استخدام الأنسجة المجمدة في فحص المذنب لتقييم تلف الحمض النووي

Summary

يصف هذا البروتوكول العديد من الإجراءات لإعداد عينات الأنسجة المجمدة عالية الجودة في وقت التشريح لاستخدامها في فحص المذنب لتقييم تلف الحمض النووي: 1) الأنسجة المفرومة، 2) الخلايا الظهارية الكشط من الجهاز الهضمي، و 3) الأنسجة المكعبة عينات، مما يتطلب التجانس باستخدام جهاز تصغير الأنسجة.

Abstract

يكتسب فحص المذنب شعبية كوسيلة لتقييم تلف الحمض النووي في الخلايا والأنسجة المستزرعة ، خاصة بعد التعرض للمواد الكيميائية أو الضغوطات البيئية الأخرى. وقد كان الدافع وراء استخدام فحص المذنبفي الاختبارات التنظيمية لإمكانات السمية الجينية في القوارض هو اعتماد مبدأ توجيهي لاختبار منظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي في عام 2014. عادة ما يتم إعداد شرائح فحص المذنب من الأنسجة الطازجة في وقت النُقال. ومع ذلك ، يمكن تجميد عينات الأنسجة تجنب التحديات اللوجستية المرتبطة بالتحضير المتزامن للشرائح من أعضاء متعددة لكل الحيوان ومن العديد من الحيوانات في كل دراسة. كما يتيح التجميد عينات الشحن من مرفق التعرض إلى مختبر مختلف للتحليل، ويسهل تخزين الأنسجة المجمدة تأجيل اتخاذ قرار بتوليد بيانات تلف الحمض النووي لجهاز معين. إن فحص المذنب القلوي مفيد للكشف عن الحمض النووي المرتبط بالتعرض، فواصل مزدوجة وأحادية، وآفات قلوية-لابيلي، وفواصل حبلا مرتبطة بإصلاح الختان غير الكامل للحمض النووي. ومع ذلك ، يمكن أن ينتج تلف الحمض النووي أيضًا عن القص الميكانيكي أو إجراءات معالجة العينات غير السليمة ، مما يربك نتائج الفحص. وقد يكون من الصعب التحكم في إمكانية استنساخ عينات الأنسجة أثناء النُقات ومعالجتها بسبب تقلب موظفي المختبرات ذوي المستويات المختلفة من الخبرة في حصاد الأنسجة الخاصة بإمكانية فحص المذنب. وتعزيز الاتساق من خلال التدريب على تجديد المعلومات أو نشر وحدات متنقلة مزودة بموظفين من ذوي الخبرة في المختبرات أمر مكلف وقد لا يكون ممكنا دائما. لتحسين توليد متسقة من عينات ذات جودة عالية لتحليل المقنب، تم تقييم طريقة لتجانس مكعبات فلاش المجمدة من الأنسجة باستخدام جهاز mincing الأنسجة مخصصة. عينات أعدت لفحص المذنب من قبل هذه الطريقة مقارنة بشكل إيجابي في الجودة لعينات الأنسجة الطازجة والمجمدة التي أعدتها mincing أثناء النُقات. وعلاوة على ذلك، تم قياس انخفاض الضرر الحمض النووي الأساسي في الخلايا من مكعبات المجمدة من الأنسجة بعد التخزين لفترات طويلة.

