Utilisation de tissus congelés dans l’analyse de la comète pour l’évaluation des dommages à l’ADN

Résumé

Ce protocole décrit plusieurs procédures pour la préparation d’échantillons de tissus congelés de haute qualité au moment de l’autopsie pour une utilisation dans l’essai de la comète pour évaluer les dommages à l’ADN : 1) tissu haché, 2) cellules épithéliales grattées du tractus gastro-intestinal, et 3) tissu en cubes d’échantillons, nécessitant l’homogénéisation à l’aide d’un dispositif de mincing tissulaire.

Résumé

L’essai de comète gagne en popularité comme moyen d’évaluer les dommages à l’ADN dans les cellules et les tissus cultivés, en particulier après l’exposition à des produits chimiques ou à d’autres facteurs de stress environnementaux. L’utilisation de l’analyse de la comète dans les essais réglementaires pour le potentiel génotoxique chez les rongeurs a été motivée par l’adoption d’une ligne directrice d’essai de l’Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) en 2014. Les diapositives d’analyse de comète sont généralement préparées à partir de tissus frais au moment de l’autopsie; cependant, la congélation d’échantillons de tissus peut éviter les problèmes logistiques associés à la préparation simultanée de diapositives à partir de plusieurs organes par animal et de nombreux animaux par étude. La congélation permet également d’expédier des échantillons de l’installation d’exposition à un autre laboratoire pour analyse, et le stockage des tissus congelés facilite le report d’une décision de générer des données sur les dommages à l’ADN pour un organe donné. L’essai de comète alcalin est utile pour détecter les ruptures d’ADN à double brin et à brin liés à l’exposition, les lésions alkali-labile, et les ruptures de brin associées à la réparation incomplète d’excision d’ADN. Cependant, les dommages à l’ADN peuvent également résulter de la tonte mécanique ou des procédures de traitement inadéquates de l’échantillon, confondant les résultats de l’essai. La reproductibilité dans la collecte et le traitement des échantillons de tissus pendant les nécropsies peut être difficile à contrôler en raison de la fluctuation du personnel de laboratoire avec des niveaux variables d’expérience dans la récolte des tissus pour l’essai de la comète. Il est coûteux d’améliorer la cohérence grâce à une formation de recyclage ou au déploiement d’unités mobiles dotées d’un personnel de laboratoire expérimenté et n’est pas toujours possible. Pour optimiser la génération constante d’échantillons de haute qualité pour l’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’essai de comète, une méthode pour homogénéiser des cubes de tissu congelés flash à l’aide d’un dispositif de mincing tissulaire personnalisé a été évaluée. Des échantillons préparés pour l’analyse de la comète par cette méthode ont comparé favorablement en qualité aux échantillons de tissus frais et congelés préparés en mâmant pendant l’autopsie. En outre, de faibles dommages à l’ADN de base ont été mesurés dans les cellules des cubes congelés de tissu après stockage prolongé.

Introduction

L’essai de comète est de plus en plus utilisé comme un moyen d’évaluer les dommages à l’ADN dans les cellules cultivées et les tissus exposés à des produits chimiques ou d’autres facteurs de stress environnementaux¹. L’essai peut détecter des ruptures d’ADN à deux brins et à un brin, des lésions alkali-labile, et des ruptures à brin unique associées à la réparation incomplète de l’ADN. Le Conseil international pour l’harmonisation des exigences techniques pour les produits pharmaceutiques à usage humain (ICH) recommande un analyse de rupture de brin d’ADN tel que l’analyse de la comète comme un deuxième test pour compléter l’essai de micronuclée érythrocyte rongeur pour évaluer la génototoxicité in vivo et comme un test de suivi pour évaluer le mode d’action dans les organes cibles de l’induction tumorale². L’Autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA) recommande l’analyse de la comète in vivo comme un test de suivi approprié pour étudier la pertinence d’un résultat positif dans un test de génototoxicité in vitro³. En 2014, une ligne directrice d’essai de l’OCDE a été approuvée pour l’essai de la comète rongeur, augmentant ainsi l’acceptabilité de l’essai pour l’utilisation dans les essais réglementaires du potentiel génotoxique. L’essai est basé sur la séparation électrophorétique des boucles d’ADN détendues et des fragments qui migrent des nucléoïdes des cellules lysed. Fondamentalement, les cellules simples sont incorporées dans l’agarose qui a été superposée sur des lames de microscope. Les diapositives sont ensuite immergées dans un tampon de lyse suivi d’une solution alcalin (pH et 13), qui permet à l’ADN nucléaire étroitement enroulé de se détendre et de se détendre. Les diapositives sont ensuite placées dans un champ électrique, ce qui stimule la migration de l’ADN chargé négativement vers l’anode, créant des images qui ressemblent à des comètes; la quantité relative d’ADN dans la queue de la comète par rapport à la tête de la comète est directement proportionnelle à la quantité de dommages à l’ADN; Le contenu de l’ADN dans la queue est généralement quantifié à l’aide d’un logiciel d’imagerie numérique.

