来自胚胎GFP-表达小鼠的Ex Vivo Oculo运动切片培养,用于对Oculo运动神经外生长进行时移成像

摘要

前体切片测定允许实时成像奥库运动神经外生。切片通过嵌入E10.5 Isl MN:GFP胚胎在生长中,在振动体上切片,并在一个顶的培养箱中生长。斧子引导通路的作用是通过向培养培养物添加抑制剂来评估的。

摘要

精确的眼动对视力至关重要,但眼动系统的发展,特别是控制斧突引导的分子通路,尚未得到充分阐明。这部分是由于传统斧子制导测定的技术限制。为了识别影响奥库运动神经的其他斧子引导线索,开发了一种前体切片测定,以实时图像向眼睛生长的奥孔运动神经。E10.5 Isl^MN-GFP胚胎用于生成体外切片,将其嵌入到胶质中,在振动体上切片,然后在显微镜级顶培养箱中生长,用延时显微显微镜进行 24-72 h。从原子核到轨道的斧子生长的体内时间。小分子抑制剂或重组蛋白可以添加到培养培养物中,以评估不同斧头引导途径的作用。该方法的优点是维护轴子遍历的更多局部微环境,而不是对生长的轴子进行轴向,并沿其轨迹的多个点评估轴子。它还可以识别对斧子特定子集的影响。例如,对 CXCR4 的抑制会导致仍在中脑内的斧头生长,而不是口向生长,但已经退出的斧头不受影响。

引言

目视电机系统为研究斧子导向机构提供了一个优雅的系统。它相对简单,包括三个颅神经内侧六个移动眼睛的眼外肌肉(EOMs),以及抬起眼睑的悬浮肌(LPS)。oculo运动神经内枢LPS和四个EOMs - 下等斜和中,下等,和优越的直肠肌肉。其他两种神经, 三角和腹肌, 每个只有内瓦特一个肌肉, 优越的斜和侧直肠肌肉, 分别.眼动提供了一个简单的读出,显示内侧是否适当、缺失或异常。此外,还有由于神经元发育或斧突指导的不足而导致的人眼运动障碍,统称为先天性颅内疾病(CCDDs)1。

尽管有这些优点,目状电机系统很少用于斧子制导研究2,3,4,5,6,7,8, ^9,10,由于技术缺陷。体外斧子制导测定有许多^缺点11。共培养性测定,其中神经元外植与目标^组织12或转染^细胞13的外植一起培养,取决于外植的对称性和外植与目标组织之间的精确定位。条纹测定14,15,其中两个线索被放置在交替条纹和斧子被评估为优先增长一个条纹,只表明一个基板优于另一个,而不是说两个是有吸引力的或排斥,或生理相关。微流体室可以形成精确的化学梯度,但受试者生长的斧子会剪切应力16,17,18,这会影响它们的生长。此外,在每种方法中,收集外植或分离的细胞需要对生长的轴虫进行轴状化,因此这些测定实际上检查轴子再生,而不是初始轴子生长。最后,这些体外方法消除了影响斧子的微环境及其对不同点的线索的反应,传统上只单独测试一个线索。使这些缺点更加复杂的是,眼部运动系统中每个原子核的体积小,使得解剖在技术上对植物外或分离的培养物都具有挑战性。此外,眼动神经元的主要培养物通常是异构的,有显著的细胞死亡,并且密度依赖,需要从多个胚胎中汇集细胞(藤井裕久,个人交流)。然而,由于需要时间和费用,体内方法(包括敲除小鼠模型)不适合用于筛选。

开发培养整个胚胎^的方法19允许标记迁移^细胞20或阻断特定分子21,但整个胚胎培养需要在滚筒瓶中孵育,从而排除了标记的实时成像结构。允许操纵胚胎,然后在子宫或母亲腹部(维持胎盘^连接)22的外科技术,允许操纵胚胎,然后进一步发育22,但这些也不允许延时成像。

为了克服体外检测的障碍,允许快速筛选信号通路,23日开发了一种体外胚胎切片培养技术,该技术改编自先前公布的外周神经外生长^方案24。使用该协议,在沿其轨迹的许多周围结构(包括EOM目标)存在的情况下,可以随时间而对发育中的oculo运动神经进行成像。通过在培养介质中添加小分子抑制剂、生长因子或引导提示,我们可以评估沿斧子轨迹的多个点的制导扰动,从而能够更快速地评估潜在的生长和指导因素。