Introduction

يستخدم فحص المذنب بشكل متزايد كوسيلة لتقييم تلف الحمض النووي في الخلايا المستزرعة والأنسجة المعرضة للمواد الكيميائية أو الضغوطات البيئية الأخرى¹. يمكن للفحص الكشف عن فواصل الحمض النووي المزدوج وأحادية، والآفات القلوية والآفية، وفواصل حبلا واحدة المرتبطة بإصلاح الحمض النووي غير مكتملة. يوصي المجلس الدولي لتنسيق المتطلبات التقنية للمستحضرات الصيدلانية للاستخدام البشري (ICH) بالمبادئ التوجيهية للاختبار الصيدلاني بفاصل خيط الحمض النووي مثل فحص المذنب كاختبار ثان ٍ لتكملة قياس النواة المجهرية لمادة الكريات والقوارض لتقييم السمية الجينية للقدرة العضوية العضوية العضوية الحمراء وكاختبار متابعة لتقييم طريقة العمل في الأعضاء المستهدفة لتحريض الورم². توصي الهيئة الأوروبية لسلامة الأغذية (EFSA) بالفحص في حالة التسمم على المذنب كاختبار متابعة مناسب للتحقيق في مدى أهمية النتيجة الإيجابية في اختبار السمية الجينية في المختبر³. وفي عام 2014، تمت الموافقة على مبدأ توجيهي لاختبار منظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي فيما يتعلق بفحص المذنبات القوارض، مما زاد من مقبولية القول لاستخدامه في الاختبارات التنظيمية لإمكانات السمية الجينية. ويستند هذا الفحص على الفصل الكهربائي من حلقات الحمض النووي استرخاء والشظايا التي تهاجر من الخلايا المنتحلة. في الأساس ، يتم تضمين الخلايا المفردة في agarose التي تم طبقات على شرائح المجهر. ثم يتم غمر الشرائح في المخزن المؤقت حل السليس تليها القلوية (درجة الحموضة > 13) الحل، والذي يسمح للحمض النووي ملفوف بإحكام للاسترخاء والاسترخاء. ثم توضع الشرائح في حقل كهربائي، مما يحفز هجرة الحمض النووي المشحون سلبا نحو الأنود، مما يخلق صورا تشبه المذنبات؛ المقدار النسبي للحمض النووي في ذيل المذنب مقارنة مع رأس المذنب يتناسب بشكل مباشر مع كمية تلف الحمض النووي؛ عادة ما يتم قياس محتوى الحمض النووي في الذيل باستخدام برامج التصوير الرقمي.

نظرًا لأن مقاز المذنب يكشف الحمض النووي المجزأ ، فإن التحديد الكمي الدقيق لتلف الحمض النووي الناجم عن التعرض يمكن أن يُمكن أن يُربك بسبب تجزؤ الكروماتين المرتبط بالنخر أو الخلايا المبرمجة الناتجة عن السمية أو الإجهاد الناجم عن العلاج. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يحدث تلف الحمض النووي نتيجة للقص الميكانيكي أو معالجة العينة غير السليمة^4. وقد أظهرت أهمية الحفاظ على الأنسجة المحصودة المبردة قبل إعداد الشريحة لتقليل مستوى خط الأساس لتلف الحمض النووي في السابق^5,6. العديد من المختبرات إعداد الشرائح فحص المذنب من الأنسجة الطازجة; ومع ذلك ، يمكن أن يكون هذا تحديًا لوجستيًا عند إعداد الشرائح من أنواع الأنسجة المتعددة لكل الحيوان في دراسة مع عدد كبير من الحيوانات. وعلاوة على ذلك، فإن هذا يمثل مشكلة عندما يتم إعداد وتحليل الشرائح في مختبر بعيد، مما يستلزم شحن العينات. على سبيل المثال، يتضمن البرنامج الوطني الأمريكي لعلم السموم فحص المذنب كعنصر في برنامج اختبار السموم الوراثية (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) ويدمج في بعض الأحيان الفحص في دراسات سمية الجرعة المتكررة لمدة 28 أو 90 يومًا؛ وهذا يتطلب جمع الأنسجة من قبل المختبر في الحياة ونقل العينات إلى مختبر آخر للتحليل. لتحقيق ذلك ، يتم مفروم قطع الأنسجة ، ويتم كشط / أو الخلايا الظهارية في الجهاز الهضمي ويتم تجميد التعليق الخلوي وتخزينها في ثلاجة للشحن والتخزين اللاحق من قبل المختبر المتلقي حتى التحليل⁷. التعامل السليم مع العينات أمر بالغ الأهمية للحصول على بيانات عالية الجودة باستخدام الأنسجة المجمدة. ومع ذلك ، فإن التلاعب القابل للتكرار لعينات الأنسجة أثناء النُسج الذي يقوم به أفراد دائمي التغير يصعب السيطرة عليه ، خاصة في المختبرات في الحياة التي لا تحصد الأنسجة بشكل روتيني لفحص المذنب. وغالبا ً ما يكون التدريب المنعش لموظفي التشريح أو استخدام وحدة متنقلة يعمل بها موظفون مختبرون متمرسون لجمع عينات من الأنسجة الطازجة أو المجمدة مكلفاً للغاية، أو غير ممكن، أو مجرد التقليل من قيمته.