Étant donné que l’analyse de la comète détecte l’ADN fragmenté, la quantification précise des dommages causés par l’ADN induit par l’exposition peut être confondue par la fragmentation de la chromatine associée à la nécrose ou à l’apoptose résultant d’une cytotoxicité ou d’un stress induit par le traitement. En outre, des dommages à l’ADN peuvent se produire à la suite d’une tonte mécanique ou d’un traitement inadéquat de l’échantillon⁴. L’importance de maintenir le tissu récolté réfrigéré avant la préparation de la diapositive pour minimiser le niveau de base des dommages à l’ADN a été démontrée précédemment^5,6. De nombreux laboratoires préparent des glissades d’essai de comètes à partir de tissus frais; cependant, cela peut être difficile sur le plan logistique lors de la préparation de diapositives de plusieurs types de tissus par animal dans une étude avec un grand nombre d’animaux. De plus, cela pose un problème lorsque la préparation et l’analyse des diapositives doivent se produire dans un laboratoire éloigné, ce qui nécessite l’expédition d’échantillons. Par exemple, le Programme national de toxicologie des États-Unis comprend l’analyse de la comète comme élément de son programme de tests toxicologiques génétiques (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) et intègre parfois l’essai dans des études de toxicité de 28 ou 90 jours de dose de répétition; cela nécessite la collecte de tissus par le laboratoire de la vie et le transfert d’échantillons à un autre laboratoire pour analyse. Pour ce faire, les morceaux de tissus sont hachés, et / ou les cellules épithéliales du tractus gastro-intestinal sont grattés et les suspensions cellulaires sont flash congelés et stockés dans un congélateur pour l’expédition ultérieure et le stockage par le laboratoire de réception jusqu’à l’analyse⁷. Une bonne manipulation des échantillons est cruciale pour obtenir des données de haute qualité à l’aide de tissus congelés; cependant, la manipulation reproductible des échantillons de tissus pendant les autopsies exécutées par le personnel en constante évolution est difficile à contrôler, particulièrement dans les laboratoires dans la vie qui ne récoltent pas systématiquement des tissus pour l’essai de comète. La formation de recyclage du personnel de autopsie ou l’utilisation d’une unité mobile composée de personnel de laboratoire expérimenté pour recueillir des échantillons de tissus frais ou congelés est souvent trop coûteuse, pas faisable, ou tout simplement sous-évaluée.

Pour mieux assurer une génération constante d’échantillons de tissus de haute qualité pour le transfert vers un site éloigné pour l’analyse des analyses d’analyses d’analyses d’analyses de comètes, l’utilité d’une méthode publiée⁶ de préservation des tissus à partir de cubes de tissu congelés flash a été explorée. Dans cette méthode, des cubes de tissu congelés sont chargés dans un dispositif de mâchage des tissus en acier inoxydable(figure 1) qui est placé dans un tube de microcentrifuge contenant un tampon froid. Le cube de tissu est ensuite poussé à travers un petit maillage de jauge à l’extrémité de l’appareil. Forcer à plusieurs reprises la suspension de tissu par le tamis de maille dans les deux directions résultats plusieurs fois dans une suspension relativement uniforme de cellule simple. Les échantillons préparés par cette méthode comparaient favorablement en qualité aux échantillons de tissus frais et congelés préparés par le mincing. Comme avantage supplémentaire, contrairement aux échantillons hachés, les cubes de tissu peuvent être stockés congelés pendant de longues périodes de temps et donnent encore des résultats de haute qualité dans l’essai de la comète.