研究方案

此处描述的所有动物工作均符合波士顿儿童医院机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 协议的批准和执行。

1. 分时配接

1. 放置ISL^MN:GFP (岛运动神经元绿色荧光蛋白;MGI: J:132726;Jax Tg (Isl-EGFP®)1Slp/J 库存号: 017952) 雄性小鼠和雌性小鼠一起过夜。在交配前称量雌性并记录重量。
   注:ISL ^MN:GFP专门标记运动神经元与无细胞毒性的远感GFP,局部到运动神经元及其斧子的细胞膜,并允许神经在发育25期间可视化。也可以使用其他荧光标记的线条。
2. 清晨检查阴道塞。插头的识别日期被指定为 E0.5。
3. 在 E10.5 使用体重增加和/或超声波确认怀孕。怀孕的水坝应该至少获得1克。胚胎可以在E10.5的超声波上看到。

2. 为切片培养制备试剂和振动剂

1. 准备500 mL的切片缓冲液:在汉克平衡盐溶液(HBSS)中加入5 mL的HEPES和5 mL的青霉素/链霉素,而不加Ca²⁺和Mg^2+。 冷却至4°C。
   注:额外的切片缓冲液应储存在4°C,并可用于未来的切片培养实验。
2. 制备50 mL培养素:在无菌罩中,加入12.5 mL的HBSS、12.5 mL的胎儿牛血清、250 μL的葡萄糖、250 μL的L-谷氨酰胺、125 μL的HEPES至24.4 mL的氟布赖特DMEM。(最终浓度:氟布赖特DMEM,HBSS25%,25%FBS,0.5%葡萄糖,1 mM谷氨酰胺和2.5 mM HEPES。 在无菌水浴中加热培养基至37°C。
   注:培养介质可在 4°C 下存储长达 3 周。
   1. 在无菌罩中,在 6 孔板的每个孔中添加 1.5 mL 的培养介质。 在每个孔中添加细胞培养插件 (材料表) . 放置在无菌的 37 °C 和 5%_CO2培养箱中。
3. 制备4%低熔融温度甘蔗:在50 mL无菌PBS中溶解2克低熔温甘蔗。以 30-60 秒的间隔微波,直到完全溶解。放入40°C的水浴中,以保持液体。
   注:额外的甘蔗可以储存在室温(RT)和熔化,以备将来切片培养实验。
4. 设置振动器:在振动器上放置新刀片。检查设置:厚度 400-450 μm. 预冷振动阶段。在外室放置一些冰块。使用专用于活切片的造型室和舞台。不要对固定组织使用相同的振动室,因为残留固定剂可能对切片造成损害。
5. 将显微镜阶段顶部培养箱制备至37°C和5%CO2。
6. 准备解剖:清洁手术器械,用70%乙醇喷雾。用哈佛商学院填充两个培养皿,放在冰上。打开12孔组织培养板,将盖子放在冰上,底面朝上。打开6孔组织培养板,将细胞培养膜插入和1.5 mL细胞培养基放在每个孔中。在 37°C 和 5% CO₂培养箱中预加热板。