لضمان توليد متسقة على نحو أفضل من عينات الأنسجة عالية الجودة لنقلها إلى موقع بعيد لتحليل فحص المذنب ، تم استكشاف فائدة الطريقة المنشورة⁶ لحفظ الأنسجة من مكعبات الأنسجة المجمدة الفلاشية. في هذه الطريقة، يتم تحميل مكعبات المجمدة من الأنسجة في جهاز mincing الأنسجة الفولاذ المقاوم للصدأ(الشكل 1)التي يتم وضعها في أنبوب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على عازلة الباردة. ثم يتم دفع مكعب الأنسجة من خلال شبكة قياس صغيرة في نهاية الجهاز. إجبار تعليق الأنسجة مرارا وتكرارا من خلال منخل شبكة في كلا الاتجاهين عدة مرات يؤدي إلى تعليق خلية واحدة موحدة نسبيا. عينات أعدت من قبل هذه الطريقة مقارنة إيجابية في الجودة لكل من عينات الأنسجة الطازجة والمجمدة التي أعدتها mincing. كفائدة إضافية ، على عكس العينات المفرومة ، يمكن تخزين مكعبات الأنسجة المجمدة لفترات طويلة من الزمن ولا تزال تحقق نتائج عالية الجودة في فحص المذنب.

Protocol

تم حصاد الأنسجة أثناء إجراء الدراسات التي أجريت في المرافق المعتمدة من AAALAC في مختبرات عقد NTP وفقًا للوائح الممارسة المختبرية الجيدة (21 CFR الجزء 58) وبروتوكولات الاستخدام الحيواني المعتمدة من قبل الحيوان المؤسسي لجنة الرعاية والاستخدام (IACUC) في كل مختبر.

1. حصاد الأنسجة وتجهيزها

ملاحظة: من المفيد إعداد أنابيب عينة مكررة (على سبيل المثال، الكبد) أو نقل ما يقرب من نصف العينة إلى أنبوب تخزين آخر (على سبيل المثال، الاثني عشر والمعدة) لتمكين إعادة التحليل، إذا لزم الأمر. لتقليل التباين المحتمل بين العينة والعينات لأنسجة الأمعاء ، يوصى بتوخي الحذر لأخذ عينات من نفس المنطقة من الأنسجة بالنسبة للمعدة لكل الحيوان ، وتقسيم عينة لتوليد عينات مكررة. يوصى باستخدام ملقط بلاستيكية لنقل الأنسجة اللزجة مثل الدماغ. كخيار، يمكن تصفية مستحضرات الأنسجة المفرومة أو الكشطأو المتجانسة لتحقيق تعليق خلية واحدة متجانسة باستخدام مصفاة خلية 40 ميكرومتر متصلة بأنبوب مخروطي.