Protocole

Les tissus ont été récoltés lors de la conduite d’études effectuées dans des installations accréditées par l’AAALAC dans les laboratoires contractuels du PNP conformément aux règlements sur les bonnes pratiques de laboratoire (21 CFR Partie 58) et aux protocoles d’utilisation des animaux approuvés par l’Animal institutionnel Comité de soins et d’utilisation (IACUC) dans chaque laboratoire.

1. Récolte et transformation des tissus

REMARQUE: Il est utile de préparer des tubes d’échantillon en double (p. ex., foie) ou de transférer environ la moitié d’un échantillon dans un autre tube de stockage (p. ex., du duodénum, estomac) pour permettre une réanalyse, si nécessaire. Afin de réduire au minimum la variabilité potentielle de l’échantillon à l’échantillon pour les tissus des voies intestinales, il est recommandé de prendre soin de goûter la même région de tissu par rapport à l’estomac pour chaque animal, et un échantillon soit divisé pour générer des échantillons en double. Des forceps en plastique sont recommandés pour le transfert de tissus collants tels que le cerveau. En option, les préparations de tissus hachées, grattées ou homogénéisées peuvent être filtrées pour obtenir des suspensions homogènes à cellule unique à l’aide d’une passoire cellulaire de 40 m fixée à un tube conique.

