque puits d'une assiette de 6 puits.  Ajouter un insert de culture cellulaire (Table des Matériaux) à chaque puits.  Placer dans un incubateur stérile de 37 oC et 5 % de CO 2.
  3. Préparer 4 % d'agarose à basse température : dissoudre 2 g d'agarose à basse température dans 50 ml de PBS stérile. Micro-ondes à intervalles de 30-60 s jusqu'à dissolution complète. Placer dans un bain d'eau de 40 oC pour garder le liquide.
    REMARQUE : L'agarose supplémentaire peut être stockée à température ambiante (RT) et fondue pour de futures expériences de culture de tranches.
  4. Configurer le vibratome : Placez une nouvelle lame sur le vibratome. Vérifier les réglages : épaisseur de 400 à 450 m. Pré-réfrigérer le stade vibratome. Placez un peu de glace dans la chambre extérieure. Utilisez une chambre et une scène dédiées aux tranches vivantes. N'utilisez pas la même chambre vibratome pour les tissus fixes que le fixatif résiduel pourrait être dommageable pour les tranches.
  5. Préparer l'incubateur de l'étape du microscopeà 37 oC et 5 % de CO 2.
  6. Préparez-vous à la dissection : Nettoyez les instruments chirurgicaux et vaporisez-les avec 70 % d'éthanol. Remplir deux plats Petri avec HBSS, placer sur la glace. Ouvrez une plaque de culture de 12 puits et placez le couvercle sur la glace avec le dessous vers le haut. Ouvrez une plaque de culture de tissu de 6 puits et placez des inserts de membrane de culture cellulaire et des médias de culture cellulaire de 1,5 ml dans chaque puits. Préchauffer la plaque dans un incubateur de CO2 de 37 oC et 5 %.

3. Récolte d'embryons E10.5 et préparation de tranches

REMARQUE : Toutes les étapes à partir de ce point doivent être faites aussi rapidement que possible. Gardez les embryons sur la glace en tout temps.

  1. Euthanasier le barrage enceinte (E10.5) dans une chambre CO 2. Effectuer la dislocation cervicale.
  2. Vaporiser l'abdomen avec 70% d'éthanol. Couper l'abdomen avec des ciseaux, enlever l'utérus et le placer dans un plat Petri avec hbSS froid glacé pour laver rapidement le sang. Déplacer l'utérus lavé à un deuxième Petri rempli de glace de vaisselle froide HBSS.
  3. Sous une portée de dissection, retirez les embryons de la corne utérine et des sacs amniotiques individuels. Placer les embryons sur le dessous du couvercle d'une plaque de 12 puits. Restez sur la glace.
  4. Sous une portée de dissection, utilisez du papier filtre pour enlever tout liquide entourant chaque embryon.
    REMARQUE : Les embryons colleront au papier filtre s'ils sont touchés.
  5. Intégrer des embryons dans l'agarose. Verser l'agarose fondue sur chaque embryon pour le couvrir. Restez sur la glace. Dès que l'agarose s'est durcie, retournez chaque embryon et versez de l'agarose supplémentaire de l'autre côté. Restez sur la glace.
  6. À l'aide d'une lunette de dissection fluorescente, taillez l'agarose autour de chaque embryon afin qu'il soit orienté correctement lorsqu'il est collé au stade du vibratome. Le noyau oculomoteur et la croissance précoce de l'axone sont fluorescents. Alignez l'embryon de sorte que le noyau, les axones en croissance et les yeux forment une ligne, et taillez l'agarose avec une lame de rasoir coupée parallèlement à cette ligne (dorsal à l'embryon, voir Figure 1A).
    REMARQUE: Ce sera le côté collé au stade vibratome (l'embryon sera positionné sur son dos, la tête la plus proche de la lame vibratome). Une ligne entre le noyau oculomoteur et l'œil doit être parallèle à la lame de vibratome.
  7. Remplir la chambre vibratome d'un tampon de tranches glacées. Superglue l'embryon au stade vibratome de sorte que la lame sera parallèle avec le noyau oculomoteur et les yeux. Une fois que la superglue est sèche, immerger le stade vibratome de sorte que l'embryon est orienté vers l'extérieur de la lame.
  8. Trancher 400-450 tranches de m.  Recueillir chaque tranche avec un tuyau de transfert stérile. Placer dans un tampon de coupe à froid.
  9. Sous la portée de dissection, choisissez la tranche contenant les noyaux et les yeux oculomoteurs. À l'aide d'un tuyau de transfert stérile, placez-le sur l'insert de culture cellulaire dans la plaque de 6 puits. Remettre la plaque dans l'incubateur de 37 oC. Alternativement, demandez à une personne de trancher et une autre de placer les tranches. Minimisez le temps entre le découpage et le placement dans l'incubateur.
    REMARQUE : Les tranches doivent être orientées de manière à ce que la fluorescence maximale émise par les noyaux et les axones soit la plus proche de l'objectif du microscope d'imagerie. Sur un microscope inversé, les tranches doivent être placées sur la membrane avec les noyaux et les axones les plus proches de l'objectif sous la plaque.
  10. Retirez l'agarose résiduelle du stade du vibratome, supergluelez l'embryon suivant à l'étape et répétez les étapes 3.7-3.9 jusqu'à ce que tous les embryons aient été tranchés et plaqués.
  11. Ajouter l'inhibiteur ou la molécule recombinante de choix aux médias dans chaque puits pour créer une courbe dose-réponse.  Diluer dans un solvant approprié.
    REMARQUE : Si vous utilisez le DMSO, n'utilisez que le DMSO de qualité de culture tissulaire. Alternativement, les perles éliantes de protéines peuvent être placées dans des endroits spécifiques sur la tranche.
  12. Placer sur le microscope dans la chambre CO2 de 37 oC et 5 %.  Définir le microscope pour prendre le contraste de phase et les photographies fluorescentes de chaque tranche toutes les 30 min (ou plus souvent si désiré). Les tranches peuvent être maintenues pendant 48-72 h.