1. إزالة أي الأنسجة المتصلة المرفقة، والأجهزة، والحطام من الجهاز (ق) من الفائدة. مباشرة بعد إزالة, حفيف الجهاز بقوة في قارب وزن متوسط الحجم يحتوي على ~ 7 مل من الباردة الطازجة حل mincing (ملغ⁺⁺, Ca⁺⁺ والفينول الأحمر خالية من حل الملح المتوازن هانك, 10% v/ v DMSO, و 20 mM EDTA pH 7.5) لإزالة الدم المتبقية والحطام.
2. نقل كل عضو إلى آخر قارب وزن نظيفة تحتوي على ما يكفي (~ 7 مل) محلول الممسحة الباردة للحفاظ على الأنسجة المغمورة، على الجليد، حتى مزيد من المعالجة.
3. قم بإزالة مقطع من كل عضو مهم ووضعه في كاسيت تضمين. إصلاح في 10٪ محايدة المؤقتة formalin، تقليم، والبارافين تضمين وفقا للإجراءات القياسية للمختبر لتقييم ممكن في المستقبل علم الأمراض الهستوم.
4. للكبد، وقطع مقطع طولي 5 مم من الفص الأيسر وحفيف بلطف في ~ 7 مل من محلول المقلب الباردة. ضع شريط الأنسجة في قارب وزن متوسط الحجم نظيف يحتوي على ~ 7 مل من محلول المينغ البارد والحفاظ على الجليد حتى يصبح جاهزًا لمزيد من المعالجة (الخطوة 1.8 أو 1.11).
5. لالاثني عشر، وقطع جزء 10 ملم من الاثني عشر مقربة من المعدة. باستخدام إبرة 21-25 G, تدفق لإزالة الحطام والبكتيريا.
   1. إدراج إبرة في نهاية واحدة من الاثني عشر وتدفق مع 1 مل من محلول المقلب الباردة.
   2. تدفق الاتجاه الآخر عن طريق التقليب الاثني عشر أكثر وتكرار مع آخر 1 مل من محلول mincing. تخلص من الإبرة.
   3. شريحة الاثني عشر مفتوحة وشطف في ~ 7 مل من محلول mincing قبل وضعه في قارب وزن متوسط الحجم يحتوي على ~ 7 مل من محلول mincing نظيفة؛ الحفاظ على الجليد حتى تكون جاهزة لمزيد من المعالجة (الخطوة 1.8 أو 1.11).
6. بالنسبة للدماغ، قد يكون من المفيد تقسيم الدماغ أولاً إلى نصفي نصفي نصفي. يمكن حفظ نصف الكرة الأرضية واحد لاحتمال علم الأمراض الهستولوجية (انظر الخطوة 1.2).
   1. تشريح منطقة الدماغ (المناطق) من الفائدة وحفيف بلطف في ~ 7 مل من محلول المقلب الباردة.
   2. نقل الأنسجة (الأنسجة) إلى قارب وزن متوسط الحجم نظيف يحتوي على ~ 7 مل من محلول المينغ البارد والحفاظ على الجليد حتى تصبح جاهزة لمزيد من المعالجة (الخطوة 1.8 أو 1.11؛ لاحظ أن المناطق الصغيرة مثل المخيخ وقرن آمون قد لا تتطلب أي تشذيب آخر).
7. للمعدة
   1. إزالة وتجاهل المعدة. قطع فتح المعدة غدية وغسل خالية من الطعام باستخدام ~ 7 مل من عازلة الموين الباردة في قارب وزن متوسط الحجم.
   2. إزالة شريط 5 مم من المعدة الغدية القريبة من الاثني عشر لتثبيت لتقييم ممكن علم الأمراض الهسطولوجية (انظر الخطوة 1.2).
   3. ضع المعدة المتبقية في ~ 7 مل من عازل المينغ البارد ة في قارب وزن متوسط الحجم واحتضان على الجليد لمدة 15-30 دقيقة.