1. Retirez tout tissu, organe et débris raccordés attachés de l’organe.s) d’intérêt. Immédiatement après l’enlèvement, tamponner l’organe vigoureusement dans un bateau de poids de taille moyenne contenant 7 ml de solution froide de mouchoir fraîchement préparé^(Mg,^Ca et phénol rouge-libre Hank’s Balanced Salt Solution, 10% v /v DMSO, et 20 mM EDTA pH 7.5) pour enlever le sang résiduel et les débris.
2. Transférer chaque organe dans un autre bateau à poids propre contenant une solution de mincing froide suffisante (7 ml) pour maintenir le tissu immergé, sur la glace, jusqu’à nouvel examen.
3. Retirez une section de chaque organe d’intérêt et placez-la dans une cassette d’intégration. Fixer dans 10% neutre formaline tampon, garniture, et paraffine incorporé selon les procédures standard du laboratoire pour l’évaluation histopathologique future possible.
4. Pour le foie, couper une section longitudinale de 5 mm du lobe gauche et balayez doucement dans la solution de mincing froide de 7 ml. Placer la bande de tissu dans un bateau à poids moyen propre contenant 7 ml de solution de mincing froid et maintenir sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à traiter davantage (étape 1.8 ou 1.11).
5. Pour le duodénum, couper une portion de 10 mm du duodénum proximal à l’estomac. À l’aide d’une aiguille de 21 à 25 G, rincer pour enlever les débris et les bactéries.
   1. Insérer l’aiguille dans une extrémité du duodénum et rincer avec 1 ml de solution de mincing froid.
   2. Rincer l’autre direction en renversant le duodénum et en répétant avec une autre solution de 1 ml de mincing. Jetez l’aiguille.
   3. Trancher le duodénum ouvert et le rincer dans une solution de mincing de 7 ml avant de le mettre dans un bateau de poids de taille moyenne contenant 7 ml de solution de mincing propre; maintenir sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à traiter davantage (étape 1.8 ou 1.11).
6. Pour le cerveau, il peut être utile de diviser d’abord le cerveau en deux hémisphères; un hémisphère peut être sauvé pour une histopathologie possible (voir étape 1.2).
   1. Disséquer la région du cerveau (s) d’intérêt et doucement swish dans 7 ml de solution de mincing froid.
   2. Transférer les tissus(s) dans un bateau à poids moyen propre contenant 7 ml de solution de mincing froid et maintenir sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à traiter davantage (étape 1.8 ou 1.11; notez que les petites régions comme le cervelet et l’hippocampe peuvent ne pas nécessiter d’autre rognage).
7. Pour l’estomac
   1. Retirer et jeter le forestomach. Ouvrez l’estomac glandulaire et lavez-vous des aliments à l’aide d’un tampon de mâche froide de 7 ml dans un bateau de poids de taille moyenne.
   2. Retirez une bande de 5 mm de l’estomac glandulaire proximal au duodénum pour la fixation pour l’évaluation possible de l’histopathologie (voir étape 1.2).
   3. Placer le reste de l’estomac dans un tampon de mincing froid de 7 ml dans un bateau de poids de taille moyenne et incuber sur la glace pendant 15 à 30 minutes.
      REMARQUE: Cette étape d’incubation peut ne pas être nécessaire; cette étape a été incluse dans le protocole de validation jaCVAM, mais n’est pas mentionnée dans la directive de l’OCDE sur les tests^8,9.
   4. Transférer l’estomac à un morceau propre de paraffine (ou plat Petri ou peser le bateau) et gratter doucement l’épithélium de surface deux fois ou plus à l’aide d’une lame de scalpel ou d’un grattoir en polytetrafluoroethene (PTFE) pour enlever les débris. Ramassez la muqueuse gastrique avec des forceps et rincez avec 1 ml de tampon de mincing froid à l’aide d’un tuyauterie. Transférer le tissu gastrique sur une surface ou un plat propre.
   5. Gratter soigneusement l’épithélium de l’estomac 4 à 5 fois (plus, si nécessaire) dans la solution de mincing (généralement 250 L/souris ou 500-1,000 L /rat) avec le dos d’une lame de scalpel ou un grattoir PTFE pour libérer les cellules. Optionnellement, rincez le tissu avec un volume environ égal de solution de mincing pour récupérer plus de cellules. Recueillir la solution de mincing contenant des cellules libérées à l’aide d’un tuyauterie et transférer dans un tube de microcentrifuge sur la glace.
8. Pour les échantillons de tissus de 1,5 ou 2,4 mm, couper une section de 3 à 4 mm de tissu hépatique ou de tissu cérébral ou 5 mm de dudodenum et transférer à un tube de microcentrifuge étiqueté de 1,5 ou 2,0 ml contenant 1 ml de solution de mincing froid. Hacher rapidement (30 s) avec des ciseaux de hache jusqu’à ce qu’ils soient finement dispersés, tout en gardant l’échantillon froid. L’échantillon doit sembler légèrement nuageux; cependant, il est courant que certaines pièces restent qui se déposeront au fond du tube.
9. Pour utiliser le tissu frais, maintenir les tubes contenant du tissu haché ou des cellules épithéliales grattées sur la glace; utiliser le tissu pour préparer les glissements de comètes à moins d’environ 1 h de la récolte (décrite à la section 2).
10. Pour la congélation des échantillons de tissus, immédiatement après le mincing ou la collecte de cellules épithéliales grattées
    1. Fixer le couvercle du tube et déposer le tube dans un flacon Dewar contenant de l’azote liquide; les tubes peuvent être maintenus dans l’azote liquide pendant la durée de l’autopsie (3 h).
    2. Récupérez les tubes à l’aide d’une louche et placez-les sur de la glace sèche pour les trier. Transférer les tubes dans une boîte de congélation sur de la glace sèche et entreposer la boîte dans un congélateur à -80 oC.
11. Pour la préparation de cubes de tissu congelés, couper plusieurs petits morceaux de tissu (4 mm de diamètre et 6 mm de longueur; Figure 1).
    1. Déposez-les directement dans un bateau de poids de taille moyenne ou tout autre navire approprié contenant de l’azote liquide.
    2. Attendez quelques secondes que les morceaux congelent complètement et transfèrent des cubes de tissus congelés individuels dans un tube de microcentrifuge étiqueté ou un cryotube maintenu sur de la glace sèche; ne laissez pas les morceaux s’agglutiner pendant le processus de congélation.
    3. Transférer les tubes dans une boîte de congélation sur de la glace sèche et entreposer la boîte dans un congélateur à -80 oC.

