Uso de tecido congelado no ensaio do cometa para avaliação de danos no DNA

Resumo

Este protocolo descreve vários procedimentos para a preparação de amostras de tecido congelado de alta qualidade no momento da necropsia para uso no ensaio do cometa para avaliar danos no DNA: 1) tecido picado, 2) células epiteliais raspadas do trato gastrointestinal e 3) tecido em cubos amostras, necessitando de homogeneização usando um dispositivo de picar tecido.

Resumo

O ensaio do cometa está ganhando popularidade como um meio de avaliar os danos do DNA em células e tecidos cultivados, particularmente após a exposição a produtos químicos ou outros estressores ambientais. O uso do ensaio do cometa em testes regulatórios para potencial genotóxico em roedores foi impulsionado pela adoção de uma diretriz de teste da Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE) em 2014. Os slides de ensaio de cometasão normalmente preparados a partir de tecido fresco no momento da necropsia; no entanto, o congelamento de amostras de tecidos pode evitar desafios logísticos associados à preparação simultânea de slides de múltiplos órgãos por animal e de muitos animais por estudo. O congelamento também permite o envio de amostras da instalação de exposição para um laboratório diferente para análise, e o armazenamento de tecido congelado facilita o adiamento da decisão de gerar dados de danos de DNA para um determinado órgão. O ensaio de cometa alcalino é útil para detectar quebras de DNA de dna e fio único relacionados à exposição, lesões alcalinas-labiles e quebras de fios associadas com o reparo incompleto da excisão do DNA. No entanto, os danos no DNA também podem resultar de procedimentos mecânicos de cisalhamento ou processamento de amostras inadequados, confundindo os resultados do ensaio. A reprodutibilidade na coleta e processamento de amostras de tecidos durante necropsias pode ser difícil de controlar devido à flutuação de pessoal de laboratório com diferentes níveis de experiência na colheita de tecidos para o ensaio do cometa. Aumentar a consistência através do treinamento de atualização ou implantação de unidades móveis com pessoal de laboratório experiente é caro e nem sempre pode ser viável. Para otimizar a geração consistente de amostras de alta qualidade para análise de ensaios de cometas, foi avaliado um método para homogeneizar cubos de tecido congelados flash usando um dispositivo de picar tecido personalizado. Amostras preparadas para o ensaio do cometa por este método comparadas favoravelmente em qualidade a amostras de tecido fresco e congelado preparadas por picar durante a necropsia. Além disso, o dano baixo do DNA da linha de base foi medido em células de cubos congelados de tecido após armazenamento prolongado.

Introdução

O ensaio do cometa é cada vez mais usado como um meio de avaliar os danos do DNA em células cultivadas e tecidos expostos a produtos químicos ou outros estressores ambientais¹. O ensaio pode detectar quebras de DNA duplo e único, lesões alcalinas-labiles e quebras de fios únicos associadas ao reparo incompleto do DNA. O Conselho Internacional de Harmonização dos Requisitos Técnicos para Medicamentos para Uso Humano (ICH) para testes farmacêuticos recomenda um ensaio de quebra de fios de DNA, como o ensaio do cometa como um segundo teste para complementar o ensaio do micronúcleo eritrócito de roedores para avaliação da genotoxicidade in vivo e como um teste de acompanhamento para avaliação do modo de ação em órgãos-alvo de indução de tumor². A Autoridade Europeia de Segurança Alimentar (EFSA) recomenda o ensaio do cometa in vivo como um teste de seguimento adequado para investigar a relevância de um resultado positivo em um teste de genotoxicidade in vitro³. Em 2014, uma diretriz de teste da OCDE foi aprovada para o ensaio do cometa roedor, aumentando assim a aceitação do ensaio para uso em testes regulatórios de potencial genotóxico. O ensaio é baseado na separação eletroforética de laços de DNA relaxados e fragmentos que migram de nucleóides de células lysed. Basicamente, células únicas estão embutidas em agarose que foi colocada em camadas em slides de microscópio. Os slides são então imersos em tampão de lyse seguido de uma solução alcalina (pH > 13), que permite que o DNA nuclear bem enrolado relaxe e descontraa. Os slides são então colocados em um campo elétrico, o que estimula a migração do DNA negativamente carregado em direção ao ânodo, criando imagens que se assemelham a cometas; a quantidade relativa de DNA na cauda do cometa em comparação com a cabeça do cometa é diretamente proporcional à quantidade de dano de DNA; O conteúdo de DNA na cauda é tipicamente quantificado usando software de imagem digital.