      ملاحظة: وقد لا تكون خطوة الحضانة هذه ضرورية؛ بل قد تكون ضرورية. تم تضمين هذه الخطوة في بروتوكول التحقق من صحة JaCVAM، ولكن لم يرد ذكرها في المبدأ التوجيهي اختبار منظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي^8،9.
   4. نقل المعدة إلى قطعة نظيفة من البارافين (أو طبق بيتري أو وزن القارب) وكشط بلطف ظهارة السطح مرتين أو أكثر باستخدام شفرة مشرط أو مكشطة polytetrafluoroethene (PTFE) لإزالة الحطام. التقاط الغشاء المخاطي في المعدة مع ملقط وشطف مع 1 مل من عازلة الموعن الباردة باستخدام pipet. نقل أنسجة المعدة إلى سطح نظيف أو طبق.
   5. كشط بعناية ظهارة المعدة 4-5 مرات (أكثر، إذا لزم الأمر) في محلول mincing (عادة 250 ميكرولتر / فأر أو 500-1000 μL/rat) مع الجزء الخلفي من شفرة مشرط أو مكشطة PTFE للإفراج عن الخلايا. اختياريا، شطف الأنسجة مع حجم متساو تقريبا من محلول المواخر لاسترداد المزيد من الخلايا. جمع محلول mincing الذي يحتوي على الخلايا المفرج عنها باستخدام أنبوب ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير على الجليد.
8. لعينات الأنسجة mincing، وقطع قسم 3-4 ملم من أنسجة الكبد أو الدماغ أو ~ 5 ملم من الاثني عشر ونقل إلى 1.5 أو 2.0 مل أنبوب الطرد المركزي الدقيق المسمى التي تحتوي على 1 مل من محلول المقلب الباردة. المفروم بسرعة (≤ 30 ق) مع مقص mincing حتى تفرقنا ناعما، مع الحفاظ على العينة الباردة. يجب أن تبدو العينة غائمة قليلاً. ومع ذلك، فمن الشائع لبعض القطع أن تبقى من شأنها أن تستقر إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
9. لاستخدام الأنسجة الطازجة، والحفاظ على أنابيب تحتوي على الأنسجة المفرومة أو الخلايا الظهارية كشط على الجليد. استخدام الأنسجة لإعداد الشرائح المذنب في غضون ما يقرب من 1 ح من الحصاد (المبينة في القسم 2).
10. لتجميد عينات الأنسجة، مباشرة بعد mincing أو جمع الخلايا الظهارية كشط
    1. تأمين غطاء أنبوب وإسقاط أنبوب في قارورة ديوار التي تحتوي على النيتروجين السائل; يمكن الحفاظ على أنابيب في النيتروجين السائل لمدة النُج (≤3 ساعة).
    2. استرداد أنابيب باستخدام مغرفة ومكان على الجليد الجاف لفرز. نقل الأنابيب إلى صندوق التجميد على الثلج الجاف وصندوق تخزين في ثلاجة -80 درجة مئوية.
11. لإعداد مكعبات المجمدة من الأنسجة، وقطع عدة قطع صغيرة من الأنسجة (≤ 4 ملم في القطر و ~ 6 ملم في الطول؛ الشكل 1).
    1. إسقاط ها مباشرة مباشرة في قارب وزن متوسط الحجم أو وعاء مناسب آخر يحتوي على النيتروجين السائل.
    2. انتظر بضع ثوان حتى تتجمد القطع تمامًا ونقل مكعبات الأنسجة المجمدة الفردية إلى أنبوب ميكروطرد مركزي أو أنبوب التبريد المسمى الذي يتم صيانته على الثلج الجاف؛ لا تسمح القطع لتكتل معا خلال عملية التجميد.
    3. نقل الأنابيب إلى صندوق التجميد على الثلج الجاف وصندوق تخزين في ثلاجة -80 درجة مئوية.