3. 收获E10.5胚胎和准备切片

注:此时的所有步骤都应尽快完成。时刻把胚胎放在冰上。

1. 在 CO₂室中对怀孕的水坝 (E10.5) 实施安乐死。进行宫颈脱位。
2. 用70%乙醇喷洒腹部。用剪刀切开腹部,取出子宫,并将其放入装有冰冷的HBSS的培养皿中,以迅速洗去血液。将洗过的子宫移到充满盘冰冷 HBSS 的第二个培养皿中。
3. 在解剖范围内,从子宫角和单个羊水囊中取出胚胎。将胚胎放在12孔板盖的底面。保持冰上。
4. 在解剖范围内,使用过滤纸去除每个胚胎周围的任何液体。
   注:如果触摸,胚胎会粘在滤纸上。
5. 将胚胎嵌入到甘蔗中。将融化的甘蔗倒在每个胚胎上以覆盖它。保持冰上。一旦甘蔗变硬,翻转每个胚胎,并在另一侧倒额外的甘蔗。保持冰上。
6. 使用荧光解剖范围,修剪每个胚胎周围的角胶,使其在粘附到振动镜阶段时正确定向。电运动核和早期斧头生长是荧光的。对齐胚胎,使细胞核,生长的斧头,和眼睛形成一条线,并修剪与这条线平行的剃刀刀切的角质的角质(背到胚胎,参见图1A)。
   注:这将是侧粘附到振动器阶段(胚胎将放置在其背部,头部最接近振动器刀片)。运动核和眼睛之间的一条线应该平行于振动叶片。
7. 用冰冷的切片缓冲液填充振动室。将胚胎超级粘附到振动器阶段,使刀片与卵子细胞核和眼睛平行。一旦超级胶水干燥,淹没振动体阶段,使胚胎朝向远离刀片。
8. 切片 400-450 μm 切片。 用无菌转移移液器收集每个切片。放入冷切片缓冲液中。
9. 在解剖范围下,选择含有电运动核和眼睛的切片。使用无菌转移移液器,将其放在 6 孔板的细胞培养插件上。将板返回到 37°C 培养箱。或者,让一个人切片,另一个人放置切片。将切片和放入培养箱之间的时间降至最低。
   注:切片的定向方式应使从原子核和斧子发射的最大荧光最接近成像显微镜目标。在倒置显微镜上,切片应放置在膜上,其核和斧子最接近板下方的物镜。
10. 从振动器阶段取出残留的甘蔗,将下一个胚胎超级粘附到该阶段,并重复步骤3.7-3.9,直到所有胚胎都切片和镀层。
11. 在每个孔中的介质中添加选择的抑制剂或重组分子,以创建剂量-响应曲线。 以适当的溶剂稀释。
    注:如果使用 DMSO,则仅使用组织培养等级 DMSO。或者,蛋白质脱脂珠子可以放置在切片上的特定位置。
12. 放置在 37°C 和 5% CO₂腔室的显微镜上。 设置显微镜,每 30 分钟拍摄一次相位对比度和每片荧光照片(如果需要,更频繁地拍摄)。切片可维持48-72小时。

结果

正常结果:图1提供了实验的原理图。早在E9.5在小鼠,第一个斧头开始从oculmotor^核26出现。通过E10.5,一种包含早期先驱神经元的迷法性神经,可以在中枢可见。E10.5的胚胎(即使在同一垃圾内)在神经向轨道前进的步数上存在显著差异,这可能是由于几个小时的发育差异。在正常子宫发育期间,第一个GFP阳性oculmotoraxons在接下来的18-24小时(E11.5)到达轨道/眼睛,然?...

讨论

这种外生切片培养方案与传统的斧子导样^测定23相比具有显著优势。每个颅骨运动核的大小不是一个限制因素,不需要任何困难的解剖。维持斧子传播的内源微环境,允许修改一个信令通路,同时保持其他信令通路。此外,可以在沿斧子轨迹的不同点评估效果。由于斧子制导需要多个线索和线索的组合,沿着路径29,这提供了一个显著的优势。与分离或外植培养不同,这?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-Well Tissue Culture Plate	Genesee Scientific	25-107
6-Well Tissue Culture Plate	Genesee Scientific	25-105
Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass)	VWR	14672-200
Fine Forceps	Fine Science Tools	11412-11
Fluorobrite DMEM	Thermo Fisher Scientific	A1896701
Glucose (200 g/L)	Thermo Fisher Scientific	A2494001
Hank's Balanced Salt Solution (1X)	Thermo Fisher Scientific	14175-095
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11550H
HEPES Buffer Solution (1M)	Thermo Fisher Scientific	15630106
L-Glutamine (250 nM)	Thermo Fisher Scientific	25030081
Loctite Superglue	Loctite
Low Melting Point Agarose	Thermo Fisher Scientific	16520050
Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um)	Millipore Sigma	PICM03050
Moria Mini Perforated Spoon	Fine Science Tools	10370-19
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri Dish (100 x 15mm)	Genesee Scientific	32-107G
Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4)	Thermo Fisher Scientific	10010049
Razor Blades	VWR	55411-050
Surgical Scissors - Blunt	Fine Science Tools	14000-12
Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF	Nikon
Vibratome (VT 1200S)	Leica	1491200S001
Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel)	Ted Pella, Inc.	121-6