Como o ensaio do cometa detecta DNA fragmentado, a quantificação precisa de danos de DNA induzidos por exposição pode ser confundida pela fragmentação da cromatina associada à necrose ou apoptose resultante de citotoxicidade ou estresse induzidos pelo tratamento. Além disso, danos no DNA podem ocorrer como resultado de cisalhamento mecânico ou processamento inadequado da amostra⁴. A importância de manter o tecido colhido refrigerado antes da preparação do slide para minimizar o nível de base de dano de DNA foi previamente demonstrada^5,6. Muitos laboratórios preparam slides de ensaio sinuosos de tecido fresco; no entanto, isso pode ser logisticamente desafiador ao preparar slides de múltiplos tipos de tecidos por animal em um estudo com um grande número de animais. Além disso, apresenta um problema quando a preparação e análise de slides devem ocorrer em um laboratório remoto, necessitando de remessa de amostras. Por exemplo, o Programa Nacional de Toxicologia dos EUA inclui o ensaio do cometa como um componente de seu programa de testes toxicológicos genéticos (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) e às vezes incorpora o ensaio em estudos de toxicidade de repetição de 28 ou 90 dias; isso requer a coleta de tecidos pelo laboratório em vida e a transferência de amostras para outro laboratório para análise. Para isso, as peças de tecido são picadas e/ou células epiteliais do trato gastrointestinal são raspadas e as suspensões celulares são congeladas e armazenadas em um congelador para posterior embarque e armazenamento pelo laboratório receptor até a análise⁷. O manuseio adequado das amostras é crucial para a obtenção de dados de alta qualidade utilizando tecido congelado; no entanto, a manipulação reprodutível de amostras de tecidos durante necropsias realizadas por pessoas em constante mudança é difícil de controlar, especialmente em laboratórios em vida que não coletam tecidos rotineiramente para o ensaio do cometa. O treinamento de atualização da equipe de necropsia ou o uso de uma unidade móvel com pessoal de laboratório experiente para coletar amostras de tecido fresco ou congelado é muitas vezes muito caro, inviável ou simplesmente desvalorizado.

Para garantir melhor a geração consistente de amostras de tecido de alta qualidade para transferência para um local remoto para análise de ensaios de cometas, foi explorada a utilidade de um método publicado⁶ de preservação de tecidos a partir de cubos de tecido congelados flash. Neste método, cubos congelados de tecido são carregados em um dispositivo de picar tecido de aço inoxidável(Figura 1) que é colocado em um tubo de microcentrífuga contendo tampão frio. O cubo de tecido é então empurrado através de uma pequena malha de bitola na extremidade do dispositivo. Forçar repetidamente a suspensão do tecido através da peneira de malha em ambas as direções várias vezes resulta em uma suspensão celular única relativamente uniforme. Amostras preparadas por este método comparadas favoravelmente em qualidade a amostras de tecido fresco e congelado preparadas por picar. Como um benefício adicional, ao contrário das amostras picadas, os cubos de tecido podem ser armazenados congelados por períodos prolongados de tempo e ainda produzir resultados de alta qualidade no ensaio do cometa.

Protocolo

Os tecidos foram colhidos durante a realização de estudos realizados em instalações credenciadas pela AAALAC nos laboratórios de contratos da NTP, de acordo com as normas de Boa Prática laboratorial (21 CFR Parte 58) e protocolos de uso animal aprovados pelo Animal Institucional Comitê de Cuidado e Uso (IACUC) em cada laboratório.