2. Préparation de la diapositive

1. Pour les tissus hachés/grattés
   1. Maintenir les tubes contenant des tissus frais sur la glace humide.
   2. Placez les tubes de tissu congelé dans un bain d’eau à température ambiante jusqu’à ce que les échantillons soient complètement décongelés, tout en s’assurant qu’ils sont gardés froids. Transférer immédiatement les tubes sur la glace.
   3. Immédiatement avant de retirer les cellules pour le transfert à l’agarose (étape 2.3), mélanger délicatement chaque suspension cellulaire; pour les échantillons non filtrés, laissez les gros morceaux se déposer au fond du tube. Maintenir tous les tubes sur la glace jusqu’à ce que des toboggans aient été préparés pour tous les échantillons.
2. Pour le tissu en cubes
   1. Récupérez les tubes contenant des cubes de tissus du congélateur de 80 oC et maintenez-le sur la glace sèche jusqu’à la préparation de la glissière.
   2. Aliquot 1 mL de Medium Merchant (0,14 M NaCl, 1,47 mM KH₂PO₄, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na₂HPO₄, 10 mM NaEDTA, pH 7,4) ou solution de mincing dans un tube de microcentruge étiqueté de 1,7 mL pour chaque échantillon et maintenir la glace.
   3. Travailler rapidement pour éviter le dégel des tissus, placer un cube de tissu dans l’extrémité ouverte d’un dispositif de mincing de tissu de température ambiante(figure 1). Plusieurs morceaux de tissu peuvent être utilisés; si nécessaire, le tissu congelé peut être coupé ou fissuré en petits morceaux à l’aide d’un mortier froid et d’un pilon pour réduire la taille du cube pour s’insérer dans l’appareil.
   4. Insérez rapidement un piston de seringue assorti à la taille dans l’appareil pour pousser le tissu à l’extrémité de maille qui devrait alors être placée dans le tube de microcentrifuge contenant la solution de mincing froid ; éviter de forcer le liquide à déborder le tube. Immerger l’extrémité de maille de l’appareil pour environ 5-10 s dans la solution de mincing froid pour permettre au tissu de décongeler complètement.
   5. Déprimez complètement le piston jusqu’à ce que les cellules soient vues extrudant à travers les pores de maille. Tirez ensuite le piston vers le haut d’environ 2,5 cm et appuyez à nouveau complètement; répéter le processus plusieurs fois jusqu’à ce que la solution de mincing devienne turbide.
   6. Si nécessaire, l’échantillon peut être concentré pour augmenter la densité cellulaire par centrifugation réfrigérée pendant 5 min à 1100 tr/min et l’ablation d’une partie du supernatant.
   7. Répétez le processus pour tous les échantillons à l’aide d’un dispositif de mincing tissulaire propre pour chaque échantillon.
3. Transférer 50 l de suspension cellulaire dans un tube contenant 450 L de 0,5 % de point de fusion bas à 37 oC.
   REMARQUE: Les volumes peuvent être ajustés, mais la quantité d’agarose doit être de 1 %.
4. Préparer et marquer des diapositives comme décrit précédemment^10,11.

Résultats

Étude 1
Le foie a été récolté à partir de deux cohortes de rats mâles Sprague Dawley administré de l’huile de maïs pendant 4 jours, décalé par une semaine. Des diapositives ont été préparées à partir de tissus fraîchement hachés, de tissus hachés congelés et de tissus en cubes congelés traités dans la solution moyenne ou de mincing de Merchant à l’aide du dispositif de mincing tissulaire. Les tissus congelés obtenus auprès d’animaux de la première cohorte ont été éva...

Discussion

Comme démontré précédemment^7,12,13, correctement manipulé flash congelé tissu haché fournit de bons résultats dans l’essai de la comète. En fait, les valeurs d’ADN de queue de base pour les rats hachés congelés et le foie de souris préparés dans notre laboratoire sont généralement de 6 %, comme le recommande la ligne directrice^de l’OCDE pour les échantillons de foie de rat fraîcheme...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryovials	Corning Costar	430488
Dental Wax Sheets	Electron Microscopy Sciences	72670
Dissecting (Mincing) Micro Scissors	Fisher Scientific	08-953-1B
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14175-079
KCl	Teknova	P0315-10
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791
Low Melting Point Agarose	Lonza	50081
Microfuge Tubes (1.7 mL )	Corning	3207
Na2EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S7907
NaCl	Sigma-Aldrich	S6191
Neutral Buffered Formalin	Leica	600
Scalpel Blades	Miltex	4-110
Syringe Plunger (1 mL )	Fisher Scientific or Vitality Medical	14-826-88; 8881901014	Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe
Tissue Mincing Device	NorGenoTech (Oslo, Norway)	None	Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger.
Tweezers, plastic	Trade Winds Direct	DF8088N	Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com
Weigh Boats	Krackler Scientific/Heathrow Scientific	6290-14251B