Résultats

Résultats normaux : La figure 1 fournit un schéma de l'expérience. Commençant dès E9.5 dans la souris, les premiers axones commencent à émerger du noyau oculomoteur26. Par E10.5, un nerf oculomoteur fasculé, qui contient les premiers neurones pionniers, peut être vu dans le mésenchyme. Il existe une variabilité significative entre les embryons à E10.5 (même dans la même portée) dans la mesure dans laquelle le nerf a progressé vers l'orbite, probablemen...

Discussion

Ce protocole de culture de tranche ex vivo fournit des avantages significatifs au-dessus des essais traditionnels de guidage d'axone23. La taille de chaque noyau moteur crânien n'est pas un facteur limitant, et aucune dissection difficile n'est nécessaire. Le microenvironnement endogène à travers lequel les axones voyagent est maintenu, permettant la modification d'une voie de signalisation tout en maintenant d'autres voies de signalisation. En outre, les effets peuvent être évalués à diff...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Financement fourni par le National Eye Institute [5K08EY027850], le National Institute of Child Health and Development [U54HD090255], Le Harvard-Vision Clinical Scientist Development Program [5K12EY016335], la Knights Templar Eye Foundation [Career Starter Grant], et la Children's Hospital Ophthalmology Foundation [Prix de découverte de la Faculté]. ECE est un chercheur de l'Institut médical Howard Hughes.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
24-Well Tissue Culture PlateGenesee Scientific25-107
6-Well Tissue Culture PlateGenesee Scientific25-105
Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass)VWR14672-200
Fine ForcepsFine Science Tools11412-11
Fluorobrite DMEMThermo Fisher ScientificA1896701
Glucose (200 g/L)Thermo Fisher ScientificA2494001
Hank's Balanced Salt Solution (1X)Thermo Fisher Scientific14175-095
Heat Inactivated Fetal Bovine SerumAtlanta BiologicalsS11550H
HEPES Buffer Solution (1M)Thermo Fisher Scientific15630106
L-Glutamine (250 nM)Thermo Fisher Scientific25030081
Loctite SuperglueLoctite
Low Melting Point AgaroseThermo Fisher Scientific16520050
Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um)Millipore SigmaPICM03050
Moria Mini Perforated SpoonFine Science Tools10370-19
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122 
Petri Dish (100 x 15mm)Genesee Scientific32-107G
Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4)Thermo Fisher Scientific10010049
Razor BladesVWR55411-050
Surgical Scissors - BluntFine Science Tools14000-12
Ti Eclipse Perfect Focus with TIRFNikon
Vibratome (VT 1200S)Leica1491200S001
Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel)Ted Pella, Inc.121-6

Références

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