1. Colheita e Processamento de Tecidos

NOTA: É útil preparar tubos de amostra duplicados (por exemplo, fígado) ou transferir aproximadamente metade de uma amostra para outro tubo de armazenamento (por exemplo, duodeno, estômago) para permitir a reanálise, se necessário. Para minimizar a potencial variabilidade amostral para tecidos do trato intestinal, recomenda-se que sejam tomados cuidados para a amostragem da mesma região do tecido em relação ao estômago para cada animal, e que uma amostra seja dividida para gerar amostras duplicadas. Fórceps de plástico são recomendados para a transferência de tecidos pegajosos, como o cérebro. Como opção, as preparações de tecido picado, raspada ou homogeneizada podem ser filtradas para obter suspensões unicelulares homogêneas usando um filtro de células de 40 μm ligado a um tubo cônico.

1. Remova qualquer tecido de conexão, órgãos e detritos ligados de órgãos de interesse. Imediatamente após a remoção, swish o órgão vigorosamente em um barco de pesagem de tamanho médio contendo ~7 mL de solução de picar recém-preparada a frio (Mg⁺⁺, Ca⁺⁺ e fenol solução de sal balanceado de Hank, 10% v/v DMSO, e 20 mM EDTA pH 7.5) para remover sangue residual e detritos.
2. Transfira cada órgão para outro barco de pesagem limpo contendo solução suficiente (~7 mL) de picar frio para manter o tecido submerso, no gelo, até o processamento posterior.
3. Remova uma seção de cada órgão de interesse e coloque-o em um de incorporação. Fixação em formalina tampão neutra 10% neutra, aparar e parafina embutida de acordo com os procedimentos padrão do laboratório para possível avaliação histopatológica futura.
4. Para o fígado, corte uma seção longitudinal de 5 mm do lobo esquerdo e deslize suavemente em ~7 mL de solução de picar frio. Coloque a tira de tecido em um barco de pesagem de tamanho médio limpo contendo ~7 mL de solução de picar frio e mantenha no gelo até que esteja pronto para processar ainda mais (passo 1.8 ou 1.11).
5. Para o duodeno, corte uma porção de 10 mm do duodeno proximal ao estômago. Usando uma agulha de 21-25 G, lave para remover detritos e bactérias.
   1. Insira a agulha em uma extremidade do duodeno e lave com 1 mL de solução de picar frio.
   2. Lave a outra direção virando o duodeno e repetindo com outra solução de 1 mL de picar. Descarte a agulha.
   3. Corte o duodeno abra e enxágue-o em ~7 mL de solução de picar antes de colocá-lo em um barco de pesagem de tamanho médio contendo ~7 mL de solução de picar limpo; manter no gelo até que esteja pronto para processar mais (etapa 1.8 ou 1.11).
6. Para o cérebro, pode ser útil dividir o cérebro em dois hemisférios; um hemisfério pode ser salvo para possível histopatologia (ver passo 1.2).
   1. Disseque as regiões cerebrais de interesse e deslize suavemente em ~7 mL de solução de picar frio.
   2. Transfira os tecidos para um barco de pesagem de tamanho médio limpo contendo ~7 mL de solução de picar frio e mantenha no gelo até que esteja pronto para processar ainda mais (etapa 1.8 ou 1.11; observe que pequenas regiões como o cerebelo e o hipocampo podem não precisar de qualquer corte adicional).
7. Para o estômago
   1. Remova e descarte o estômago. Abra o estômago glandular e lave-se livre de alimentos usando ~7 mL de tampão de picar frio em um barco de pesagem de tamanho médio.