2. إعداد الشرائح

1. للأنسجة المفرومة / الكشط
   1. الحفاظ على أنابيب تحتوي على الأنسجة الطازجة على الجليد الرطب.
   2. ضع أنابيب الأنسجة المجمدة في حمام مائي درجة حرارة الغرفة حتى يتم إذابة العينات تمامًا ، مع ضمان الحفاظ عليها باردة. نقل الأنابيب على الجليد على الفور.
   3. مباشرة قبل سحب الخلايا لنقلها إلى agarose (الخطوة 2.3), مزيج كل تعليق الخلية بلطف; للعينات غير المصفاة، والسماح لقطع كبيرة لتسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب. الحفاظ على جميع الأنابيب على الجليد حتى تم إعداد الشرائح لجميع العينات.
2. للأنسجة المكعبة
   1. استرداد الأنابيب التي تحتوي على مكعبات الأنسجة من الفريزر 80 درجة مئوية والحفاظ على الجليد الجاف حتى إعداد الشريحة.
   2. Aliquot 1 مل من وسيط التاجر (0.14 M NaCl ، 1.47 mM KH₂PO₄، 2.7 mM KCl ، 8.1 mM Na₂HPO₄أو 10 mM NaEDTA ، pH 7.4) أو محلول mincing في أنبوب طرد مركزي صغير يحمل علامة 1.7 مل لكل عينة والحفاظ على الجليد.
   3. العمل بسرعة لتجنب ذوبان الأنسجة، ووضع مكعب من الأنسجة في نهاية مفتوحة من جهاز mincing الأنسجة درجة حرارة الغرفة(الشكل 1). ويمكن استخدام قطع الأنسجة متعددة; إذا لزم الأمر ، قد يتم قطع الأنسجة المجمدة أو تكسيرها إلى قطع أصغر باستخدام هاون والحشرات الباردة لتقليل حجم المكعب ليتناسب مع الجهاز.
   4. إدراج بسرعة المكبس حقنة مطابقة الحجم في الجهاز لدفع الأنسجة إلى نهاية شبكة التي ينبغي بعد ذلك أن توضع في أنبوب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على محلول الموقن الباردة؛ تجنب إجبار السائل على تجاوز الأنبوب. تزج في نهاية شبكة الجهاز لحوالي 5-10 s في محلول المقلب الباردة للسماح للأنسجة بذوبان الجليد تماما.
   5. الاكتئاب تماما المكبس حتى ينظر إلى الخلايا البثق من خلال المسام شبكة. ثم سحب المكبس حتى ما يقرب من 2.5 سم واضغط لأسفل مرة أخرى تماما؛ كرر العملية عدة مرات حتى يصبح حل mincing عكرًا.
   6. إذا لزم الأمر ، قد تتركز العينة لزيادة كثافة الخلايا عن طريق الطرد المركزي المبرد لمدة 5 دقيقة عند 1100 دورة في الدقيقة وإزالة جزء من supernatant.
   7. كرر العملية لجميع العينات باستخدام جهاز مسح الأنسجة النظيفة لكل عينة.
3. نقل 50 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى أنبوب يحتوي على 450 ميكرولتر من 0.5٪ نقطة انصهار منخفضة agarose عند 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: يمكن تعديل الأحجام، ولكن يجب أن يكون مقدار agarose ≤ 1٪.
4. إعداد وتسجيل الشرائح كما هو موضح سابقا^10،11.

النتائج

الدراسة الأولى
تم حصاد الكبد من اثنين من أفواج من الفئران الذكور سبراغ داولي تدار زيت الذرة لمدة 4 أيام، متداخلة من قبل أسبوع واحد. تم إعداد الشرائح من الأنسجة المفرومة الطازجة ، والأنسجة المفرومة المجمدة ، والأنسجة المكعبة المجمدة التي تتم معالجتها في حل التاجر المتوسط أو mincing ...

Discussion

كما ثبت سابقا^7،12،13، التعامل بشكل صحيح فلاش الأنسجة المفرومة المجمدة يوفر نتائج جيدة في فحص المذنب. في الواقع، خط الأساس % قيم الحمض النووي الذيل للفئران المفروم المجمدة والكبد الماوس أعدت في مختبرنا عادة ≤ 6٪، كما أوصى به المبدأ التوجيهي ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryovials	Corning Costar	430488
Dental Wax Sheets	Electron Microscopy Sciences	72670
Dissecting (Mincing) Micro Scissors	Fisher Scientific	08-953-1B
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14175-079
KCl	Teknova	P0315-10
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791
Low Melting Point Agarose	Lonza	50081
Microfuge Tubes (1.7 mL )	Corning	3207
Na2EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S7907
NaCl	Sigma-Aldrich	S6191
Neutral Buffered Formalin	Leica	600
Scalpel Blades	Miltex	4-110
Syringe Plunger (1 mL )	Fisher Scientific or Vitality Medical	14-826-88; 8881901014	Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe
Tissue Mincing Device	NorGenoTech (Oslo, Norway)	None	Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger.
Tweezers, plastic	Trade Winds Direct	DF8088N	Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com
Weigh Boats	Krackler Scientific/Heathrow Scientific	6290-14251B