   2. Remova uma tira de 5 mm de estômago glandular proximal ao duodeno para fixação para possível avaliação histopatológica (ver passo 1.2).
   3. Coloque o estômago restante em ~7 mL de tampão de picar frio em um barco de pesagem de tamanho médio e incubar no gelo por 15-30 min.
      NOTA: Esta etapa de incubação pode não ser necessária; esta etapa foi incluída no protocolo de validação do JaCVAM, mas não é mencionada na diretriz de teste da OCDE^8,9.
   4. Transfira o estômago para um pedaço limpo de parafina (ou placa de Petri ou barco de pesagem) e raspe suavemente o epitélio superficial duas ou mais vezes usando uma lâmina de bisturi ou um raspador de politetrafluoroetene (PTFE) para remover detritos. Pegue a mucosa gástrica com fórceps e enxágue com 1 mL de tampão de picar frio usando uma pipeta. Transfira o tecido estomacal para uma superfície ou prato limpo.
   5. Raspe cuidadosamente o epitélio estomacal 4-5 vezes (mais, se necessário) na solução de picar (tipicamente 250 μL/mouse ou 500-1.000 μL/rato) com a parte de trás de uma lâmina de bisturi ou raspador PTFE para liberar as células. Opcionalmente, enxágue o tecido com um volume aproximadamente igual de solução de picar para recuperar mais células. Coletar a solução de picar contendo células liberadas usando uma pipeta e transferir para um tubo de microcentrífuga no gelo.
8. Para a picar amostras de tecido, corte uma seção de 3-4 mm de tecido hepático ou cerebral ou ~5 mm de duodeno e transfira para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ou 2,0 mL rotulado contendo 1 mL de solução de picar frio. Picanha rápido (≤30 s) com tesouras picadas até dispersar finamente, mantendo a amostra fria. A amostra deve parecer ligeiramente nublada; no entanto, é comum que algumas peças permaneçam que se acomodem no fundo do tubo.
9. Para usar o tecido fresco, mantenha tubos contendo tecido picado ou células epiteliais raspadas no gelo; use o tecido para preparar lâminas de cometa dentro de aproximadamente 1h de colheita (delineado na seção 2).
10. Para congelar as amostras de tecido, imediatamente após a picada ou coleta de células epiteliais raspadas
    1. Fixar a tampa do tubo e soltar o tubo em um frasco de Dewar contendo nitrogênio líquido; os tubos podem ser mantidos em nitrogênio líquido durante a duração da necropsia (≤3 h).
    2. Recupere tubos usando uma concha e coloque em gelo seco para classificar. Transfira os tubos para uma caixa de congelador em gelo seco e guarde caixa em um congelador de -80 °C.
11. Para preparar cubos congelados de tecido, corte vários pequenos pedaços de tecido (≤4 mm de diâmetro e ~6 mm de comprimento; Figura 1).
    1. Individualmente, solte-os diretamente em um barco de pesagem de tamanho médio ou outro recipiente adequado contendo nitrogênio líquido.
    2. Aguarde alguns segundos para que as peças congelem completamente e transfiram cubos de tecido congelados individuais para um tubo de microcentrífuge rotulado ou criotubo mantido em gelo seco; não permita que as peças se agrupe durante o processo de congelamento.
    3. Transfira os tubos para uma caixa de congelador em gelo seco e guarde caixa em um congelador de -80 °C.

2. Preparação de slides

1. Para tecido picado/raspado
   1. Mantenha tubos contendo tecidos frescos em gelo molhado.
   2. Coloque os tubos de tecido congelado em um banho de água de temperatura ambiente até que as amostras sejam completamente descongeladas, garantindo que sejam mantidas frias. Transfira imediatamente os tubos para o gelo.
   3. Imediatamente antes de retirar as células para transferência para agarose (etapa 2.3), misture cada suspensão celular suavemente; para amostras não filtradas, permita que grandes pedaços se acomodem no fundo do tubo. Mantenha todos os tubos no gelo até que as lâminas tenham sido preparadas para todas as amostras.
2. Para tecido em cubos
   1. Recupere tubos contendo cubos de tecido do congelador de 80 °C e mantenha em gelo seco até a preparação do slide.
   2. Alíquota 1 mL do meio do Comerciante (0,14 M NaCl, 1,47 mM KH₂PO₄, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na₂HPO₄, 10 mM NaEDTA, pH 7.4) ou solução de picar em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL rotulado para cada amostra e manter no gelo.
   3. Trabalhando rapidamente para evitar o descongelamento do tecido, coloque um cubo de tecido na extremidade aberta de um dispositivo de picar tecido de temperatura ambiente(Figura 1). Podem ser utilizados múltiplos pedaços de tecido; se necessário, o tecido congelado pode ser cortado ou rachado em pedaços menores usando uma argamassa fria e pilão para reduzir o tamanho do cubo para caber no dispositivo.
   4. Insira rapidamente um êmbolo de seringa compatível com o tamanho no dispositivo para empurrar o tecido para a extremidade da malha, que deve então ser colocado no tubo de microcentrífuga que contém solução de picar frio; evite forçar o líquido a transbordar o tubo. Mergulhe a extremidade da malha do dispositivo por aproximadamente 5-10 s na solução de picar frio para permitir que o tecido descongele completamente.
   5. Deprima completamente o êmbolo até que as células sejam vistas extrovertendo através dos poros de malha. Em seguida, puxe o êmbolo para cima aproximadamente 2,5 cm e pressione para baixo novamente completamente; repetir o processo várias vezes até que a solução de picar se torne turva.
   6. Se necessário, a amostra pode ser concentrada para aumentar a densidade celular por centrifugação refrigerada por 5 min a 1100 rpm e remoção de uma parte do sobrenadante.
   7. Repita o processo para todas as amostras usando um dispositivo de picar tecido limpo para cada amostra.
3. Transfira 50 μL de suspensão celular para um tubo contendo 450 μL de 0,5% de ponto de fusão baixo aagarose a 37 °C.
   NOTA: Os volumes podem ser ajustados, mas a quantidade de agarose deve ser ≤1%.
4. Preparar e marcar slides como descrito anteriormente^10,11.

Resultados

Estudo 1
Fígado foi colhido de duas coortes de ratos machos de Sprague Dawley administrados óleo de milho por 4 dias, escalonados por uma semana. Slides foram preparados a partir de tecido recém-picado, tecido picado congelado e tecido em cubos congelados processados na solução média ou picada de Merchant usando o dispositivo de picar tecido. Os tecidos congelados obtidos de animais da primeira coorte foram avaliados após o armazenamento do congelador por ~3,5 meses. Os tecidos congelados obtid...

Discussão

Como demonstrado anteriormente^7,12,13, tecido picado congelado flash devidamente manuseado fornece bons resultados no ensaio do cometa. De fato, os valores de DNA da cauda % da linha de base para fígado de rato picado congelado e fígado de rato preparado em nosso laboratório são tipicamente ≤6%, conforme recomendado pela diretriz de teste da OCDE⁹ para amostras de fígado de rato recém-picado. Bons...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryovials	Corning Costar	430488
Dental Wax Sheets	Electron Microscopy Sciences	72670
Dissecting (Mincing) Micro Scissors	Fisher Scientific	08-953-1B
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14175-079
KCl	Teknova	P0315-10
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791
Low Melting Point Agarose	Lonza	50081
Microfuge Tubes (1.7 mL)	Corning	3207
Na2EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S7907
NaCl	Sigma-Aldrich	S6191
Neutral Buffered Formalin	Leica	600
Scalpel Blades	Miltex	4-110
Syringe Plunger (1 mL)	Fisher Scientific or Vitality Medical	14-826-88; 8881901014	Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe
Tissue Mincing Device	NorGenoTech (Oslo, Norway)	None	Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger.
Tweezers, plastic	Trade Winds Direct	DF8088N	Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com
Weigh Boats	Krackler Scientific/Heathrow Scientific	6290-14251B